黃芩苷改善呼吸道合胞病毒肺炎幼鼠肺損傷的作用機制

張靜，李靜，侯紅麗，朱宏瑞

作者單位：1開封市兒童醫(yī)院，a中醫(yī)科，b感染科，河南 開封 475000；

2鄭州兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院新生兒科，河南 鄭州450053

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是常見導(dǎo)致下呼吸道感染的單鏈RNA 病毒之一，會導(dǎo)致病人出現(xiàn)咳嗽、哮喘和呼吸困難等癥狀，嚴重危害病人生理健康［1］。RSV 肺炎常見于嬰幼兒或老年人等免疫力低下的人群，可通過空氣飛沫和密切接觸傳播［2］。高危人群可在流行季節(jié)使用RSV免疫球蛋白進行預(yù)防，臨床治療中常使用利巴韋林、干擾素等藥物進行治療，但因耐藥性強與毒副作用大面臨著治療困難，亟需尋找安全有效的替代藥物［3］。近年來隨著對RSV肺炎病程發(fā)展的深入研究，一些傳統(tǒng)中醫(yī)藥在臨床治療中取得良好效用。黃芩苷是提取自唇科植物黃芩干燥根的主要活性成分，具有清熱潤肺、瀉火解毒和止血安胎等多種藥效，常用于治療濕溫暑熱、胸悶惡心和肺熱咳嗽等病癥［4-5］。研究報道，黃芩苷可以有效治療肺炎，但其作用機制尚不明確［6］。因此，本研究2022 年3月至2023 年7 月建立RSV 肺炎幼鼠模型，探討黃芩苷對RSV 肺炎幼鼠肺損傷的修復(fù)作用及其可能作用機制，為黃芩苷藥物開發(fā)及RSV 肺炎的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 55 只4 周齡SPF 級雄性SD 大鼠購自杭州子源實驗動物科技有限公司，體質(zhì)量60～70 g，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（浙）2019-0004。所有大鼠于相同飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，提供標準飼料和清潔水源，定期更換墊料，保持良好通風(fēng)。環(huán)境條件設(shè)置為：溫度20～24 ℃，濕度（50±10）%。研究過程中對動物的處置符合動物委員會的準則。

1.1.2藥品、主要試劑和儀器 黃芩苷（純度：HPLC≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，貨號A0016）；RSV-long 病毒株（中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所，半數(shù)組織培養(yǎng)感染量TCID50為10-3）；兔抗β-actin 多克隆抗體、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（p-p38MAPK）多克隆抗體、山羊抗兔二抗IgG（北京索萊寶科技有限公司）。BIOFUGE28RS型低溫高速離心機（德國HERAEUS 公司）；7500 型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1模型建立與分組給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，選取45 只幼鼠采用鼻腔接種RSV 病毒株法建立RSV 肺炎模型［7］。將幼鼠使用乙醚進行輕度麻醉，左右鼻腔交替滴入RSV 病毒液50 μL 建立模型，另選取10只幼鼠作為對照組，對照組滴入等量生理鹽水，每日接種1 次，連續(xù)3 d。大鼠出現(xiàn)行動遲緩、呼吸急促且體溫升高，隨機抽取5 只大鼠制作肺部組織病理切片，觀察肺部病理變化，出現(xiàn)肺泡病變、各支氣管上皮炎癥細胞浸潤，肺泡間隔變大等現(xiàn)象視為造模成功。造模成功幼鼠隨機分為模型組、黃芩苷低、中和高劑量組，各10 只，另設(shè)對照組（10 只）。參照文獻［8-9］，黃芩苷低、中和高劑量組大鼠分別灌胃25、50和100 mg/kg黃芩苷，1次/天，連續(xù)7 d。

