史慎奎 祁東梅 王春芳 王玉芳 蔡爽
摘要:谷子遺傳資源多樣性的研究對(duì)谷子基礎(chǔ)研究與育種實(shí)踐具有重要意義。選擇高質(zhì)量的SSR 標(biāo)記對(duì)DUS(Distinctness-特異性、Uniformity-一致性和Stability-穩(wěn)定性)測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,不僅能夠解析標(biāo)準(zhǔn)品種的遺傳信息,也有助于對(duì)新育成品系進(jìn)行分子水平的遺傳多樣性分析。研究利用高質(zhì)量的20 個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)30 份不同地理來源的谷子DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,并構(gòu)建其指紋圖譜;同時(shí),利用該指紋圖譜的SSR 標(biāo)記對(duì)22 份春谷區(qū)和30 份夏谷區(qū)區(qū)試品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,旨在為谷子品種資源利用與遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明,20 對(duì)SSR 標(biāo)記在DUS 測(cè)試品種平均每對(duì)引物檢出的等位變異數(shù)為9.15 個(gè),20 個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.77。利用上述SSR 標(biāo)記對(duì)來自春谷區(qū)與夏谷區(qū)的共計(jì)52 份谷子區(qū)試品種進(jìn)行分子鑒定,春谷區(qū)的聚類分析結(jié)果顯示,22 份春谷區(qū)區(qū)試品種分為3 個(gè)主要的類群;而夏谷區(qū)的聚類分析結(jié)果顯示,30 份谷子夏谷區(qū)區(qū)試品種分為4 個(gè)類群,但難以區(qū)分春谷、夏谷區(qū)區(qū)試品種。研究結(jié)果厘清了谷子DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種和區(qū)試品系間的遺傳相似性。
關(guān)鍵詞:谷子;指紋圖譜;遺傳多樣性;DUS 測(cè)試;區(qū)試品種
中圖分類號(hào):S515 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1002?2481(2024)01?0010?09
谷子是我國北方旱作農(nóng)業(yè)區(qū)重要的特色作物之一,距今已有8 700 a 的栽培歷史。其具有優(yōu)良的抗旱、節(jié)水特性,是旱地農(nóng)業(yè)的穩(wěn)產(chǎn)作物,也是應(yīng)對(duì)未來干旱形勢(shì)的戰(zhàn)略儲(chǔ)備作物[1-2]。我國是谷子的起源中心,谷子種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富[3]。因此,利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜,并研究谷子的遺傳多樣性,有助于谷子遺傳基礎(chǔ)的解析與種質(zhì)資源的有效利用,對(duì)谷子的種質(zhì)資源創(chuàng)新與遺傳改良具有重要意義[4-7]。
SSR(Simple sequence repeat)標(biāo)記由于其在基因組間分布廣泛,表現(xiàn)出共顯性與重復(fù)性好、多態(tài)性高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、檢測(cè)手段簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì),從而被廣泛應(yīng)用于作物品種資源的指紋圖譜構(gòu)建、遺傳關(guān)系分析等研究[8-9]。JIA 等[10]利用自主開發(fā)的15 個(gè)EST-SSR 標(biāo)記對(duì)12 份谷子進(jìn)行遺傳多樣性分析,其中,4 個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)性,共檢測(cè)到10 個(gè)等位變異,由于EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性豐富性較差,不適于作遺傳多樣性分析。賈小平等[11]利用37 個(gè)SSR 標(biāo)記在來自中國、印度和俄羅斯的共計(jì)40 份谷子品種中共檢測(cè)出228 個(gè)等位變異,平均等位變異位點(diǎn)為6.16 個(gè),多態(tài)性信息含量(PIC)為0.697,顯示了SSR 標(biāo)記在分析谷子遺傳變異方面的有效性。對(duì)于目前谷子DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種來說還未從分子標(biāo)記水平上進(jìn)行遺傳多樣性分析,也未篩選出一套用于標(biāo)準(zhǔn)品種和區(qū)試品種的較為高效應(yīng)用性SSR 標(biāo)記。
