巖白菜素對大鼠心肌細胞的缺氧/復氧損傷保護作用的機制研究

杜艷梅，田展松，譚延振，孫 陽

心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion, MI/R）是指心肌短暫缺血后，冠狀動脈再次開放造成的心肌細胞損傷[1]。我國急性心肌梗死死亡率呈逐年升高趨勢，再灌注治療能夠挽救瀕死的心肌細胞，保護心臟功能，是臨床有效的治療策略[2]。然而再灌注治療也有可能造成心臟損傷。MI/R 被證實是一種復雜的病理生理過程，其涉及氧化應激、炎癥反應、自噬、鐵死亡等多個方面。其中氧化應激能夠改變心肌細胞代謝狀態(tài)，增加心肌凋亡和壞死，降低心肌收縮力，導致心臟功能不全[3]。有研究指出，活性氧（reactive oxygen species, ROS）過量產生引起的氧化應激在MI/R 機制中起到重要作用[4]。因此，研究氧化應激和ROS 產生可能是治療MI/R 潛在方法。

近年來，多種植物來源的中藥成分已經被證明能夠治療心血管系統(tǒng)相關疾病。其中，巖白菜素（bergenin, Ber）又稱巖白菜內酯、紫金牛酸B、矮茶素等，是一種天然的次生代謝產物，廣泛存在于多種植物的各個部位[5]。據(jù)報道，Ber 具有多種藥理學活性，如抗炎、抗氧化、抗瘧疾和免疫調節(jié)等[6]。近年來對Ber 抗氧化作用的研究越來越多。沉默交配型信息調控2 同源物1（silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1）屬去乙酰化酶Sirtuin 蛋白家族，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙酰化酶，廣泛參與細胞內蛋白質去乙酰化。有研究表明，SIRT1能夠去乙?；揎椣掠蔚鞍渍{節(jié)細胞代謝，抑制氧化應激[7]。SIRT1 能抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶的活性，減少細胞內ROS 的產生，從而保護血管內皮功能，減少動脈粥樣硬化斑塊的產生[8]。SIRT1 能夠顯著抑制氧化應激過程，減輕局部炎癥反應。過氧化物酶體增殖物受體共激活因子-1α（peroxisome proliferator activate d receptorγcoactivator-la, PGC-1α）是一種細胞內重要的核受體轉錄激活因子，是線粒體能量代謝的重要調節(jié)因子[9]。SIRT1 還能通過去乙酰化修飾作用降低下游PGC-1α 的轉錄活性，進而抑制線粒體氧化反應的發(fā)生，減輕胰島素抵抗。因此，SIRT1 在心血管疾病中可能作為抗炎、抗氧化和抗凋亡作用的重要靶點。團隊前期研究結果表明，Ber 通過SIRT1 通路減少凋亡進而保護心肌細胞[10]。本研究旨在進一步探索Ber 對心肌損傷保護的分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)和模擬缺氧/復氧（simulate ischemia/reperfusion, SI/R）損傷模型構建 大鼠心肌細胞（H9c2）購于天承生物科技有限公司（中國，上海）。大鼠心肌細胞（H9c2）使用添加10%胎牛血清和1%雙抗（Hyclone，美國）的高糖培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）（Hyclone, 美國）在37℃、95%空氣和5%CO2混合氣體條件下培養(yǎng)。為了在體外環(huán)境中SI/R，大鼠心肌細胞先進行12 h 缺氧環(huán)境培養(yǎng)，而后進行2 h 常氧培養(yǎng)。缺氧培養(yǎng)時將上述DMEM 完全培養(yǎng)基替換為無血清和雙抗的基礎培養(yǎng)基。

1.2實驗分組 心肌細胞分為SI/R+PBS 組、SI/R+Ber 組和SI/R+Ber+EX-527 組。SI/R+PBS 組使用磷酸緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）干預作為對照組，SI/R+Ber 組加入含有100 μM 的Ber 培養(yǎng)基進行干預，SI/R+Ber+EX-527 組加入含有100 μM 的Ber 和50 nM EX-527 的培養(yǎng)基進行干預。為了驗證SIRT1 下游通路，本實驗采用了PGC-1α 抑制劑SR-18292（S8528，Selleck）抑制PGC-1α。實驗分為3 組：SI/R+PBS 組、SI/R+Ber 組、SI/R+Ber+SR-18292 組。SI/R+PBS 組和SI/R+Ber 組處理同前述。SI/R+Ber+SR-18292組加入含有100 μM 的Ber 和10 μM SR-18292 的培養(yǎng)基干預。

