秈粳雜種不育的遺傳分析和候選基因鑒定

許娜，唐穎，徐正進(jìn)，孫健，徐銓

秈粳雜種不育的遺傳分析和候選基因鑒定

許娜，唐穎，徐正進(jìn)，孫健，徐銓

沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，沈陽(yáng) 110866

【目的】秈粳亞種間雜交F1的育性問(wèn)題嚴(yán)重阻礙了亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用，探究秈粳雜種不育的遺傳機(jī)理，挖掘新的秈粳雜種不育調(diào)控基因，為促進(jìn)秈粳雜種結(jié)實(shí)率遺傳改良提供理論依據(jù)?！痉椒ā烤酒贩NSasanishiki和秈稻品種Habataki雜交后，采用單粒傳法自交10代，獲得包含95個(gè)株系的穩(wěn)定遺傳重組自交系（RIL），基于Illumina平臺(tái)，對(duì)雙親和RIL進(jìn)行高通量測(cè)序，在全基因組水平分析RIL中Habataki血緣的分布與比例，進(jìn)而鑒定偏分離區(qū)域作為潛在的秈粳雜種不育位點(diǎn)。同時(shí)，剖析“全球3000份水稻核心種質(zhì)資源重測(cè)序計(jì)劃”中典型秈粳稻基因組變異數(shù)據(jù)，對(duì)群體水平進(jìn)一步驗(yàn)證并趨近目標(biāo)育性基因區(qū)域。最終通過(guò)序列比對(duì)鎖定秈粳雜種不育候選基因。應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)基因敲除，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】Habataki和Sasanishiki的雜交F1在穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重上體現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，但其結(jié)實(shí)率顯著降低，I2-KI鏡檢發(fā)現(xiàn)F1花粉育性顯著降低。RIL的全基因組高通量測(cè)序在第1、3、5、6、7和12染色體上檢測(cè)到明顯的偏分離，即該區(qū)域的基因型趨向于秈稻Habataki。通過(guò)序列比對(duì)，進(jìn)一步確定已知育性基因、和為第3、6和12染色體上偏分離區(qū)域的目標(biāo)基因。應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)敲除Habataki中的多拷貝，成功改善了其與Sasanishiki雜交F1的花粉育性和結(jié)實(shí)率，說(shuō)明該基因可獨(dú)立行使功能。同時(shí)，在第1染色體的偏分離區(qū)域發(fā)現(xiàn)Habataki和Sasanishiki之間存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性變異，Sasanishiki基因組中一段24.7 kb包含4個(gè)預(yù)測(cè)基因的片段在Habataki中被一段64.8 kb包含10個(gè)預(yù)測(cè)基因的片段取代，此結(jié)構(gòu)性變異可能參與秈粳雜種育性的調(diào)控?！窘Y(jié)論】檢測(cè)到多個(gè)秈粳雜種不育相關(guān)位點(diǎn)，應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)敲除Habataki中的多拷貝成功改善其雜種F1育性，確定其為水稻亞種間育性改良的目標(biāo)基因。同時(shí)鎖定了第1染色體區(qū)域的目標(biāo)基因。

