半夏瀉心湯對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎影響及作用機(jī)制

汪敏，黃亞威，黃然

作者單位：江蘇省中醫(yī)院、南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京210029

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease， IBD）是一種全球性的特發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）［1］。UC 的發(fā)病通常從結(jié)腸遠(yuǎn)端發(fā)展到整個(gè)結(jié)腸，嚴(yán)重者甚至可擴(kuò)散至回腸末端，引起腹瀉、腹痛和便血［2］。 盡管UC 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但是專家普遍認(rèn)為氧化還原系統(tǒng)紊亂是UC 發(fā)生發(fā)展的重要因素［3］。細(xì)胞氧化應(yīng)激存在于炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中，并對(duì)炎癥環(huán)境產(chǎn)生重要影響［4］。核轉(zhuǎn)錄因子 E2 相關(guān)因子（nuclear factor erythroid 2 Related factor，Nrf2）是一種與細(xì)胞動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子［5］，與含有抗氧化反應(yīng)元件（ARE）序列的基因結(jié)合，調(diào)控下游多種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，包括血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化還原酶-1（NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1）［6］。相關(guān)研究利用Nrf2激活劑有效改善了DSS誘導(dǎo)的急性和慢性結(jié)腸炎，對(duì)結(jié)腸炎治療的研究有啟發(fā)作用［7-8］。調(diào)控Nrf2/HO-1 信號(hào)通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、抗炎作用可有效治療UC。

半夏瀉心湯（Banxia Xiexindecoction， BXD）出自張仲景的《傷寒雜病論》，由半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、炙甘草、大棗配伍組成，具有辛開苦降、寒溫并用的特點(diǎn)，廣泛用于治療胃腸道疾病，臨床效果較好。半夏瀉心湯治療UC 可明顯減輕病人痛苦、加速癥狀消失、降低復(fù)發(fā)率［9-10］。藥理研究表明，半夏瀉心湯對(duì)腸道具有保護(hù)作用，與NLRP3/Caspase-1 細(xì)胞焦亡通路［11］、TLRs/NF-κB 通路［12］、腸道菌群［13］等有關(guān)。半夏瀉心湯是否作用于Nrf2/HO-1通路緩解UC，尚未見報(bào)道。本研究于2023 年1—5月采用小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt， DSS）建立UC 模型，明確半夏瀉心湯對(duì)UC 小鼠Nrf2/HO-1 通路的影響，為半夏瀉心湯緩解UC的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、炙甘草、大棗等飲片均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院中藥房，并由黃亞威副主任中藥師鑒定均為真品。有毒藥物半夏以最大劑量9 g為基準(zhǔn)，成人每日的用量為半夏9 g、黃芩10.8 g、干姜10.8 g、人參10.8 g、黃連3.6 g、炙甘草10.8 g、大棗7.2 g。依據(jù)臨床用藥劑量，根據(jù)體表面積法計(jì)算得出小鼠給藥量為8.19 g/kg。上述飲片煮沸濃縮后配成含生藥0.4、0.8、1.6 g/mL 藥液，保存于4 ℃冰箱，備用。葡聚糖硫酸鈉（DSS，批號(hào)S3045）購(gòu)自美國(guó)MP 公司；美沙拉嗪（批號(hào)SS0905CA24）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

活性氧自由基（reactive oxide species， ROS）測(cè)試盒（批號(hào)20210906）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)試盒（批號(hào)20211104）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè) 試 盒（ 批 號(hào)20211013）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）測(cè)試盒（批號(hào)20211208）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所； HE 染色試劑盒（批號(hào)C0215）、RIPA 組織裂解液（批號(hào)P1254）、ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)P3258）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)P0147）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗Nrf2 （批號(hào)ab43005）、HO-1 （批號(hào)ab44125）和NQO-1（批號(hào)ab46732）、β-actin（批號(hào)ab45348）均購(gòu)自Abcam 公司；TRIzol RNA 提取試劑（批號(hào)50175111）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RT-qPCR 試劑盒（批號(hào)B31205-127）購(gòu)自美國(guó)Bimake公司。

1.2 儀器顯微鏡 （IX71，日本 Olympus 公司）；組織包埋機(jī)（Arcadia，德國(guó)Leica 公司）；全自動(dòng)生化分析儀（AU-5800，美國(guó)Beckman Coulter 公司）；酶標(biāo)儀（SpectraMax 190，美國(guó) MD 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（QuantStudio 3，美國(guó)ABI 公司）；凝膠電泳系統(tǒng)（1658033，美國(guó)Bio-Rad 公司）；凝膠成像儀（GelDoc Go，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 動(dòng)物C57BL/6J雄性小鼠（20±2）g購(gòu)自南通大學(xué)，合格證號(hào)為SCXK（蘇）2019-0001，SPF 級(jí)，溫度25 ℃，相對(duì)濕度45%，自由攝食飲水。

