體外循環(huán)小鼠模型研究進(jìn)展

董文豪，王添隆，吉冰洋

體外循環(huán)（extracorporeal circulation, ECC）是一種在一段時間內(nèi)代替心肺功能，對某些特定病理狀態(tài)下的患者起到生命支持作用的技術(shù)，在心臟外科手術(shù)及心肺衰竭、等待器官移植等患者的治療過程中起到了重要的作用[1-3]。但與此同時，ECC 也存在眾多的并發(fā)癥[4]。建立一個穩(wěn)定有效的ECC 動物模型有助于進(jìn)一步探究ECC 對機(jī)體的影響及其病理生理過程，優(yōu)化圍術(shù)期管理策略，改善患者生存質(zhì)量。

已經(jīng)建立ECC 的動物模型有羊、豬、兔、大鼠等[5-9]。近年來隨著顯微操作技術(shù)的進(jìn)步和小體積精密ECC 設(shè)備及耗材的普及，建立小鼠ECC模型的可行性大大提高[10]。相比于羊、豬等大動物，小鼠作為小動物存在易于獲得、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。與同是小動物的大鼠相比，小鼠現(xiàn)有的基礎(chǔ)疾病模型更加豐富，可更容易實(shí)現(xiàn)基因編輯等操作，為ECC 的基礎(chǔ)研究提供了更多的可能性。同時市面上有很多針對小鼠的特異性抗體和試劑，這降低了開展分子層面研究的難度。

由于目前小鼠ECC 模型仍存在建模難度高、操作流程復(fù)雜、圍實(shí)驗(yàn)期相關(guān)管理不規(guī)范等問題，所以有必要在小鼠體外循環(huán)的建立和管理策略等方面進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，同時為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。

1 ECC 小鼠模型基礎(chǔ)特征

1.1實(shí)驗(yàn)小鼠的選擇與管理 實(shí)驗(yàn)所選取的小鼠大多為C57BL/6 品系，周齡多在12 周左右，體重位于在25～35 g區(qū)間，均屬成年小鼠范疇；見表1。小鼠成年后各組織器官發(fā)育成熟，具有更好的抗創(chuàng)傷能力，血管發(fā)育成熟有利于模型的建立。

表1 小鼠體外循環(huán)模型基礎(chǔ)參數(shù)

1.2小鼠圍實(shí)驗(yàn)期體征監(jiān)測納入的所有實(shí)驗(yàn)小鼠均進(jìn)行了血壓監(jiān)測，其中絕大部分小鼠測壓是通過左股動脈穿刺完成的[11-17]，但也有個別實(shí)驗(yàn)選擇在頸動脈置管進(jìn)行測壓；見表1。小鼠左股動脈穿刺常采用1 Fr 尺寸的導(dǎo)管，有實(shí)驗(yàn)選擇PE-8 型號導(dǎo)管（ID = 0.2 mm，OD = 0.36 mm），可能與該實(shí)驗(yàn)中選取小鼠年齡較大有關(guān)[17]。測溫方面，直腸測溫因其具有的簡單操作、測量準(zhǔn)確被所有實(shí)驗(yàn)采用。部分實(shí)驗(yàn)需要監(jiān)測小鼠心臟功能，采用標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)心電圖進(jìn)行連接測量。因小鼠循環(huán)血量較少（ ＜ 2 ml），為避免實(shí)驗(yàn)中小鼠失血過多，需要提前制定實(shí)驗(yàn)中用于血?dú)夥治龅某檠拇螖?shù)和單次抽血量并給予適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)中補(bǔ)液，單次抽血量一般為75 ～95 μl[12-13,15]。

1.3麻醉及呼吸管理 麻醉與呼吸管理是建立小鼠ECC 模型的基礎(chǔ)，選擇適當(dāng)?shù)穆樽硭幬?、正確的麻醉方式、穩(wěn)定的呼吸管理策略可以有效減少麻醉和呼吸因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響。吸入麻醉具有調(diào)節(jié)簡便、利于實(shí)時觀察小鼠麻醉狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，同時避免了靜脈麻醉存在血液稀釋的缺點(diǎn)。全部實(shí)驗(yàn)都選擇了對小鼠進(jìn)行吸入麻醉，麻醉藥物選擇均為異氟烷；見表1。同時所有活體小鼠實(shí)驗(yàn)均采用皮下注射鎮(zhèn)痛藥以減輕小鼠在實(shí)驗(yàn)中因外科操作帶來的疼痛，以卡洛芬為主[11-15,17]，也有實(shí)驗(yàn)選擇了布托啡喏[16]。多數(shù)實(shí)驗(yàn)采取經(jīng)口插管機(jī)械通氣的方式以消除氣管切開對小鼠造成的有創(chuàng)損傷，插管使用的導(dǎo)管型號僅有一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中記錄為20 G 導(dǎo)管[11]。呼吸機(jī)相關(guān)參數(shù)中潮氣量為250 ～350 μl/次或7.5 ml/（kg·次），呼吸頻率有記錄的研究顯示為100 ～120 次/min，潮氣量和呼吸頻率都符合小鼠生理狀態(tài)下的數(shù)值。實(shí)驗(yàn)中采取自主呼吸的小鼠沒有進(jìn)行氣管插管，吸入麻醉是通過呼吸面罩完成的[13,15]。