本研究使用篩選到的20 個(gè)高質(zhì)量的SSR 標(biāo)記對(duì)30 份谷子DUS 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建,同時(shí)對(duì)來自春谷區(qū)和夏谷區(qū)的52 份區(qū)試品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期能夠?yàn)閰^(qū)試材料的遺傳相似性分析和后續(xù)參加DUS 測(cè)試奠定基礎(chǔ),亦能夠?yàn)楣茸悠贩N資源管理與利用、育種實(shí)踐、品種審定及新品種保護(hù)等方面提供一定的科學(xué)依據(jù)與技術(shù)基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 試驗(yàn)材料
本研究利用30 份谷子DUS 測(cè)試品種(表1)構(gòu)建DNA 指紋圖譜,并利用該指紋圖譜對(duì)22 份春谷區(qū)試品種和30 份夏谷區(qū)試品種進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)(表2)。
1.2 基因型檢測(cè)
采用CTAB 法提取谷子基因組DNA,使用紫外分光光度法測(cè)定DNA 濃度,稀釋至20 μg/L。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在eppendorf 公司PCR 儀上進(jìn)行,反應(yīng)總體積為20 μL,包括DNA 模板(20 ng/μL)2 μL,2×Es TaqMasterMix 10 μL,正反向引物各1 μL,去離子水6 μL。擴(kuò)增產(chǎn)物在6% 變性聚丙烯酰胺凝膠以50 W 恒功率電泳分離,用硝酸銀法對(duì)凝膠進(jìn)行染色、顯影并拍照。
本研究選用20 個(gè)SSR 標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性檢測(cè),所有SSR 標(biāo)記分布在谷子的1~9 號(hào)染色體上(表3)[11]。
1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
用Excel 的形式,將清晰的條帶轉(zhuǎn)換成數(shù)字形式,形成“01”矩陣(要求:無擴(kuò)增條帶記為“0”,有擴(kuò)增條帶記為“1”)[12-13]。通過POPGENE V1.32[14]和Powermarker[15]軟件來分析基因型數(shù)據(jù),從而獲得SSR 標(biāo)記位點(diǎn)的有效等位變異數(shù)(Ne)、香農(nóng)-韋弗(Shannon-Weaver)指數(shù)(I)、觀測(cè)核苷酸雜合度(Ho)、期望核苷酸雜合度(He)、Nei?s 多樣性指數(shù)以及等位變異數(shù)Na[15]。通過NTSYS(Version 2.10e)軟件來分析基因型數(shù)據(jù),從而獲得30 份谷子DUS測(cè)試品種的指紋圖譜以及區(qū)試品種間遺傳關(guān)系的聚類圖[16]。
2 結(jié)果與分析
2.1 DUS 測(cè)試品種指紋圖譜構(gòu)建與遺傳多樣性分析
本研究使用的20 個(gè)SSR 標(biāo)記覆蓋谷子全基因組的9 條染色體,每條染色體的標(biāo)記數(shù)量為2~3 個(gè)。SSR 引物在谷子DUS 測(cè)試品種中的擴(kuò)增結(jié)果顯示,全部引物在多數(shù)材料中均能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、清晰的擴(kuò)增,例如,p80 和b165 在30 份谷子材料中僅有1 份材料未能實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增,其余材料均能有效擴(kuò)增(圖1),分別檢測(cè)出等位位點(diǎn)4 個(gè)和6 個(gè),所有SSR 標(biāo)記多態(tài)性信息含量(PIC)分別為0.65 和0.73,b185 的PIC 值最低,為0.47,共測(cè)出等位位點(diǎn)數(shù)5 個(gè),而b247 共檢測(cè)出等位位點(diǎn)數(shù)15 個(gè),PIC 值最高,為0.91(表4)。
每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)出的等位變異數(shù)為5~15 個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出的等位變異數(shù)為9.15 個(gè),每個(gè)位點(diǎn)獲得有效等位變異數(shù)(Ne)為2.1~12.2 個(gè),香農(nóng)-韋弗(Shannon-Weaver)指數(shù)(I)分布范圍為1.00~2.59,所有SSR 標(biāo)記多態(tài)性信息含量(PIC)為0.47~0.91,平均值為0.77(表4)。
使用其中20 對(duì)SSR 標(biāo)記即可對(duì)30 份谷子DUS 測(cè)試品種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建,結(jié)果表明,僅用前16 個(gè)SSR 標(biāo)記即可將30 份谷子品種進(jìn)行區(qū)別鑒定(圖2)。