水稻；秈粳雜種不育；高通量測(cè)序；基因編輯；候選基因

0 引言

【研究意義】水稻秈粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)突出，可作為提高水稻單產(chǎn)的重要途徑，但是秈粳間雜種育性較低，限制了秈粳雜種優(yōu)勢(shì)的育種應(yīng)用。因此，闡明水稻秈粳雜種不育的遺傳機(jī)制，挖掘新的秈粳雜種育性調(diào)控基因，深入解析育性調(diào)控的分子機(jī)理，將為秈粳雜交育種與雜種優(yōu)勢(shì)利用取得新突破提供理論基礎(chǔ)和種質(zhì)資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻是世界重要糧食作物，為全球約一半人口提供主食，其中90%以上集中在亞洲。亞洲栽培稻分為秈（/）和粳（/）2個(gè)亞種，在長(zhǎng)期自然選擇和人工選擇過(guò)程中，秈粳稻基因組不斷分化，生態(tài)適應(yīng)性等生物學(xué)特性產(chǎn)生顯著差異，農(nóng)藝性狀各有利弊[1-4]。秈稻廣泛分布在印度、中國(guó)、東南亞，約占10%的粳稻集中分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)等[5]。中國(guó)是世界上唯一同時(shí)大面積種植秈稻和粳稻的國(guó)家，約占2/3的秈稻主要分布于緯度和海拔較低地區(qū)，粳稻主要分布于緯度和海拔較高地區(qū)，中部地區(qū)秈粳交錯(cuò)。我國(guó)秈粳并重，促使相關(guān)遺傳基礎(chǔ)研究成為得天獨(dú)厚且成果卓著的優(yōu)勢(shì)研究領(lǐng)域[6-8]。雜交水稻技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用為水稻增產(chǎn)作出了巨大貢獻(xiàn)[9-10]。在過(guò)去的幾十年里，僅在中國(guó)，雜交水稻每年就種植約1 700萬(wàn)hm2（約占水稻總種植面積的60%），糧食產(chǎn)量比自交系品種提高了約20%[10]。然而，目前雜交水稻品種主要由同一亞種的品系之間的雜交培育而成，大多數(shù)是秈稻品系，由于親本系的遺傳多樣性狹窄，雜交產(chǎn)量已達(dá)到平穩(wěn)水平，導(dǎo)致雜種優(yōu)勢(shì)較低。相比之下，粳稻和秈稻品種之間的雜交種具有更強(qiáng)的抗逆性，因此，具有進(jìn)一步提高產(chǎn)量潛力的巨大前景。在秈粳稻雜交中，多個(gè)秈粳雜種不育基因座的累積遺傳效應(yīng)導(dǎo)致花粉和小穗的受精率非常低，嚴(yán)重影響雜交種結(jié)實(shí)率，因此，秈粳雜種不育是阻礙利用秈粳間雜種優(yōu)勢(shì)獲得更高產(chǎn)量的主要障礙，克服秈粳雜種不育仍然是高產(chǎn)水稻育種的主要挑戰(zhàn)。遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)大約50個(gè)與雜種不育相關(guān)的基因位點(diǎn)，提出了2種解釋水稻雜種不育模型，單位點(diǎn)孢子-配子體相互作用模型和重復(fù)配子-致死模型[11-12]。前者指孢子體細(xì)胞中單個(gè)基因位點(diǎn)的不同等位基因之間的遺傳相互作用會(huì)導(dǎo)致攜帶特定等位基因的配子致死；后者指2個(gè)基因座的不同等位基因之間的上位相互作用導(dǎo)致雜種不育。迄今為止，已經(jīng)成功克隆的秈粳雜種不育基因位點(diǎn)主要有[13]、[14]、[15]、[16]、/[17]和[18]。【本研究切入點(diǎn)】秈粳雜種不育是受多個(gè)基因控制，依靠某一種或幾種不育基因位點(diǎn)的等位基因相互作用很難完全解釋秈粳不育遺傳機(jī)理，更多秈粳亞種雜種不育位點(diǎn)的挖掘?qū)⑸钊胗哉{(diào)控的分子遺傳機(jī)理研究，尤其是發(fā)掘到可獨(dú)立提升雜種育性的關(guān)鍵基因位點(diǎn)，將為水稻秈粳雜種優(yōu)勢(shì)利用作出貢獻(xiàn)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究圍繞秈粳雜種不育遺傳分析和調(diào)控基因位點(diǎn)挖掘這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，以秈粳交重組自交系為試驗(yàn)試材，應(yīng)用高通量測(cè)序和CRISPR基因編輯等方法，探索秈粳雜種不育的遺傳機(jī)理，挖掘新的秈粳不育調(diào)控位點(diǎn)，為亞種間雜交育性的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻材料

以粳稻品種笹錦Sasanishiki（Sasa）和秈稻品種Habataki（Haba）為雙親雜交獲得F1植株，采用單粒傳法套袋自交10代，獲得包含95個(gè)株系的穩(wěn)定遺傳重組自交系（RIL）。親本、F1植株和重組自交系于2022年春季4月23日播種，5月23日種植于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻所試驗(yàn)田（41°N，123°E），每個(gè)株系按照3行×10株規(guī)模種成小區(qū)，株距為10 cm，行距為30 cm，每穴單苗插植，常規(guī)水肥管理。

1.2 表型鑒定

抽穗后45 d，每小區(qū)取中部5株收獲，充分曬干后，考察單株穗數(shù)。取長(zhǎng)勢(shì)均勻的5穗，統(tǒng)計(jì)每穗粒數(shù)和結(jié)實(shí)率。隨機(jī)取100粒飽滿籽粒稱重統(tǒng)計(jì)千粒重。最后運(yùn)用Microsoft Excel 2021計(jì)算各材料每株的各性狀平均值、標(biāo)準(zhǔn)差，并對(duì)各性狀進(jìn)行兩尾等方差檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 8進(jìn)行作圖。用1% I2-KI溶液進(jìn)行花粉育性的鑒定。