1.3實驗細胞活性噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）檢測 96 孔板中每孔加入5×103細胞并分別加入PBS、Ber、Ber+PGC-1α 抑制劑（SR-18292）進行干預。按照MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天，中國）說明書配制5 mg/ml 的MTT 溶液備用，各組細胞干預后每孔加入10 μl MTT 溶液，置于細胞培養(yǎng)箱內孵育4 h。然后每孔加入100 μl 甲瓚溶解液，混勻后置于細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育，直至光鏡下觀察紫色結晶消失。隨后在570 nm 處測定吸光度計算細胞活性。

1.4末端標記法（DNA terminal labeling, TUNEL）染色 為了檢測Ber 對大鼠心肌細胞凋亡的保護作用，本研究使用TUNEL 染色檢測大鼠心肌細胞發(fā)生凋亡的情況。各實驗組進行細胞爬片后，加入PBS 清洗3 次后，加入4%多聚甲醛固定30 min，棄去液體后再加入TritonX-100 通透15 min。PBS 清洗后每張爬片加入80 μl TUNEL 反應混合液于爬片上，置于濕盒中37℃條件下反應1 h。再次PBS 清洗，加入DAPI（10 μg/ml）染液50 μl 染色5 min。PBS 清洗后置于共聚焦顯微鏡（Olympus FV100，日本）下觀察并計數(shù)凋亡細胞。

1.5二氯熒光素（dichlorofluorescein, DCFH-DA）染色 2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯用來檢測細胞內ROS 的產生。按照DCFH-DA 試劑盒說明書使用無血清培養(yǎng)基將DCFH 稀釋為10 μmol/L 備用，棄去舊的細胞培養(yǎng)基，六孔板中每孔中加入1 ml稀釋后的DCFH-DA 溶液，將細胞板置于細胞培養(yǎng)箱中孵育20 min，加入無血清培養(yǎng)基清洗3 次，充分洗去未進入細胞的DCFH-DA。置于共聚焦顯微鏡（Olympus FV100，日本）下觀察并計算各組熒光強度。

1.6蛋白免疫印記（western blotting, WB）檢測各組細胞棄去舊的培養(yǎng)基，每孔加入2 ml PBS 清洗3 次，用細胞刮將細胞刮下并收集于1.5 ml 離心管中。離心后加入200 μl 含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細胞裂解液（康為世紀，中國），期間反復吹打使細胞裂解完全。充分離心后使用蛋白定量法試劑盒（碧云天，中國）檢測蛋白液濃度。每管加入50 μl 蛋白上樣緩沖液并混勻。水浴后進行WB 檢測。經過上樣、電泳、轉印、封閉，使用B 淋巴細胞瘤-2 基因（B cell lymphoma-2，Bcl-2）（26593-1-AP，Proteintech）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（14796S，CST）、SIRT1（2496S，CST）、PGC-1α（ab191838，abcam）和磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH）（AT0002，Enibody）抗體在4℃條件下孵育過夜。洗膜緩沖液清洗后，孵育二抗。再次清洗后使用化學發(fā)光系統(tǒng)（Molecular Imager ChemiDoc ? XRS+System; Bio-Rad Laboratories）進行曝光并記錄相應蛋白條帶情況。使用Image J 軟件（v2.0.0）分析條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。以GAPDH作為內參蛋白。

1.7乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase, LDH）釋放和丙二醛（malondialdehyde, MDA）檢測 各實驗組干預后每孔加入輔酶I 和混合緩沖液，置于37℃條件下孵育15 min，隨后加入2,4-二硝基苯肼并混合孵育15 min，再加入0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液室溫下靜置5 min，在450 nm 處測定吸光度計算LDH 活性。MDA 測定按照試劑盒說明書配制反應體系，離心管蓋子表面插入針頭，渦旋混勻后浸入95℃水浴中45 min 后流水沖洗降溫。4 000 rpm 離心10 min 后在532 nm 處檢測吸光度值。