1.2.2標本采集 給藥結(jié)束1 d 后，稱取各組幼鼠體質(zhì)量，麻醉，固定于手術(shù)臺上，結(jié)扎右側(cè)肺葉，注入1 mL PBS 溶液并來回抽吸灌洗支氣管肺泡，注入5次后回收肺泡灌洗液，離心取上清液，-20 ℃保存。摘眼球采集血液，離心，分離血清，-20 ℃保存。處死大鼠，快速取出肺組織，稱重，將左肺分成兩部分，一部分浸入4%多聚甲醛液固定，用于HE 染色，一部分用于稱取濕干重量。右肺置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3肺指數(shù)與肺組織濕/干比測定 計算各組幼鼠肺指數(shù)，肺指數(shù)=（肺質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%。將未用4%多聚甲醛固定的左肺組織在80℃恒溫烤箱烘烤至恒重，記為干重，計算肺組織濕/干比（W/D）。肺組織W/D=肺組織濕重/肺組織干重。

1.2.4炎癥因子水平檢測 采用雙抗體夾心法檢測肺泡灌洗液腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，酶標測定儀于450 nm 波長處檢測各孔吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.2.5T 細胞亞群檢測 取出幼鼠外周血，加入單克隆抗體CD3+、CD4+和CD8+各5 μL，混勻后室溫下靜置30 min，加入紅細胞裂解液300 μL，反應(yīng)30 min充分裂解，使用流式細胞分析儀檢測各組幼鼠外周血中T細胞亞群的變化。

1.2.6肺組織HE 染色觀察 取出固定后的左側(cè)肺組織，脫水、包埋、切片，進行HE 染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，隨機選取3 個清晰視野拍照。

1.2.7RT-PCR 檢測mRNA 表達 取-80 ℃保存的右肺組織100 mg 盡量剪碎放入EP 管中，加入1 mL TRIZOL 試劑提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，配制PCR 反應(yīng)體系20 μL：TB GreenPremix Ex TapⅡ（2×） 10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase free ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 35 s 循環(huán)40 次。引物設(shè)計為p38MAPK：正向-5′ ATGCCGAAGATGAACTTTGC 3′、反向-5′ CCCTGCTTTCAAAGGACTGA 3′；β-actin：正向-5′ GGCTGTATTCCCCTCCATCG 3′、反向-5′ CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 3′。采用2-ΔΔCt法以目的基因相對內(nèi)參表達量進行比較分析。

1.2.8蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達 取剩余-80 ℃保存的右肺組織加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 細胞裂解液，冰上裂解30 min，勻漿提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取40 μL 蛋白樣品進行電泳，濕轉(zhuǎn)，5%脫脂牛奶封閉，加入1∶1 000 相應(yīng)稀釋一抗，4 ℃下?lián)u床封閉，洗膜，再加入1∶3 000 相應(yīng)稀釋二抗，室溫搖床封閉60 min，洗膜。加入ECL顯影液進行曝光，保存圖像，以β-actin 為內(nèi)參，觀察條帶上相應(yīng)的蛋白表達量并對目的條帶光密度值進行計算分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，LSD-t檢驗進行兩組間比較。校驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和肺指數(shù)比較與對照組比較，模型組幼鼠體質(zhì)量降低，肺指數(shù)升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠體質(zhì)量升高，肺指數(shù)降低，且各指標具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠體質(zhì)量和肺指數(shù)比較/± s

表1 各組幼鼠體質(zhì)量和肺指數(shù)比較/± s

注：①與對照組比，P＜0.05。②與模型組比，P＜0.05。③與黃芩苷低劑量組比，P＜0.05。④與黃芩苷中劑量組比，P＜0.05。

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2.2 肺組織W/D 比較與對照組比較，模型組幼鼠肺組織W/D（7.82±0.37）顯著高于對照組（3.74±0.37），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠肺組織W/D（6.13±0.40、5.62±0.41、4.03±0.30）均顯著低于模型組（7.82±0.37），且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