1.3 DNA提取與全基因組測(cè)序和遺傳圖譜構(gòu)建

插秧后3周，取幼嫩葉片，采用CTAB法提取DNA，送北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析，重組自交系的測(cè)序共獲得207.50 Gb數(shù)據(jù)，平均深度為5.46×。使用Lep-MAP3（ref）軟件的OrderMarkers2模塊，計(jì)算標(biāo)記間的遺傳距離和各個(gè)染色體的圖距，主要參數(shù)設(shè)置為：identical Limit=0.01，min Error=1e-5，sex Averaged=0，informative Mask=123，use Kosambi=1，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。利用劃bin策略進(jìn)行圖譜構(gòu)建，得到2 241個(gè)bins。

1.4 RNA提取和qRT-PCR

使用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）從Sasa、Haba及其雜交種的水稻組織（花藥、幼穗、葉、莖和根）中提取總RNA。RNA樣品用DNaseⅠ（Promega，USA）處理。使用Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，USA）和寡聚dT或-特異性引物從2—3 μg總RNA合成第一鏈cDNA。以1（）為內(nèi)參，對(duì)進(jìn)行qRT-PCR分析，試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，并用雙尾Student’s檢驗(yàn)分析其顯著性。SYBR Green QPCR混合物（Bio-Rad）用于qRT-PCR。使用Bio-rad CFX Connect實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃15 s，72 ℃ 20 s，42個(gè)循環(huán)。（）在Sasa中的表達(dá)模式參考自水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ricexpro.dna. affrc.go.jp）。

1.5 CRISPR/Cas9基因編輯

以秈稻品種Haba為遺傳背景材料，進(jìn)行重組載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化用的農(nóng)桿菌為EHA105菌種，原核感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌DH5α菌株。根據(jù)和序列存在多態(tài)性的區(qū)間，運(yùn)用華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉耀光院士團(tuán)隊(duì)開發(fā)的基因編輯工具包CRISPR-GE（http://skl.scau.edu.cn）進(jìn)行靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)，基因編輯靶點(diǎn)序列、引物合成及測(cè)序服務(wù)均由華大基因完成。參照Li等[19]方法進(jìn)行基因編輯載體的構(gòu)建和基因編輯植株的遺傳轉(zhuǎn)化和篩選。

1.6 秈粳亞種群體基因組分化分析

基于“全球3000份水稻核心種質(zhì)資源重測(cè)序計(jì)劃”（3K Rice Project）的數(shù)據(jù)庫(kù)中樣本背景信息，首先根據(jù)群體結(jié)構(gòu)Structure信息去掉中間型組群-adm、-adm、aus（普遍具有廣親和性）、bus、admix。在剩下的秈稻亞種-1a、-1b、-2、-3中，將Structure模式圖中體現(xiàn)為-2與aus血緣互滲的種質(zhì)材料刪掉，最后保留209份-1a、205份-1b、475份-3，粳稻亞種中保留319份-tmp與388份-trp的材料。由于現(xiàn)代水稻育種已將亞種間生殖隔離打破，目前主栽品種中很多具有混合的亞種血緣，因此，在篩選到的秈粳種質(zhì)中，進(jìn)一步選擇農(nóng)家品種將使其血統(tǒng)更加純粹。最終在3K Rice Project數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選并下載424份典型秈稻農(nóng)家品種（landrace-I）與238份典型粳稻農(nóng)家品種（landrace-J）的相關(guān)數(shù)據(jù)。應(yīng)用bcftools軟件提取上述2個(gè)亞種入選種質(zhì)的vcf文件。應(yīng)用vcftools軟件分別計(jì)算全部染色體、第1染色體的100 kb窗口與第1染色體目標(biāo)QTL區(qū)域單獨(dú)SNP的群體分化系數(shù)st，利用顯著峰值判定在群體中基因組分歧強(qiáng)烈的SNP位點(diǎn)，作為生殖隔離的基因組響應(yīng)位點(diǎn)，可視化用R的CMplot包。

2 結(jié)果

2.1 F1雜種優(yōu)勢(shì)

調(diào)查粳稻品種Sasa、秈稻品種Haba及其雜交F1，發(fā)現(xiàn)秈粳雜交F1展現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)（圖1-A—B）。雙親株高沒有顯著差別，F(xiàn)1代株高顯著高于雙親（圖1-C）。Sasa穗數(shù)顯著多于Haba，雜交F1顯著多于Sasa（圖1-D）。Haba每穗粒數(shù)顯著多于Sasa，雜交F1每穗粒數(shù)超過(guò)200，顯著多于Haba（圖1-E）。Sasa和Haba之間千粒重沒有顯著差異，雜交F1千粒重顯著高于雙親（圖1-F）。Sasa和Haba之間結(jié)實(shí)率沒有顯著差異，達(dá)到90%，雜交F1結(jié)實(shí)率顯著降低，僅達(dá)到20%（圖1-G），不育籽粒并未受精，穎殼內(nèi)空癟，不育籽粒均勻分布在整個(gè)穗部。因此，F(xiàn)1籽粒結(jié)實(shí)率降低是限制發(fā)揮秈粳間雜種優(yōu)勢(shì)利用的主要問(wèn)題。