進(jìn)一步對(duì)DUS 測(cè)試品種進(jìn)行遺傳聚類分析,結(jié)果顯示(圖3),可以將30 份品種分為兩大類群,類群I 包括粱谷等19 份品種,類群Ⅱ包括佛手水等11 份品種;30 份谷子DUS 標(biāo)準(zhǔn)品種間遺傳相似系數(shù)(genetic similarity,GS)值變動(dòng)于0.82~0.97,其中I 組內(nèi)遺傳相似度最高的2 個(gè)品種為W67 與紅十里香,II 組內(nèi)遺傳相似程度最高的為2 個(gè)農(nóng)家品種貓?zhí)愎扰c兔蹄谷。
2.2 指紋圖譜的應(yīng)用
利用上述構(gòu)建DUS 測(cè)試品種指紋圖譜的分布在谷子不同染色體上的20 個(gè)SSR 標(biāo)記,對(duì)春谷區(qū)試品種和夏谷區(qū)試品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。首先對(duì)全部春谷區(qū)和夏谷區(qū)區(qū)試品種52 份材料進(jìn)行整體聚類分析,未見其明顯分為兩大類,也暗示春谷區(qū)材料和夏谷區(qū)材料之間具有共同的遺傳基礎(chǔ),可能與跨生態(tài)區(qū)域的種質(zhì)資源交流較為頻繁有關(guān)(圖4)。
進(jìn)一步對(duì)22 份春谷區(qū)區(qū)試品種聚類,分為3 個(gè)主要的類群,即I、II 和III(圖5-A),I 組包括2 個(gè)品系200732-1 與龍11-7004,III 組包括長農(nóng)40 號(hào)、長農(nóng)43 號(hào)、長農(nóng)44 號(hào)、太選14 號(hào)和太選16 號(hào)等5 個(gè)品種,均為來自山西的品系;II 組中包括15 個(gè)品系,甘肅的2 個(gè)品系遺傳相似度最高,與農(nóng)家品系綠香谷親緣關(guān)系較近;2 個(gè)農(nóng)家品系黃旗谷和峰紅谷遺傳相似度較高,與育成品種承谷9 號(hào)遺傳關(guān)系較近;來自東北的品系如吉2050、朝谷58、朝雜谷1 號(hào)等與來自山西的品系聚在一起。
夏谷區(qū)的聚類分析顯示,30 份夏谷區(qū)區(qū)試品種分為4 個(gè)類群,即I、II、III 和IV(圖5-B),其中I 組包括7 個(gè)品系,II 組包括4 個(gè)品系,III 組包括5 個(gè)品系,IV 組包括14 個(gè)品系。遺傳相似度最高的為來自保定的2 個(gè)品系保200302 和保213,其次是鄭07-1 與滄372、晉谷28 號(hào)與冀谷25 和M1508 和航谷8 號(hào)相似度較高。
3 結(jié)論與討論
谷子育成品種的遺傳多樣性分析是發(fā)掘谷子遺傳改良的基礎(chǔ)[2],對(duì)谷子DUS 測(cè)試品種的遺傳多樣性分析有利于對(duì)其遺傳基礎(chǔ)的剖析[13,17],也有助于DUS 測(cè)試品種的應(yīng)用。本研究選用20 對(duì)分布于谷子9 條染色體上的SSR 引物對(duì)30 份不同地理來源的谷子DUS 測(cè)試品種進(jìn)行分析,構(gòu)建了谷子的指紋圖譜。每個(gè)標(biāo)記檢測(cè)出的等位變異數(shù)為5~15 個(gè),平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)出的等位變異數(shù)為9.15 個(gè),平均PIC 為0.77。本研究結(jié)果略低于朱學(xué)海等[18]報(bào)道的用21 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)120 個(gè)谷子品種進(jìn)行鑒定,其檢測(cè)出的平均等位變異數(shù)為14.5 個(gè)/位點(diǎn),平均PIC 值為0.809 的結(jié)果,但高于賈小平等[11]報(bào)道的用37 個(gè)SSR 標(biāo)記檢測(cè)40 個(gè)谷子品種,其檢測(cè)出的平均等位變異數(shù)為6.16 個(gè)/位點(diǎn),平均PIC值為0.697 的結(jié)果;同時(shí)遠(yuǎn)高于JIA 等[10] 用15 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)12 個(gè)谷子品種進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)其平均等位變異數(shù)為2.5 個(gè)/位點(diǎn),也高于楊天育等[4]報(bào)道的用60 對(duì)引物檢測(cè)來自我國北部高原生態(tài)區(qū)的20 個(gè)谷子品種,其檢測(cè)出的平均等位變異數(shù)為2.71 個(gè)/位點(diǎn)。產(chǎn)生這一結(jié)果的原因之一可能是DUS 測(cè)試品種存在較大的地理來源差異,另外,也可能是由于使用的SSR 標(biāo)記具有豐富的遺傳變異,造成在DUS 測(cè)試品種的指紋圖譜構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)的谷子遺傳多樣性較高[19]。