1.4 造模與給藥60 只C57BL/6J 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組：空白組、模型組、美沙拉嗪組（100 mg/kg）、半夏瀉心湯低劑量組（8.19 g/kg）、中劑量組（16.38 g/kg）、高劑量組（32.76 g/kg），每組10 只。除空白組外，其他各組小鼠自由飲用3% DSS 連續(xù)7 d 構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎模型，各給藥組造模同時(shí)灌胃相應(yīng)藥物治療，每天1 次，連續(xù)10 d。末次給藥后，禁食不禁水24 h 后，摘眼球取血，3 000 r/min 離心20 min，分離獲得血清，置于-20 ℃冰箱備用。然后，脫頸椎處死小鼠，取結(jié)腸組織，一部分用于病理切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱備用。

1.5 疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估根據(jù)小鼠體質(zhì)量、大便性狀和便血情況，計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)性指數(shù)（disease activity index，DAI），DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 小鼠疾病活動(dòng)性指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 結(jié)腸組織HE 染色結(jié)腸組織用10%福爾馬林固定24 h，依次經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切成5 μm厚度薄片后進(jìn)行HE染色，采用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。

1.7 ELISA 法測(cè)炎癥因子和氧化指標(biāo)摘眼球取血后離心得血清，參照ELISA 試劑盒說明書，測(cè)定ROS、MDA、SOD、GSH-px水平。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表達(dá)提取結(jié)腸組織蛋白后，采用BCA 法檢測(cè)其濃度。取50 μg 蛋白，按1∶4 比例與loadding buffer 混合均勻，煮沸10 min 變性后上樣至12% SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜，抗原封閉。分別與一抗NRF2 （1∶1 000）、HO-1 （1∶1 000）、NQO-1 （1∶1 000） 4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min×3 次。與二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3 次，加入ECL 顯影液， 采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并定量分析蛋白條帶相對(duì)灰度值。

1.9 RT-PCR 法檢測(cè)Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達(dá)取小鼠結(jié)腸組織，提取RNA 后采用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度。按照one-step reverse transcription PCR kit 實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行擴(kuò)增后檢測(cè)NRF2、HO-1 和 NQO-1 mRNA表達(dá)，引物序列見表2。

表2 小鼠結(jié)腸組織RNA引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），總體有差異進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度改變情況與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量在第5、6、7、8、9、10、11 天顯著減輕（P=0.042、0.037、0.028、0.044、0.036、0.032、0.029）；與模型組比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，其中半夏瀉心湯高劑量組在第6、7、8、9、10、11 天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033、0.025、0.034、0.041、0.035、0.027），半夏瀉心湯中劑量組、低劑量組在第8、9、10、11 天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044、0.047、0.035、0.029）?？瞻捉M、模型組、美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高、中、低劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度分別為（12.53±0.94）、（5.63±0.45）、（10.07±0.98）、（8.97±1.20）、（8.03±0.69）、（7.53±0.69）cm。與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P=0.003）；與模型組相比，半夏瀉心湯低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯延長(zhǎng)（P=0.047、0.035、0.025），見圖1。

圖1 小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長(zhǎng)度改變：A為小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間變化情況；B為小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較

2.2 小鼠病理學(xué)觀察與疾病活動(dòng)指數(shù)由HE染色結(jié)果可知，空白組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞排列緊密，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組結(jié)腸黏膜組織、隱窩結(jié)構(gòu)被破壞，杯狀細(xì)胞大量消失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基底漿細(xì)胞增加；美沙拉嗪組小鼠結(jié)腸組織稍有受損，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；半夏瀉心湯高劑量組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，僅有局部組織受損，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；半夏瀉心湯中劑量組小鼠有部分完整的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)；半夏瀉心湯低劑量組小鼠結(jié)腸組織局部損傷比較嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高。以上結(jié)果說明半夏瀉心湯可改善UC 小鼠病理?yè)p傷，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。與空白組比較，模型組病理組織學(xué)評(píng)分顯著提高（P=0.003）。與模型組比較，各給藥組可降低病理組織學(xué)評(píng)分，其中美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.027、0.023）。與空白組比較，模型組疾病活動(dòng)指數(shù)明顯增加（P=0.004）。與模型組比較，各給藥組疾病活動(dòng)指數(shù)均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，其中美沙拉嗪組、半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003、0.027、0.040），見圖2；表3。

圖2 小鼠結(jié)腸黏膜組織（HE×200）：A為空白組；B為模型組；C為美沙拉嗪組；D為半夏瀉心湯高劑量組；E為半夏瀉心湯中劑量組；F為半夏瀉心湯低劑量組

表3 小鼠結(jié)腸黏膜組織病理組織學(xué)評(píng)分和疾病活動(dòng)指數(shù)/± s

表3 小鼠結(jié)腸黏膜組織病理組織學(xué)評(píng)分和疾病活動(dòng)指數(shù)/± s

注：①與空白組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.3 半夏瀉心湯對(duì)UC 小鼠血清中ROS、MDA、SOD 和GSH-px 的影響與空白組比較，模型組小鼠血清中ROS 和MDA 水平顯著升高（P=0.016、0.010），SOD 和GSH-px 活性顯著降低（P=0.001）。半夏瀉心湯高、中劑量組ROS 水平顯著低于模型組（P=0.016、0.012）；與模型組比較，半夏瀉心湯高、中劑量組MDA 水平顯著降低（P=0.011、0.048）；半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組的SOD 含量與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.049）；半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組、低劑量組的GSH-px 活性與模型組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003、0.003、0.021）。見表4。

