不同煙熏時間雞腿肉香氣化合物與危害物及相關(guān)前體物研究

高榮美 張德權(quán) 時浩楠 王振宇 張春江

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全收貯運(yùn)管控重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100193）

熏雞的煙熏味是其感官特征的關(guān)鍵因素，可影響消費(fèi)者接受度和購買意向。熏材加熱分解產(chǎn)生的香氣化合物使肉制品具有獨(dú)特的煙熏風(fēng)味［1］。但在傳統(tǒng)煙熏過程中，脂類、蛋白質(zhì)和碳水化合物間的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)不僅可產(chǎn)生香氣化合物，還會產(chǎn)生危害物，如多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）、雜環(huán)胺（heterocyclic amines，HAs）和晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）等。以上化合物均是誘發(fā)癌癥的重要成分，會影響消費(fèi)者健康［2-4］?，F(xiàn)有研究集中在熏雞風(fēng)味生成與保持、危害物調(diào)控等方面，但關(guān)于熏雞風(fēng)味成分與危害物伴生關(guān)系的研究鮮有報道。

煙熏肉制品香氣化合物組成以酚類為主，呋喃、吡嗪類等物質(zhì)為輔［5］。熏雞加工方式各異，Yang等［6］發(fā)現(xiàn)聊城熏雞含酚類物質(zhì)較多，溝幫子熏雞與金山熏雞含呋喃類物質(zhì)較多，這表明熏制方式影響特征香氣化合物的形成。但與其他加工方式相比，煙熏可導(dǎo)致PAHs的生成。Li等［7］發(fā)現(xiàn)，因表皮暴露在煙熏環(huán)境中會吸附更多危害物，熏雞皮中PAH4顯著高于肉中（P＜0.05）。另外，脂肪的中間底物游離脂肪酸對香氣化合物有積極貢獻(xiàn)，但脂肪含量與PAHs的產(chǎn)生呈正相關(guān)，且熏制過程中游離氨基酸與還原糖反應(yīng)形成Amadori化合物，該類物質(zhì)進(jìn)一步熱解形成PAHs［8］。Zhang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，香氣化合物種類與HAs相關(guān)，煙霧中的酸沉積于肉中影響肉的pH值，而pH值可影響2-氨基-3，4-二甲基咪唑［4，5-f］-喹啉（2-amino-3，4-dimethylimidazo［4，5-f］quinoline，MeIQ）和2-氨基-3-甲基咪唑［4，5-f］-喹啉（2-amino-3-methylimidazo［4，5-f］quinoline，IQ）的形成。許多研究表明，肌肉中的游離氨基酸、還原糖也是HAs、AGEs的主要前體［10-11］。雖然已有研究揭示了不同煙熏次數(shù)對熏制雞腿香氣化合物和HAs含量的影響［12］，但在一定溫度下，熏制時間對熏雞香氣化合物和HAs、AGEs、PAHs形成及其前體物特征的影響尚不清楚。

因此，本試驗以聊城熏雞為研究對象，選取熏制時間點(diǎn)0（未熏制）、2、4、6、8、10和12 h的雞腿肉為試驗材料，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用儀（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，HSSPME-GC-O-MS）、超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（ultra-pressure liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，UPLC-MS/MS）、液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）和離子色譜等技術(shù)探究熏制時間對熏雞腿關(guān)鍵香氣化合物、HAs、AGEs、PAH4及相關(guān)前體物的影響，旨在優(yōu)化熏雞熏制時間參數(shù)，明確香氣化合物與危害物的伴生關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

聊城熏雞，購于山東省聊城市龍勝齋魏老六魏氏熏雞有限公司。另外，選擇月齡2—3個月、大小基本一致的聊城肉雞，經(jīng)前處理及鹵煮后，采用溫熏法于60 ℃左右熏制，熏材為松柏。取熏制時間0、2、4、6、8、10和12 h（共7個時間點(diǎn)）的熏雞各6只，經(jīng)密封真空包裝、冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗室，取雞腿肉進(jìn)行攪碎，置于-80 ℃保存。