2.3 炎癥因子水平比較與對照組比較，模型組幼鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平降低，且各指標具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠炎癥因子水平比較/（ng/L，± s）

表2 各組幼鼠炎癥因子水平比較/（ng/L，± s）

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細胞介素-1β，IL-6為白細胞介素-6。①與對照組比，P＜0.05。②與模型組比，P＜0.05。③與黃芩苷低劑量組比，P＜0.05。④與黃芩苷中劑量組比，P＜0.05。

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2.4 T 淋巴細胞亞群水平比較與對照組比較，模型組幼鼠外周血中CD3+水平降低，CD4+和CD4+/CD8+水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠CD3+水平升高，CD4+和CD4+/CD8+水平降低，且各指標具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表3。

表3 各組幼鼠T淋巴細胞亞群水平比較/± s

表3 各組幼鼠T淋巴細胞亞群水平比較/± s

注：①與對照組比，P＜0.05。②與模型組比，P＜0.05。③與黃芩苷低劑量組比，P＜0.05。④與黃芩苷中劑量組比，P＜0.05。

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2.5 肺組織HE 染色比較結(jié)果顯示，對照組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，未見炎癥細胞浸潤、水腫等現(xiàn)象。模型組幼鼠肺泡間隔明顯增寬，肺泡壁明顯增厚，部分肺泡可見出血、間質(zhì)水腫現(xiàn)象，存在大量炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠肺組織結(jié)構(gòu)受損現(xiàn)象得到改善。見圖1。

圖1 各組幼鼠肺組織病理學(xué)變化（HE染色×200)：A為對照組；B為模型組；C為黃芩苷低劑量組；D為黃芩苷中劑量組；E為黃芩苷高劑量組

2.6 p38MAPK mRNA 水平比較模型組幼鼠肺組織p38MAPK mRNA 表達水平（1.28±0.11）顯著高于對照組（0.32±0.03）（P＜0.05）。黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠肺組織p38MAPK mRNA 表達水平（0.97±0.10、0.73±0.06、0.55±0.04）顯著低于模型組（1.28±0.11），且呈劑量依賴性（P＜0.05）。

2.7 p38MAPK 蛋白水平比較與對照組比較，模型組幼鼠肺組織p-p38MAPK蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與模型組比，黃芩苷低、中和高劑量組幼鼠肺組織p-p38MAPK 蛋白表達水平降低，且各指標具有劑量依賴性（P＜0.05）。見表4；圖2。

圖2 幼鼠肺組織p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）蛋白檢測

表4 各組幼鼠p38MAPK蛋白水平比較/± s

表4 各組幼鼠p38MAPK蛋白水平比較/± s

注：p38MAPK 為p38 絲裂原活化蛋白激酶，p-p38MAPK 為磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶。①與對照組比，P＜0.05。②與模型組比，P＜0.05。③與黃芩苷低劑量組比，P＜0.05。④與黃芩苷中劑量組比，P＜0.05。

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3 討論

RSV 致病機制復(fù)雜，主要與病原體毒作用、固有免疫和適應(yīng)性免疫等綜合作用相關(guān)［10］。RSV 感染后，通過誘發(fā)肺組織炎癥導(dǎo)致肺組織Th1/Th2 失衡，破壞免疫系統(tǒng)。此時肺組織的炎癥反應(yīng)失控，導(dǎo)致肺組織受損，促使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進入支氣管與肺泡內(nèi)，誘發(fā)肺水腫，降低肺功能，嚴重時可引發(fā)呼吸衰竭［11］。炎癥在中醫(yī)上屬“熱”，外邪入體引發(fā)內(nèi)熱，常見紅腫、熱痛等癥狀，中醫(yī)學(xué)中未見“肺炎”病名，屬“肺熱病”范圍。病位在于肺部，病因為風(fēng)溫外侵，病理為痰、熱、淤、毒阻塞于肺，導(dǎo)致肺功能失常。中藥在治療炎癥時多以清熱解毒和行氣活血為主［12］。黃芩首次記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為唇形科植物黃芩的干燥根，含有多種活性物質(zhì)［13］。黃芩苷作為其主要藥效物質(zhì)，多項研究表明，黃芩苷可以調(diào)節(jié)機體免疫力和抗炎等功效［14］。本研究探討黃芩苷對RSV 肺炎幼鼠肺臟損傷的修復(fù)作用。