2 ECC 小鼠模型建立及管理策略

2.1外科插管操作 區(qū)別于犬、家兔、大鼠等動物，小鼠體積很小，這就導(dǎo)致與插管相關(guān)的外科操作很難在肉眼下采用常規(guī)手術(shù)器械完成，因此實(shí)驗(yàn)的插管及相關(guān)操作是在顯微鏡下通過顯微外科器械（顯微剪、顯微鑷、顯微血管鉗等）進(jìn)行的，部分實(shí)驗(yàn)也強(qiáng)調(diào)了研究人員需要具備顯微外科相關(guān)的操作技術(shù)[11]。

根據(jù)引流與回流端血管不同，可以將ECC 系統(tǒng)分為靜脈引流-動脈回流型（veno-arterial, V-A）和靜脈引流-靜脈回流型（veno-venous, V-V）兩大類。所有實(shí)驗(yàn)引流端均選擇右側(cè)頸靜脈進(jìn)行穿刺，多采用2 Fr 型號留置管，并提前于顯微鏡視野下將套管距離末端的1/3 處開3 ～4 個窗口以保證引流通暢；見表1。頸靜脈插管成功時距鎖骨約2.5 cm，此時導(dǎo)管處于引流量最佳的位置[12]。V-A 模型回流端均選擇左頸動脈插管，多采用27 G 型號的套管[11-12,14]，也有實(shí)驗(yàn)采用如25 G、PE-8（ID = 0.2 mm，OD = 0.36 mm）型號套管。V-V模型的回流端大多選擇在左頸靜脈穿刺，采用26 G、2 Fr 等留置管。目前也有一種新型雙腔套管的V-V 模型[15]，Natanov 等人利用一根2 Fr 硅膠雙腔導(dǎo)管于左頸靜脈進(jìn)行插管，分別在引流管腔距遠(yuǎn)端0.2 mm、0.4 mm、20 mm 和回流管腔距遠(yuǎn)端0.4 mm、0.5 mm 開窗，并將回流管腔遠(yuǎn)端封閉以防止血液再循環(huán)和分流，確保了ECC 運(yùn)行過程中右心房引流以及上下腔靜脈回流通暢；雙腔套管模型示意圖見圖1。

圖1 雙腔導(dǎo)管簡圖

2.2ECC 回路構(gòu)成 常規(guī)小鼠ECC 回路主要由血管內(nèi)留置套管、氧合器、儲血室、血泵等組成：見圖2。血泵是血液在回路中運(yùn)轉(zhuǎn)的動力來源，可分為滾壓泵和離心泵兩類。由于小鼠的ECC 流量較小，離心泵不適用于精密流量的調(diào)節(jié)[19]，故小鼠模型ECC回路中多采用小體積滾壓泵（蠕動泵），但滾壓泵在使用過程中可能會造成溶血[20]。滾壓泵的原理是擠壓管路產(chǎn)生負(fù)壓差進(jìn)而推動血液流動，故大部分實(shí)驗(yàn)都選用了較為柔軟同時具有韌性的硅膠材質(zhì)管路，以盡可能地減少血液破壞；見表2。氧合器負(fù)責(zé)管路中血液的氣體交換，氧合流經(jīng)的血液，多數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定吸入氧濃度分?jǐn)?shù)為80%或100%可以滿足血液內(nèi)氧分壓或二氧化碳分壓等指標(biāo)的要求[11-14,18]。為避免轉(zhuǎn)機(jī)過程中產(chǎn)生微小氣泡，可另外設(shè)置儲血室以進(jìn)行轉(zhuǎn)中排氣[21]。

圖2 體外循環(huán)小鼠模型示意圖

表2 小鼠體外循環(huán)模型建立及管理參數(shù)

以往有研究表明過高的預(yù)充量可能導(dǎo)致血液稀釋進(jìn)而使患者的預(yù)后惡化[22]，氧合器與儲血室是預(yù)充量中的主要體積來源，故縮小氧合器和儲血室有利于減少高預(yù)充量導(dǎo)致的血液稀釋。氧合器預(yù)充體積目前最小可以達(dá)到200 μl[16]，儲血室體積最小可達(dá)150 μl[11,16]，二者體積的縮小使得回路預(yù)充液體積顯著減小。