A：株型；B：穗型；C：株高；D：穗數(shù)；E：每穗粒數(shù)；F：千粒重；G：結(jié)實(shí)率。不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 F1的花粉育性

Sasa和Haba雜交F1結(jié)實(shí)率顯著降低，使用I2-KI鏡檢進(jìn)行雙親和雜交F1花粉的育性檢測(cè)。結(jié)果顯示，Sasa和Haba的花粉表現(xiàn)出完全可育，可染色花粉比例沒有顯著差別，均達(dá)到90%（圖2-A—B和圖2-D），而雜交F1的可染色花粉比例顯著降低，不足40%。不育花粉體積較小，呈圓球形或不規(guī)則形，空癟無(wú)物，著色淺或不著色，大多為典型的空敗花粉，少量為圓敗花粉（圖2-C—D）。因此，推測(cè)花粉育性降低是秈粳雜種F1結(jié)實(shí)率降低的原因之一。因?yàn)殡s交F1結(jié)實(shí)率為20%，顯著低于其花粉可染色比例，推測(cè)雜交F1存在一定比例的雌配子不育（圖1-G和圖2-C—D）。

2.3 F1雜種不育的遺傳分析

為了闡明調(diào)控F1雜種不育的基因位點(diǎn)，對(duì)Sasa和Haba雜交后自交10代構(gòu)建的包含95個(gè)株系的重組自交系（RIL）進(jìn)行基于Illumina平臺(tái)的全基因組高通量測(cè)序。重組自交系的測(cè)序共獲得207.50 Gb數(shù)據(jù)，平均深度為5.46×，Haba測(cè)序得到22.94 Gb數(shù)據(jù)，測(cè)序深度為51.00×，Sasa測(cè)序得到23.24 Gb數(shù)據(jù)，測(cè)序深度為56.00×。比對(duì)雙親鑒定到1 947 668個(gè)SNP，過(guò)濾后得到1 591 495個(gè)高質(zhì)量SNP進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，得到一個(gè)包含2 241個(gè)bins的遺傳圖譜（圖3-A—B）。根據(jù)RIL的基因型，分析其Haba類型SNP在群體中的比例，繪制秈型血緣滲入比率示意圖，發(fā)現(xiàn)雖然使用單粒傳法構(gòu)建RIL，但Haba血緣平均比例在全基因組中并不是維持在50%左右，其平均值為0.38，其中，第4、9、11和12染色體Haba血緣比例較低，第7染色體Haba血緣整體較高。在第1、3、6、7和12染色體檢測(cè)到明顯的偏分離，即該區(qū)域的基因型趨向于秈稻Haba，Haba血緣超過(guò)了平均值的2倍，超過(guò)了0.76，說(shuō)明該區(qū)域在雜交后分離過(guò)程中有更多的秈稻Haba型配子保留下來(lái)（圖3-C），暗示這些區(qū)域可能存在調(diào)控秈粳雜種育性的關(guān)鍵基因。

A：Sasa花粉I2-KI鏡檢；B：Haba花粉I2-KI鏡檢；C：F1（Sasa/Haba）花粉I2-KI鏡檢；D：Sasa、Haba和F1（Sasa/Haba）花粉可染色率

2.4 秈粳雜種不育基因序列比對(duì)

比對(duì)前人關(guān)于秈粳雜種不育調(diào)控位點(diǎn)的研究后發(fā)現(xiàn)第3、6和12染色體的偏分離峰與已克隆的關(guān)鍵秈粳雜種不育基因、和位置重合[14-16]。比對(duì)Sasa和Haba的位點(diǎn)的3個(gè)緊密相連的連鎖基因開放閱讀框（、和），發(fā)現(xiàn)Sasa和Haba為典型的粳稻和秈稻位點(diǎn)（圖4）；對(duì)比Sasa和Haba的位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Sasa在位點(diǎn)只包含一個(gè)拷貝，但是Haba在該位點(diǎn)包含3個(gè)拷貝、和（圖4）。比對(duì)（和）位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)在雙親之間存在豐富的多態(tài)性，并且位點(diǎn)的T缺失和2個(gè)SNP，導(dǎo)致移碼突變并在外顯子形成終止密碼子。在本群體中并沒有檢測(cè)到已經(jīng)克隆的秈粳雜種不育相關(guān)基因/、和[13, 17-18]。進(jìn)一步比對(duì)這些基因在Sasa和Haba之間的多態(tài)性，結(jié)果顯示，在Haba的位點(diǎn)并不存在與Kasalath相同的518 bp的轉(zhuǎn)座子插入；比對(duì)（和）位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Haba的位點(diǎn)序列與Sasa完全一致，這可能是本群體中沒有檢測(cè)到/和位點(diǎn)的原因。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)Sasa和Haba在位點(diǎn)存在結(jié)構(gòu)性變異，其中Sasa中一段11.2 kb包含和的片段被一段35.0 kb包含5個(gè)ORF（、、/、/和）的片段取代，但是在本群體中并沒有檢測(cè)到該位點(diǎn)的偏分離現(xiàn)象，暗示在Sasa和Haba的雜合背景下，的功能被其他育性恢復(fù)位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)所補(bǔ)償。