基于20 個(gè)SSR 標(biāo)記分析的春谷區(qū)與夏谷區(qū)區(qū)試品種的遺傳相似性和聚類分析結(jié)果顯示,春谷區(qū)22 份區(qū)試品種聚成三大類,其中C 組來自山西的品種聚在一起,說明該組品種的培育存在地域性,可能的原因是目前在育種過程中針對(duì)關(guān)鍵育種材料使用頻率較高,尤其是對(duì)谷子種質(zhì)資源中重點(diǎn)骨干親本利用過于集中,造成在特定生態(tài)區(qū)域內(nèi)新育成的谷子品種(品系)遺傳背景較相似,遺傳相似程度較高,遺傳多樣性降低[2]。針對(duì)夏谷區(qū)30 份區(qū)試品種的鑒定發(fā)現(xiàn),不同地理來源的品種聚在一起,可能的原因是由于不同的育種單位之間存在的育種材料的交流與共享,說明在夏谷區(qū)的育種過程中對(duì)資源的利用程度與品種資源的交流比較頻繁[15]。因此,在利用SSR 標(biāo)記對(duì)谷子品種進(jìn)行遺傳多樣性分析的同時(shí),還需要更多方面的證據(jù)包括農(nóng)藝性狀方面的多態(tài)性鑒定,才能更清晰的了解所鑒定的谷子品種的遺傳構(gòu)成,也為谷子品種資源的利用提供支持[16,19-20]。
目前,利用SSR 指紋圖譜對(duì)品種鑒定和分析的方法已經(jīng)在谷子常規(guī)品種中研究與應(yīng)用較多[13,21]。本研究首次將此方法用在谷子DUS 測(cè)試品種與區(qū)試品系分子鑒定中,發(fā)現(xiàn)利用16 個(gè)SSR 標(biāo)記可將30 份谷子DUS 測(cè)試品種成功區(qū)分開,表明利用SSR 標(biāo)記對(duì)谷子DUS 測(cè)試品種進(jìn)行品種鑒定與遺傳多樣性分析是一種有效手段[22]。因而,本研究也為包括新育成品系在內(nèi)的其他谷子分子指紋圖譜的建立與品種的分子鑒定提供了借鑒。
本研究利用高質(zhì)量的20 個(gè)SSR 標(biāo)記對(duì)DUS測(cè)試品種進(jìn)行指紋鑒定,平均每個(gè)標(biāo)記檢出的等位變異數(shù)為9.15 個(gè),20 個(gè)位點(diǎn)的平均多態(tài)性信息含量(PIC)為0.77;同時(shí),應(yīng)用上述SSR 標(biāo)記對(duì)來自春谷區(qū)與夏谷區(qū)的共計(jì)52 份谷子區(qū)試品種分別進(jìn)行了分子鑒定,厘清了品系間的遺傳相似性,為谷子品種資源利用與遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn):
[1] 刁現(xiàn)民. 中國谷子產(chǎn)業(yè)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2011:21.
DIAO X M. Millet industry and industrial technology system inChina[M]. Beijing:China Agricultural Science and TechnologyPress,2011:21.
[2] AUSTIN D F. Fox-tail millets(Setaria:Poaceae)-abandonedfood in two hemispheres[J]. Economic Botany,2006,60(2):143-158.
[3] BARTON L,NEWSOME S D,CHEN F H,et al. Agriculturalorigins and the isotopic identity of domestication in NorthernChina[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,2009,106(14):5523-5528.
[4] 楊天育,牟平,孫萬倉,等. 中國北部高原地區(qū)谷子品種遺傳差異的SSR 分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2010,30(9):1786-1791.
YANG T Y,MOU P,SUN W C,et al. Genetic variation of fox?tail millet cultivars in north plateau region of China by SSRmarkers[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2010,30(9):1786-1791.
[5] 田伯紅. 谷子地方品種和育成品種的遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(2):224-228.
TIAN B H. Genetic diversity of Landrace and improved culti?vars in foxtail millet[J]. Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(2):224-228.
[6] 李志江,刁現(xiàn)民. 谷子分子標(biāo)記與功能基因組研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2009,11(4):16-22.
LI Z J,DIAO X M. Research progress on molecular marker andfunctional genomic of foxtail millet,Setaria italica beauv[J]. Jour?nal of Agricultural Science and Technology,2009,11(4):16-22.