2.3ECC 管理策略 小鼠ECC 管路的總預(yù)充量大多在500 ～850 μl，其中多數(shù)預(yù)充液由晶體液和膠體液組成，目前小鼠模型報道中常用的膠體液主要是6%羥乙基淀粉和晶體液復(fù)方電解質(zhì)液，一般將二者配成1 ∶1 或3 ∶1 的溶液[11-12,14-15,17-18]，另添加肝素用于防止血液凝固以及碳酸氫鈉溶液作為堿性緩沖液；見表2。也有實(shí)驗(yàn)采用來自其它小鼠的血液作為預(yù)充液，血液預(yù)充的優(yōu)點(diǎn)是在滿足較大預(yù)充量的同時幾乎不造成血液稀釋，缺點(diǎn)是溶血和炎癥反應(yīng)的風(fēng)險也會增大[17]。小鼠在ECC 啟動前需要全身血液肝素化抗凝，除一項(xiàng)利用死亡小鼠建立ECC 模型的實(shí)驗(yàn)采用了1 000IU 的超量肝素化策略[18]，其余實(shí)驗(yàn)的肝素化策略均為2.5 IU/g。大多實(shí)驗(yàn)沒有記錄小鼠模型啟動轉(zhuǎn)機(jī)的活化凝血時間（activated coagulation time, ACT）值，有記錄的研究ACT 值顯示為800 s。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的ECC 時間為90 ～120 min，這可能是因?yàn)檫^長時間的轉(zhuǎn)機(jī)會導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)[23]，進(jìn)而造成心臟驟停等不良后果。多數(shù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)機(jī)的流量在3 ～6 ml/min，約為正常小鼠心輸出量（6 ～9 ml/min）的50%[13]。啟動轉(zhuǎn)機(jī)時流量大約0.5 ml/min，并在2 min 內(nèi)達(dá)到3 ～6 ml/min。轉(zhuǎn)機(jī)過程中血流量不足可能會導(dǎo)致急性腎損傷等并發(fā)癥[24]，流量的微調(diào)一般以動脈血壓為依據(jù)，部分實(shí)驗(yàn)將動脈血壓維持在40 ～60 mmHg 水平[11-12]，也有實(shí)驗(yàn)將血壓維持在70 ～85 mmHg 間[13]，不同的灌注量與ECC 的類型及實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠嘘P(guān)。

3 小鼠ECC 模型研究進(jìn)展

ECC 在臨床實(shí)踐上可分為心外科手術(shù)中采用的心肺轉(zhuǎn)流技術(shù)（cardiopulmonary bypass, CPB）及對于嚴(yán)重心肺衰竭患者進(jìn)行器官支持的體外膜氧合技術(shù)（extracorporeal membrane oxygenation,ECMO）。目前進(jìn)行小鼠ECC 模型研究的課題組數(shù)量不多，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的目的集中在建立有效的CPB 及ECMO 模型以及討論相關(guān)管理策略。Madrahimov 等人在2017 年的研究中首次實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)建立一個功能完備且具有臨床意義的CPB模型[11]，研究人員通過減小氧合器與儲血室體積將預(yù)充量減少到850 μl，增大了該模型的可行性。Madrahimov 等人在2018 年的一項(xiàng)研究中成功建立了自主呼吸小鼠的V-V ECMO 模型[13]，該模型在滿足通氣麻醉功能的前提下減小了對小鼠的肺部損傷。Natanov 等人2019 年制作了一種血流動力學(xué)穩(wěn)定的雙腔插管V-V ECMO 模型[15]，該單管雙腔V-V ECMO 模型在減小多靜脈插管損傷的同時改善了小鼠心肺功能的預(yù)后。Kharnaf 等人研究了一種以小鼠血進(jìn)行預(yù)充的V-A ECMO 模型[11]，該模型要求較高的預(yù)充量。

除了基礎(chǔ)模型的構(gòu)建，也有研究關(guān)注ECC 引起的全身炎癥反應(yīng)與器官損傷。Madrahimov 的研究指出小鼠經(jīng)過CPB 處理后，肝臟及腎臟功能會受到損傷[12]。Natanov 等人發(fā)現(xiàn)CPB 會導(dǎo)致小鼠腎臟、肺和肝臟的促炎細(xì)胞因子顯著增加，組織學(xué)病理改變明顯[14]。Greite 的研究比較了ECMO模型和腎血管夾閉缺血再灌注損傷模型在造成小鼠急性腎損傷上的異同[16]。Madrahimov 等人在2023 年的一項(xiàng)研究中評估了一種新型ECMO 和血液透析的裝置對于死亡小鼠終末器官的保護(hù)作用[18]，這為器官移植前的保存提供了重要理論依據(jù)。

4 展望

研究ECC 小鼠模型的課題組近年來逐步增多，但目前對于ECC 全過程中的麻醉呼吸管理、外科操作流程、轉(zhuǎn)機(jī)參數(shù)等還沒有統(tǒng)一規(guī)范。小鼠作為模型動物的優(yōu)點(diǎn)是具有多種疾病模型以及針對基因型設(shè)計的特異性試劑和抗體，但同時其循環(huán)血量少、血管較細(xì)等特點(diǎn)也給ECC 模型的建立造成了一些困難，下一步的研究還需要提供更精密的設(shè)備或耗材（如管路、氧合器等）以及更完善的圍實(shí)驗(yàn)期管理策略。憑借更穩(wěn)定的小鼠ECC 模型，未來有望結(jié)合數(shù)量眾多的小鼠疾病基因型進(jìn)行更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，為臨床上ECC 管理策略的進(jìn)一步完善提供更多指導(dǎo)性的意見。