2.5 秈粳雜種不育位點(diǎn)Sc的基因編輯驗(yàn)證

Haba在位點(diǎn)存在多拷貝現(xiàn)象，其中，在第一個(gè)外顯子中有一段2.0 kb的插入，并且缺失了第一個(gè)外顯子的末端，導(dǎo)致其編碼的DUF1618功能域缺失，此外，還在第一個(gè)內(nèi)含子中有一段10.1 kb的大片段插入，因此，認(rèn)為并不具備位點(diǎn)的功能，是一個(gè)無(wú)功能基因（圖4-C）。秈稻Haba中的另外2個(gè)拷貝和均含有完整的拷貝，與的第一個(gè)外顯子序列相似度分別為97.5%和97.8%，第二個(gè)外顯子與完全一致（圖5-A）。Sasa的單拷貝僅在花藥中表達(dá)，而Haba的多拷貝使其在花藥中表達(dá)量顯著增加，而且在根、莖、葉和穗中均有較高表達(dá)（圖5-B）。

A：重組自交系的遺傳圖譜；B：重組自交系中Haba血緣的滲入比例；C：已知秈粳雜種不育位點(diǎn)

A：DPL1和DPL2位點(diǎn)的序列比對(duì)；B：SaF和SaM位點(diǎn)的序列比對(duì)；C：Sc位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)性變異；D：S5位點(diǎn)的序列比對(duì)；E：RHS12位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)性變異；F：HSA1a和HSA1b位點(diǎn)的序列比對(duì)

雖然和序列相似，但其在第一個(gè)外顯子中仍然存在細(xì)微差別，其中，一個(gè)G堿基的插入形成了中不存在的CRISPR基因編輯的靶點(diǎn)PAM序列CGG。以此PAM序列設(shè)計(jì)了一個(gè)只敲除拷貝，但是無(wú)法敲除拷貝的CRISPR載體，對(duì)Haba進(jìn)行基因編輯。在T2代篩選到2個(gè)Cas free的純合突變CR-1和CR-2，分別缺失了1個(gè)C堿基和5個(gè)堿基AGGCC，2個(gè)突變類型均引起移碼突變，缺失了DUF1618功能域（圖6-A）。對(duì)比CR-1和CR-2與Sasa的雜交F1植株和Sasa與Haba的雜交F1植株發(fā)現(xiàn)F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）的花粉可染色比例顯著提高（圖6-B）。表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)F1（Sasa/Haba）的表達(dá)量顯著降低，暗示和會(huì)抑制的表達(dá)，但是F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/ CR-2）的表達(dá)量顯著高于F1（Sasa/Haba）的表達(dá)量（圖6-C），暗示減少的拷貝數(shù)可以減弱其對(duì)的抑制。I2-KI鏡檢發(fā)現(xiàn)F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）的花粉育性顯著高于F1（Sasa/Haba）（圖6-D），并且其結(jié)實(shí)率也顯著高于F1（Sasa/Haba）（圖6-E）。

A：Haba中Sc位點(diǎn)的多拷貝；B：Sc在Sasa和Haba中的表達(dá)模式

2.6 秈粳雜種不育位點(diǎn)Sd的候選基因預(yù)測(cè)