表4 半夏瀉心湯改善UC小鼠的氧化應(yīng)激/± s

注：UC為潰瘍性結(jié)腸炎，ROS為活性氧自由基，MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，GSH-px為谷胱甘肽過氧化物酶。①與空白組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.4 半夏瀉心湯對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表達(dá)顯著降低（P=0.010、0.016、0.004）；與模型組相比，半夏瀉心湯高、中劑量組明顯增加Nrf2 蛋白表達(dá)（均P=0.004）；半夏瀉心湯高、中劑量組HO-1 蛋白表達(dá)明顯高于模型組（均P=0.011）；與模型組相比，半夏瀉心湯高、中劑量組能夠顯著提高NQO-1 蛋白表達(dá)（P=0.002、0.012），見圖3；表5。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達(dá)

表5 半夏瀉心湯對(duì)UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達(dá)的影響/± s

表5 半夏瀉心湯對(duì)UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表達(dá)的影響/± s

注：UC 為潰瘍性結(jié)腸炎，Nrf2 為核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子，HO-1為血紅素加氧酶-1，NQO-1為醌氧化還原酶-1。①與空白組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.5 半夏瀉心湯對(duì)UC 小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA 表達(dá)的影響與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達(dá)明顯降低（P=0.015、0.026、0.033）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠Nrf2 表達(dá)升高，其中半夏瀉心湯高劑量組與模型組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠HO-1 表達(dá)升高，其中半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023、0.047）；與模型組相比，半夏瀉心湯各給藥組小鼠NQO-1 表達(dá)升高，其中半夏瀉心湯高劑量組、中劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017、0.021），見表6。

表6 半夏瀉心湯對(duì)UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達(dá)的影響/± s

表6 半夏瀉心湯對(duì)UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表達(dá)的影響/± s

注：UC 為潰瘍性結(jié)腸炎，Nrf2 為核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子，HO-1為血紅素加氧酶-1，NQO-1為醌氧化還原酶-1。①與空白組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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3 討論

目前，UC 是一種全球性疾病，是結(jié)直腸癌的危險(xiǎn)因素，但UC 的確切病因還不完全清楚。UC 的治療非常復(fù)雜，主要是抗炎或免疫抑制劑。但是常用的治療藥物，比如氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇和硫嘌呤經(jīng)常導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用［14］。因此，亟需尋找安全高效的UC 治療藥物。半夏瀉心湯中半夏和胃降逆，消痞散結(jié)為君；干姜溫中散寒，黃芩、黃連清泄里熱為臣；人參、炙甘草、大棗益氣健脾，和中補(bǔ)虛為佐。此方中藥味有辛有苦，藥性有寒有溫，辛主升主開，苦主降主泄，寒清熱，溫祛寒，是調(diào)和脾胃陰陽(yáng)的代表方劑。

UC 的炎性環(huán)境促使ROS 大量分泌，細(xì)胞啟動(dòng)抗氧化機(jī)制控制ROS 含量。過量的ROS 會(huì)引起細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致氧化與抗氧化作用失衡［15］。過剩的ROS 引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性、致使基因突變，最后引起細(xì)胞氧化損傷［16］。因此，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是UC 誘導(dǎo)和進(jìn)展的潛在推動(dòng)力。半夏瀉心湯對(duì)UC 有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群［13，17］等作用。半夏瀉心湯可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激治療慢性萎縮性胃炎、糖尿病、膿毒癥胃腸功能障礙等疾?。?8-20］。氧化應(yīng)激失衡是UC 的重要發(fā)病原因之一，本研究從抗氧化途徑探討半夏瀉心湯治療UC的作用機(jī)制。

Nrf2是一種細(xì)胞調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，維持氧化還原動(dòng)態(tài)平衡［21］。Nrf2/HO-1是一條最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路，參與機(jī)體腫瘤、炎癥反應(yīng)、黏膜修復(fù)、細(xì)胞凋亡等過程［22］。激活Nrf2/HO-1 通路，可增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力［23］。黃芩湯、薏苡附子敗醬散等通過Nrf2 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而達(dá)到治療UC 的目的［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS 明顯降低模型組中Nrf2、HO-1 和NQO-1蛋白和mRNA 含量；半夏瀉心湯干預(yù)后，UC 小鼠結(jié)腸組織中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白和mRNA 表達(dá)水平顯著增加。半夏瀉心湯亦能有效逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的氧化應(yīng)激相關(guān)酶指標(biāo)。

綜上所述，半夏瀉心湯能夠緩解DSS 誘導(dǎo)的UC，降低結(jié)腸損傷，可能是通過Nrf2/HO-1抗氧化通路發(fā)揮治療作用的。