[7] JIA G Q,SHI S K,WANG C F,et al. Molecular diversity andpopulation structure of Chinese green foxtail(Setaria viridis(L.) Beauv.)revealed by microsatellite analysis[J]. Journal ofExperimental Botany,2013,64(12):3645-3656.
[8] WANG C F,CHEN J F,ZHI H,et al. Population genetics of fox?tail millet and its wild ancestor[J]. BMC Genetics,2010,11(1):90.
[9] WANG C F,JIA G Q,ZHI H,et al. Genetic diversity and popu?lation structure of Chinese foxtail millet(Setaria italica(L.)Beauv.)landraces[J]. G3,2012,2(7):769-777.
[10] JIA X P,SHI Y S,SONG Y C,et al. Development of ESTSSRin foxtail millet(Setaria italica)[J]. Genetic Resourcesand Crop Evolution,2007,54(2):233-236.
[11] 賈小平,譚賢杰,李永祥,等. 用SSR 標(biāo)記研究谷子品種的遺傳多樣性[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,31(4):633-638.
JIA X P,TAN X J,LI Y X,et al. A study on the genetic diver?sity of foxtail millet cultivars by SSR markers[J]. Acta Agricul?turae Universitatis Jiangxiensis,2009,31(4):633-638.
[12] JIA X P,ZHANG Z B,LIU Y H,et al. Development and ge?netic mapping of SSR markers in foxtail millet(Setaria italica(L.) P. Beauv.)[J]. Theoretical and Applied Genetics,2009,118(4):821-829.
[13] 朱建楚. 基于PCR 標(biāo)記的糜子遺傳多樣性分析[D]. 楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2005.ZHU J C. Genetic diversity analysis of broomcorn millet basedon PCR markers[D]. Yangling:Northwest A & F University,2005.
[14] YEH F C,YANG R C,BOYLE T,et al. POPGENE, ver?sion 1.32:the user friendly software for population geneticanalysis[CP]. Molecular Biology and Biotechnology Centre,University of Alberta,Edmonton,AB,Canada,1999.
[15] LIU K J,MUSE S V. PowerMarker:an integrated analysis en?vironment for genetic marker analysis[J]. Bioinformatics,2005,21(9):2128-2129.
[16] ROHLF F J. NTSYS-pc-numerical taxonomy and multivariateanalysis system[CP]. Exeter Software,Setauket,New York. 2000.
[17] 王姍姍,張寧,王凱璽,等. 中國遼西地區(qū)谷子品種遺傳多樣性的SSR 分析[J]. 分子植物育種,2015,13(5):1091-1097.
WANG S S,ZHANG N,WANG K X,et al. Genetic diversityof foxtail millet cultivars in western Liaoning Province revealedby SSR markers[J]. Molecular Plant Breeding,2015,13(5):1091-1097.
[18] 朱學(xué)海,張艷紅,宋燕春,等. 基于SSR 標(biāo)記的谷子遺傳多樣性研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),2010,11(6):698-702.
ZHU X H,ZHANG Y H,SONG Y C,et al. Genetic diversityanalysis of foxtail millet accessions revealed by SSR markers[J]. Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(6):698-702.
[19] LE THIERRY D?ENNEQUIN M,PANAUD O,TOUPANCEB,et al. Assessment of genetic relationships between Setariaitalica and its wild relative S. viridis using AFLP markers[J].Theoretical and Applied Genetics,2000,100(7):1061-1066.
[20] LI W,ZHI H,WANG Y F,et al. Assessment of genetic rela?tionship of foxtail millet with its wild ancestor and close rela?tives by ISSR markers[J]. Journal of Integrative Agriculture,2012,11(4):556-566.
[21] 于淑婷,楊延兵,陳二影,等. 華北夏谷區(qū)近30 年來主要谷子育成品種農(nóng)藝和品質(zhì)性狀演變分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,49(2):15-19.
YU S T,YANG Y B,CHEN E Y,et al. Evolution of agro?nomic and quality traits of main foxtail millet varieties in NorthChina bred in past thirty years[J]. Shandong Agricultural Sci?ences,2017,49(2):15-19.
[22] 董玉琛,曹永生. 糧食作物種質(zhì)資源的品質(zhì)特性及其利用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2003,36(1):111-114.
DONG Y C,CAO Y S. Quality characteristics of germplasmresources of food crops and their utilization[J]. Scientia Agricul?tura Sinica,2003,36(1):111-114.