進(jìn)一步分析第1染色體3.1 Mb附近區(qū)域內(nèi)的偏分離信號(hào)，該信號(hào)峰的區(qū)域作為亞種間雜交不育位點(diǎn)在臺(tái)中65的近等基因系中被報(bào)道，然而，目標(biāo)基因并沒被成功地鑒定與克隆[20-21]。為了在群體水平中驗(yàn)證該位點(diǎn)是否具有亞種間生殖隔離的普遍性，本研究剖析了“全球3000份水稻核心種質(zhì)資源重測(cè)序計(jì)劃”中典型秈粳稻基因組變異數(shù)據(jù)。應(yīng)用vcftools軟件分析了入選典型秈粳稻群體間在第1染色體上每100 kb的分化系數(shù)st，發(fā)現(xiàn)亞種間st分化信號(hào)峰值出現(xiàn)在3.8 Mb物理位置，并輻射上下游1 Mb基因組區(qū)域，與RIL群體偏分離信號(hào)重疊（圖7）。在群體水平上證實(shí)了該位點(diǎn)是亞種間生殖隔離的普遍性關(guān)鍵位點(diǎn)。因此，比對(duì)該基因組區(qū)域內(nèi)Sasa和Haba的預(yù)測(cè)基因的序列差別，發(fā)現(xiàn)Sasa和Haba在該區(qū)間內(nèi)存在復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)性變異，Sasa基因組中一段24.7 kb的片段在Haba中被一段64.8 kb的片段取代。Sasa基因組中24.7 kb的片段中包含、、和4個(gè)預(yù)測(cè)基因，而Haba的第1染色體64.8 kb片段中包含10個(gè)預(yù)測(cè)基因，且Sasa中的4個(gè)預(yù)測(cè)基因在Haba中無(wú)法比對(duì)到相似序列（圖7）。綜上所述，粳稻Sasa該區(qū)域內(nèi)的4個(gè)預(yù)測(cè)基因和秈稻Haba該區(qū)域內(nèi)的10個(gè)預(yù)測(cè)基因可能在其雜種育性調(diào)控上起重要作用。

3 討論

3.1 秈粳雜種不育的遺傳機(jī)理

根據(jù)配子敗育的類型不同，秈粳雜種不育分為雌配子敗育和雄配子敗育，其中，利用臺(tái)中65的近等基因系，對(duì)秈粳雜交花粉敗育進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳研究，先后定位了、、、和等5個(gè)秈粳雜種花粉不育位點(diǎn)[20-23]，其中、和位點(diǎn)已經(jīng)被成功克隆[13-14, 24]。為一個(gè)由2個(gè)相鄰基因和組成的雜種不育復(fù)合基因位點(diǎn)，這兩個(gè)基因分別編碼一個(gè)F-盒蛋白和一個(gè)小的泛素樣修飾物E3連接酶。在雜合子中，來(lái)自3個(gè)等位基因（秈型和，以及粳稻）的蛋白質(zhì)之間的有害相互作用導(dǎo)致攜帶粳稻等位基因的花粉粒選擇性致死，從而在分子水平上建立了雙基因/三成分相互作用模型[13]。位點(diǎn)秈粳等位基因間的DNA序列存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異,秈稻等位基因攜帶2—3個(gè)的同源拷貝，因此，秈粳雜種中的高表達(dá)抑制了花粉中的表達(dá)，進(jìn)而造成攜帶的花粉敗育[14]。近期研究發(fā)現(xiàn)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉自強(qiáng)團(tuán)隊(duì)克隆的位點(diǎn)[24]與南京農(nóng)業(yè)大學(xué)萬(wàn)建民院士團(tuán)隊(duì)克隆的秈粳雜種不育基因[18]及華中農(nóng)業(yè)大學(xué)歐陽(yáng)亦聃教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道的[25]為同一位點(diǎn)，該位點(diǎn)由緊密連鎖的2個(gè)基因組成，可以分別比喻為“破壞者”和“守衛(wèi)者”。“破壞者”對(duì)所有花粉產(chǎn)生傷害作用，引起花粉的敗育；而“守衛(wèi)者”阻止“破壞者”的傷害作用，因此，那些遺傳了該基因的花粉，因受到保護(hù)能正常發(fā)育。和被定位到第1染色體和第5染色體上，目前還沒有成功克隆[20, 22-23]。本研究在第1染色體上鑒定到的偏分離峰與定位區(qū)間重合，并且在“全球3000份水稻核心種質(zhì)資源重測(cè)序計(jì)劃”的群體水平上證實(shí)該位點(diǎn)是一個(gè)亞種間生殖隔離的普遍性位點(diǎn)。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)粳稻Sasa基因組中一段24.7 kb的片段在Haba中被一段64.8 kb的片段取代，進(jìn)而提名了候選基因，為該基因的克隆與功能研究提供了關(guān)鍵線索。秈粳分化位點(diǎn)的分析也佐證了該區(qū)域?yàn)槎i粳分化位點(diǎn)，暗示該區(qū)域可能調(diào)控秈粳雜種不育。/是一對(duì)同源基因，均編碼植物特異小分子蛋白，對(duì)花粉萌發(fā)有重要作用。典型秈稻攜帶有功能的和無(wú)功能的，典型粳稻攜帶有功能的和無(wú)功能的，而秈粳雜種中攜帶2個(gè)功能缺失突變等位基因的花粉，不能萌發(fā)，這意味著在花粉萌發(fā)中扮演著一個(gè)重要的角色[17]，本研究發(fā)現(xiàn)Haba并不含有典型的秈型等位基因。是一個(gè)復(fù)雜的基因座，調(diào)控雌配子敗育，包含3個(gè)緊密連接的基因、和。在雌性孢子發(fā)生過(guò)程中，秈稻等位基因的殺手/伴侶基因和的共同作用導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和胚胎囊的流產(chǎn)，其中，粳稻等位基因中含有非功能保護(hù)基因；秈稻等位基因的功能性拯救了這些效應(yīng)[15]。基因座包含2個(gè)緊密連接的基因，和；粳稻和秈稻雜交種中基因的粳稻和秈稻等位基因之間的上位性相互作用導(dǎo)致雌配子致死[16]。本研究在第5染色體和第12染色體鑒定到的偏分離峰與和位置重合，佐證了和所引起的雌配子敗育也是引起Sasa和Haba雜種結(jié)實(shí)率下降的原因。