1.8統(tǒng)計分析 本研究中數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 進行相關分析。符合正態(tài)分布資料以x±s 表示，比較實驗組間差異使用方差分析和Bonferroni 事后多重檢驗。ns 表示無統(tǒng)計學差異，以P＜ 0.05 認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1SIRT1 抑制劑減少Ber 導致的PGC-1α 表達量升高 WB 典型條帶見圖1A。統(tǒng)計結果表明，與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組Bcl-2 的表達水平升高（P＜ 0.001）, 與SI/R+Ber 組相比，S I/R+B e r+E x-5 2 7 組B c l-2 的表達水平降低（P＜ 0.001）（圖1B）；與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組Bax 的表達水平顯著降低（P＜ 0.001），與SI/R+Ber 組相比，SI/R+Ber+Ex-527 組Bax 的表達水平顯著升高（P＜ 0.001）（圖1C）；與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組PGC-1α 的表達水平明顯升高（P＜ 0.001），與SI/R+Ber 組相比，SI/R+Ber+Ex-527 組PGC-1α 的表達水平明顯降低（P＜ 0.001）（圖1D）。

圖1 巖白菜素通過激活SIRT1 上調PGC-1α 并抑制心肌細胞凋亡

2.2PGC-1α 抑制劑降低Ber 的大鼠心肌保護作用 與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組細胞活力顯著升高（P＜ 0.001），而給予SR-18292 處理后，細胞活力顯著降低（P＜ 0.01）（圖2A）；與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組LDH 釋放顯著降低（P＜ 0.001），而給予SR-18292 處理后，LDH 釋放顯著升高（P＜ 0.001）（圖2B）；與SI/R+PBS組相比，MDA 生成明顯減少（P＜ 0.01），而給予SR-18292 處理后，MDA 生成顯著升高（P＜ 0.01）（圖2C）。

圖2 阻斷巖白菜素保護大鼠心肌細胞凋亡并抑制脂質過氧化

2.3PGC-1α 抑制劑抑制Ber 減少大鼠心肌細胞凋亡 與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組大鼠心肌細胞的凋亡指數(shù)明顯降低（P＜ 0.01），而給予SR-18292 處理后，大鼠心肌細胞的凋亡指數(shù)明顯升高（P＜ 0.01）。見圖3。

2.4PGC-1α 抑制劑抑制Ber 減少大鼠心肌細胞的ROS 產生 與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber組ROS 的產生顯著減少（P＜ 0.05），而給予SR-18292 處理后，ROS 的產生明顯升高（P＜ 0.01）（圖4B）。

圖4 PGC-1α 抑制劑逆轉巖白菜素對心肌細胞氧化應激的保護作用

2.5PGC-1α 抑制劑減少抗凋亡分子和增加促凋亡分子的表達，但不影響SIRT1 的表達量 與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組Bcl-2 表達水平呈倍數(shù)升高（P＜ 0.001），而給予SR-18292 處理后，Bcl-2 表達水平與SI/R+PBS 組無差別（P＜ 0.001）（圖5B）； 與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組Bax 表達水平降低（P＜ 0.01）, 而給予SR-18292處理后，Bax 表達水平明顯升高（P＜ 0.05）（圖5C）。與SI/R+PBS 組相比，SI/R+Ber 組SIRT1 表達水平和給予SR-18292 處理后，SIRT1 表達水平無明顯變化（P＞ 0.05）（圖5D）。