在本研究結(jié)果顯示，模型組幼鼠體質(zhì)量明顯降低，而肺指數(shù)和肺組織W/D 均顯著升高。檢測炎癥因子水平也發(fā)現(xiàn)，模型組幼鼠炎癥因子水平（TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平）均升高。肺指數(shù)與肺組織W/D 比值是判斷肺功能的主要指標，當肺組織受到病毒感染，由于異常升高的炎癥反應(yīng)致使肺組織水腫，因而肺質(zhì)量明顯升高。提示RSV 肺炎模型建立成功且模型組幼鼠肺組織受到嚴重損傷，幼鼠體內(nèi)伴有嚴重的炎癥反應(yīng)。在給予了不同劑量黃芩苷治療后各組幼鼠均表現(xiàn)肺指數(shù)、肺組織W/D 和炎癥因子水平均呈下降趨勢，幼鼠體質(zhì)量隨之恢復(fù)正常，且表現(xiàn)出濃度依賴性，以黃芩苷高劑量組效果最佳。提示幼鼠肺組織損傷在黃芩苷的治療下得到修復(fù)，體內(nèi)的炎癥反應(yīng)也明顯減輕。此外，黃芩苷治療后幼鼠肺組織病理損傷程度減輕，進一步證實黃芩苷對RSV肺炎幼鼠肺組織損傷的修復(fù)作用。

炎癥反應(yīng)是影響肺炎病情進展的重要機制之一，而外周血T 淋巴細胞亞群作為機體免疫的重要檢測指標，可直觀反映機體免疫情況［15］。在肺炎進程中，MAPK 家族信號通路一直發(fā)揮著重要作用，是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶類信號通路，在一定量的炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)等刺激條件下會激活，p38MAPK 是主要參與并控制這炎癥反應(yīng)的典型通路之一［16］。在本研究中，模型組幼鼠肺組織p38MAPK 基因水平與p-p38MAPK 蛋白水平均高度表達，結(jié)合幼鼠外周血中CD3+水平降低，CD4+和CD4+/CD8+比值升高。提示模型組幼鼠在RSV 的感染刺激下，體內(nèi)p38MAPK 信號通路被激活，炎癥細胞合成并釋放出大量的炎癥因子，促使炎癥因子高度表達，免疫系統(tǒng)平衡失調(diào)。CD3+T 淋巴細胞是成熟T 細胞的表面標志，通過適當多種細胞因子輔助B 細胞和效應(yīng)T 細胞活化，促進細胞免疫，從而調(diào)節(jié)免疫功能［17］。CD4+/CD8+比值的相對平衡對未知機體免疫穩(wěn)定起著重要作用，是反映機體免疫功能的重要標志之一。在本研究中，黃芩苷各劑量組幼鼠肺組織中p38MAPK 基因水平與p-p38MAPK 蛋白表達水平均明顯降低，且外周血中CD3+水平升高，CD4+和CD4+/CD8+比值降低。提示黃芩苷通過影響p38MAPK 表達，降低炎癥因子水平，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群比例，改善免疫細胞失衡，控制與延緩RSV肺炎的發(fā)展過程，對RSV 肺炎幼鼠肺損傷有積極影響。

綜上所述，黃芩苷能夠降低RSV 肺炎幼鼠炎癥因子水平，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群比例，減輕肺損傷，可能是通過影響p38MAPK信號通路發(fā)揮作用，為臨床治療RSV肺炎提供實驗依據(jù)。