A：Sc-Haba-2與Sc-Haba-3靶點(diǎn)PAM序列的差異和基因編輯植株的突變序列；B：F1（Sasa/Haba）、F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）植株的花粉I2-KI鏡檢；C：Sasa、F1（Sasa/Haba）、F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）中Sc-Sasa的表達(dá)量；D：F1（Sasa/Haba）、F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）的花粉可染率；E：F1（Sasa/Haba）、F1（Sasa/CR-1）和F1（Sasa/CR-2）的結(jié)實(shí)率

A：Chr.1的100 kb窗口10 kb滑動(dòng)的群體分化Fst區(qū)域，粉色區(qū)域表示3.8 Mb物理位置處Fst分化信號(hào)峰值所輻射的上下游1 Mb基因組區(qū)域；B：第1染色體中Haba基因型的滲入比例；C：候選區(qū)間內(nèi)秈粳間的基因組結(jié)構(gòu)性變異

3.2 結(jié)構(gòu)性變異影響秈粳雜種育性

基因組結(jié)構(gòu)變異，包括片段插入、缺失、反轉(zhuǎn)、易位、重復(fù)和拷貝數(shù)變異，對(duì)各種生物過(guò)程、農(nóng)藝性狀和人類疾病具有顯著的遺傳影響[26]。在三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)推廣以前，基因組結(jié)構(gòu)性變異，尤其是基因拷貝數(shù)變異，很難通過(guò)圖位克隆鑒定?？截悢?shù)變異在植物基因組中廣泛分布[27]。最近報(bào)道的泛基因組揭示了隱藏的拷貝數(shù)變異，并證明拷貝數(shù)變異調(diào)節(jié)重要的農(nóng)藝性狀[25, 28-29]?；蜃目截悢?shù)變化有助于水稻的粒型多樣性[29]，基因座的額外拷貝數(shù)顯著增加了每穗的粒數(shù)[30-31]，的雙拷貝可能是解釋Koshihikari早花表型的原因候選者[26, 32]?；蚩截悢?shù)變異也參與水稻秈粳雜種育性的調(diào)控，的拷貝數(shù)變異在秈粳亞種之間分化，秈稻一般含有2—3個(gè)拷貝，而粳稻中只有一個(gè)拷貝[14]。利用RGP網(wǎng)站的RiceGAAS系統(tǒng)對(duì)座位定位區(qū)段進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)秈稻每個(gè)拷貝中還含有預(yù)測(cè)基因、、和，并且、、均為位點(diǎn)雜種不育功能所必需[33]。本研究還在和拷貝中發(fā)現(xiàn)了、、和預(yù)測(cè)基因，暗示位點(diǎn)可能存在超過(guò)10個(gè)預(yù)測(cè)基因參與的復(fù)雜遺傳機(jī)理。//位點(diǎn)也存在秈粳間復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性變異，序列分析顯示，在臺(tái)中65中，定位區(qū)包含2個(gè)ORF（命名為和），而在秈稻G4中，除了與或同源的基因（分別命名為和）外，它還包含3個(gè)額外的ORF，命名為、和，而這額外的基因?qū)Χi粳雜種育性有重要的調(diào)控作用[18, 24-25]。本研究定位的位點(diǎn)區(qū)間同樣在秈粳之間存在復(fù)雜的結(jié)構(gòu)性變異，粳稻Sasa該區(qū)域含有4個(gè)預(yù)測(cè)基因，而秈稻Haba該區(qū)域含有10個(gè)預(yù)測(cè)基因，暗示這些ORF中可能存在調(diào)控秈粳雜交育性的關(guān)鍵基因。