圖5 SIRT1 激活下游PGC-1α 進而發(fā)揮抗凋亡作用

3 討論

近年來，已經有報道證實植物提取物在保護心血管系統(tǒng)和改善心臟疾病預后方面的作用。Ber是一種天然的中藥成分，存在于多種植物的不同部分。研究表明，Ber 具有抗炎、抗氧化、神經保護、免疫調節(jié)等作用。Li 等研究表明，Ber 能夠抑制轉化生長因子-b1 來減少氧化應激和細胞外基質累及，進而緩解博來霉素誘導的肺纖維化[11]。Yu 等的研究結果表明，Ber 能夠作為抗氧化劑和免疫抑制劑，抑制糖尿病患者的高水平氧化應激，提高抗氧化酶水平，減少視網(wǎng)膜厚度，進而改善糖尿病患者視網(wǎng)膜病變[12]。以上結果提示Ber 能通過減少氧化應激發(fā)揮作用。Lei 等的研究指出，Ber 能夠劑量依賴性地抑制NLRP3 炎性小體，減少白介素6、腫瘤壞死因子、白介素18 等細胞因子的釋放，下調caspase 家族相關蛋白，提示了Ber 在抗炎、抗凋亡方面的作用[13]。然而，Ber 在MI/R 的病理進程中的分子研究尚顯不足。研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)Ber 對心肌細胞具有保護作用，其是通過SIRT1 信號通路改善心肌細胞凋亡和氧化損傷發(fā)揮作用。

SIRT1 是一種廣泛存在于細胞的蛋白質去乙?；福軌虼呋M蛋白的去乙?；^程，進而參與多種生物學表現(xiàn)，如炎癥、線粒體能量產生、機體衰老、凋亡和癌變等。SIRT1 已經被證實在多種氧化應激相關疾病中扮演重要角色。使用SIRT1特異性激動劑SIRT1720 能夠抑制核轉錄因子-KB（nuclear factor-KB, NF-KB）信號轉導，減少血管緊張素酶Ⅱ誘導的細胞因子釋放，減少炎性細胞浸潤，進而減少炎癥和氧化損傷[14]。同樣地，在細胞中過表達SIRT1 能夠抑制還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性，減少ROS 生成和炎性因子表達。PGC-1α 被認為是SIRT1 下游的重要調節(jié)靶點。PGC-1α 是細胞內重要的核受體轉錄激活因子，能夠調控下游多個基因的轉錄，其中包括ROS 的表達。因此，激活SIRT1/PGC-1α 通路理論上能夠抑制ROS 的表達，從而減輕氧化應激損傷。心肌梗死是造成心肌細胞壞死的主要疾病，抗氧化、再灌注治療是臨床上廣泛采用的治療方案。然而，心肌在經歷缺血損傷后，短時間內再灌注帶來的細胞因子和炎性因子所導致的心肌細胞氧化應激損傷同樣值得關注。

本研究證實了Ber 能夠顯著降低Bcl-2 水平增加Bax 的表達，并降低凋亡指數(shù)。此結果表明Ber 能夠抑制大鼠心肌細胞凋亡。應用SIRT1 和PGC-1α 抑制劑能夠分別抵消Ber 對大鼠心肌細胞的保護作用，表明Ber 通過影響SIRT1 和PGC-1α 水平進而影響大鼠心肌細胞凋亡。應用SIRT1抑制劑后，大鼠心肌細胞中PGC-1α 水平下降，提示SIRT1 能夠上調下游PGC-1α 的表達。同樣地，應用SIRT1 抑制劑后，低水平表達的PGC-1α 能夠逆轉Ber 的抗凋亡作用。這說明Ber 能夠通過SIRT1/PGC-1α 通路保護大鼠心肌細胞免于凋亡。為進一步探究Ber 保護大鼠心肌細胞的作用機制，本研究進一步地檢測了心肌細胞內ROS和LDH 的產生情況。Ber 干預組中，LDH 的釋放顯著降低，并減少MDA 的生成，PGC-1α 抑制劑能夠逆轉Ber 的抗氧化作用。這些結果提示PGC-1α介導了Ber對大鼠心肌細胞的保護作用，而Ber 減少氧化應激、保護大鼠心肌細胞是通過增加PGC-1α 水平，降低ROS 濃度發(fā)揮作用。因此本研究提出Ber 能夠作為SI/R 治療的潛在藥物，通過揭示其作用機制，為此藥走向臨床奠定基礎，同時為心肌梗死患者再灌注治療后的心肌損傷提供更多臨床治療方案，以上結果表明，Ber具有潛在的治療價值。