3.3 秈粳雜種優(yōu)勢(shì)利用

作物雜種優(yōu)勢(shì)利用是大幅提高糧食產(chǎn)量的重要途徑，一般來(lái)說(shuō)品種間親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，雜交優(yōu)勢(shì)越明顯。秈稻和粳稻亞種間能育成超級(jí)雜交稻可以比現(xiàn)有雜交水稻增產(chǎn)15%以上[34]。然而秈稻和粳稻之間存在嚴(yán)重的生殖隔離，是阻礙雜種優(yōu)勢(shì)利用的最大障礙之一。深入研究秈粳雜種不育遺傳機(jī)理將為秈粳雜種優(yōu)勢(shì)的育種應(yīng)用提供理論依據(jù)和種質(zhì)資源。隨著現(xiàn)代分子生物育種技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的雜種不育座位被鑒定、克隆，為秈粳稻雜種育性改良提供了潛在的靶點(diǎn)。應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)可以在已知的雜交不育基因位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變或者大片段敲除，可改良秈粳雜種育性，從而加快廣親和系的培育，如，通過(guò)敲除座位的拷貝中的1個(gè)或2個(gè)，減少的基因表達(dá)量，從而恢復(fù)的正常表達(dá)，創(chuàng)制出等位基因[14]；應(yīng)用 CRISPR方法對(duì)基因座2個(gè)基因和進(jìn)行編輯，快速創(chuàng)建等位基因也成功改良了秈粳雜種育性[35]。本研究也通過(guò)CRISPR基因編輯，應(yīng)用的特異PAM序列將其敲除，改善了其與Sasa的雜種育性。重要的是該基因可獨(dú)立行使功能來(lái)改善其雜種F1育性，可作為水稻亞種間育性改良的目標(biāo)基因，具有較大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

在第1、3、6、7和12染色體檢測(cè)到可能存在調(diào)控秈粳雜種育性關(guān)鍵基因的偏分離區(qū)域。應(yīng)用CRISPR基因編輯技術(shù)敲除Haba第3染色體上位點(diǎn)的多拷貝成功改善其秈粳雜種F1育性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)第1染色體上位點(diǎn)秈粳間復(fù)雜結(jié)構(gòu)性變異是調(diào)控亞種間生殖隔離的關(guān)鍵，并提名了目標(biāo)候選基因。

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Genetic analysis and candidate gene identification on fertility and inheritance of hybrid sterility ofandcross

XU Na, TANG Ying, XU ZhengJin, SUN Jian, XU Quan

Rice Research Institute, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866

【Objective】The F1hybrid sterility between/and/severely hinders the utilization of hybrid advantage between subspecies. Exploring the genetic mechanism and identifying new regulatory genes for/hybrid sterility will provide theoretical basis for promoting genetic improvement of/hybrid seed setting rate.【Method】A series of stable genetic recombination inbred lines (RILs) containing 95 plant lines were derived from the cross betweenvariety Habataki andvariety Sasanishiki after 10 generations inbred using single seed descent method. High throughput sequencing was performed on both parents and RILs on the Illumina platform, and the distribution of Habataki pedigree in RILs was analyzed at the whole genome level. The segregation distortion regions were identified, and hybrid sterile related gene loci were screened within the segregation distortion regions, then identified candidate genes through sequence alignment comparison. The targeted gene was knockout to verify the function using CRISPR gene editing technology.【Result】The hybrid F1plants derived from the cross between Habataki and Sasanishiki showed significant heterosis in panicles, grains per panicle, and thousand grain weight, but its seed setting rate significantly decreased. I2-KI microscopy revealed a significant decrease in F1pollen fertility. High throughput sequencing of the entire genome of RILs revealed significant segregation distortion on chr.1, chr.3, chr.5, chr.6, chr.7, and chr.12, indicating that the genotype in this region tends towards the Habataki. Sequence alignment comparison revealed that,, andare target genes for the segregation distortion on chr.3, chr.6, and chr.12. The CRISPR gene editing mutants with a knock-outallele in Habataki successfully improved the pollen fertility and seed setting rate of F1hybrid with Sasanishiki. A complex structural variation was found between Sasanishiki and Habataki in the segregation distortion of chr.1. A 24.7 kb segment containing 4 predicted genes in the Sasanishiki genome was replaced by a 64.8 kb segment containing 10 predicted genes in Habataki, the structural variation may involve in controlling the hybrid sterility ofandcross. 【Conclusion】This study detected multiplehybrid infertility related loci, and successfully improved F1fertility by using CRISPR gene editing to knock out multiple copies ofin Habataki, locking in the target gene in theregion of chr.1.

rice; hybrid sterility; high throughput sequencing; gene editing;candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.08.001

2023-10-23；

2023-11-29

興遼英才計(jì)劃（XLYC2203171）

許娜，E-mail：xuna1109@163.com。通信作者徐銓，E-mail：kobexu34@syau.edu.cn。通信作者孫健，E-mail：sunjian811119@syau.edu.cn

（責(zé)任編輯 李莉）