HAs標(biāo)準(zhǔn)品IQ、MeIQ、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑［4，5-b］吡啶（2-amino-1-methyl-6-phenyli-midazo［4，5-b］pyridine，PhIp）、2-氨基-3，8-二甲基咪唑［4，5-f］-喹喔啉（2-amino-3，8-dimethylimidazo［4，5-f］quinoxaline，MeIQx）、2-氨基-3，7，8-三甲基咪唑［4，5-f］-喹喔啉（2-amino-3，7，8-trimethylimidazo［4，5-f］quinoxaline，7，8-DiMeIQx）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑［4，5-f］-喹喔啉（2-amino-3，4，8-trimethylimidazo［4，5-f］quinoxaline，4，8-DiMeIQx）、2-氨基-3，4，7，8-四甲基-3H-咪唑［4，5-f］喹喔啉（2-amino-3，4，7，8-tetramethyl-3H-imidazo［4，5-f］quinoxaline，4，7，8-TriMeIQx）、2-氨基-9H-吡啶并［2，3-b］吲哚（2-amino-9H-pyrido［2，3-b］indole，AαC）、2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并［2，3-b］吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido［2，3-b］indole，MeAαC）、2-氨基-6-甲基二吡啶并［1，2-a：3’，2’-d］咪唑（2-amino-6-methyldipyrido［1，2-a：3’，2’-d］imidazole，Glu-P-1）、2-氨基-二吡啶并［1，2-a：3’，2’-d］咪唑（2-amino-dipyrido［1，2-a：3’，2’-d］imidazole，Glu-P-2）、3-氨基-1，4-二甲基-5H吡啶并［4，3-b］吲哚（3-amino-1，4-dimethyl-5H-pyrido［4，3-b］indole，Trp-P-1）、3-氨基-1-甲基-5H-吡啶［4，3-b］吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido［4，3-b］indole，Trp-P-2）、1-甲基-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚（1-methyl-9H-pyrido［3，4-b］indole，Harman）和9H-吡啶并［3，4-b］吲哚（9H-pyrido［3，4-b］indole，Norharman），加拿大TRC公司，純度＞99%；AGEs標(biāo)準(zhǔn)品羧甲基賴氨酸（Nε-carboxymethyl lysine，CML）、羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethyl lysine，CEL）、甲基乙二醛氫咪唑酮（methylglyoxal-derived hydroimidazolinone，MG-H1）和PAH4標(biāo)品苯并［a］蒽（benzo［a］anthracene，B［a］A）、苯并［b］熒蒽（benzo［b］fluoranthene，B［b］F）、苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，B［a］P）和?（chrysene，Chr），北京瀚誠生物科技有限公司，純度＞99%；甲醇、乙腈、正己烷、乙酸銨（色譜級），美國賽默飛世爾公司；BondElutC18固相萃取柱（167 mg·mL-1）、Bond Elut苯基磺酸固相萃取柱（167 mg·mL-1）、Bond Elut-SI、Bond Elut-ENV固相萃取柱、Bond Elut QuECHERS萃取包、Bond Elut QuECHERS dSPE試劑盒，安捷倫科技（中國北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

75 μm CAR/PDMS萃取針與SPME進(jìn)樣器，美國Supelco公司；6470LC/TQ液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀、7890B/5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜、ICS-3000離子色譜儀，美國Agilent公司；LGJ-25C冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；CR22GII高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；TTL-DCII氮吹儀，北京同泰科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 揮發(fā)性香氣化合物HS-SPME-GC-O-MS分析 參考Liu等［13］的方法并稍作修改。稱取3.0 g絞碎肉樣于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，加入1.0 μL（1.70 mg·mL-1）2-甲基-3-庚酮內(nèi)標(biāo)。樣品預(yù)熱10 min后通過75 μm CAR/PDMS萃取針吸附45 min，解析3 min。樣品預(yù)熱溫度55 ℃，萃取溫度55 ℃，解吸溫度250 ℃。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物對香氣化合物半定量分析，采用質(zhì)譜庫檢索（mass spectral library search，MS）和嗅聞（olfactory，O）對香氣化合物半定性分析。MS：樣品經(jīng)氣相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測器，通過NIST2.0數(shù)據(jù)庫對香氣化合物檢索定性。O：物質(zhì)的質(zhì)譜峰與氣味同時出現(xiàn)在質(zhì)譜儀上，記錄每個樣品的保留時間、氣味描述和每種物質(zhì)的味道強(qiáng)度（弱、中、強(qiáng)）。另外，OAVs為某揮發(fā)性化合物的含量與其在水中的氣味閾值之比。水中物質(zhì)的氣味閾值通過參考資料獲得［5，14-15］。OAVs＞1的香氣化合物為強(qiáng)效氣味物質(zhì)，對食品風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，也稱為關(guān)鍵香氣化合物［16］。

使用GC-MS測定香氣化合物含量，毛細(xì)管柱為DB-Wax（60 m×320 μm×0.25 μm），前進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣（He）流速1.0 mL·min-1，不分流模式進(jìn)樣，升溫程序：初始柱溫40 ℃，保持3 min，以2 ℃·min-1升至70 ℃，以3 ℃·min-1升至130 ℃，再以10 ℃·min-1升至230 ℃，保持10 min。

1.3.2 HAs含量測定 HAs含量測定參考Ding等［17］的方法并稍作修改。采用QuECHERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法提取肉中HAs。稱取2 g肉樣于50 mL離心管中、加入1塊陶瓷均質(zhì)石和10 mL去離子水，振蕩20 min。加入10 mL含有1%醋酸的乙腈溶液，振蕩15 min，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g無水醋酸鈉的萃取包并振蕩1 min，4 ℃、4 500 r·min-1離心10 min；取6 mL上清液加入含有900 mg的無水硫酸鎂、300 mg的丙基乙二胺和300 mg封端的離心管中，離心5 min。取1 mL上清液氮吹至近干，再用200 μL甲醇溶解后0.22 μm尼龍濾膜過濾。用UPLC-MS/MS測定HAs含量，使用Zorbax SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱。柱溫25 ℃；流動相A為10 mmol·L-1醋酸銨溶液（pH值2.9），B為100%乙腈；洗脫梯度：0～8 min為85% A，15% B；8～13 min為45% A，55% B；13～30 min為91% A，9% B。

1.3.3 AGEs含量測定 AGEs含量測定參考Sun等［18］的方法并稍作修改。稱取200 mg凍干肉樣于10 mL離心管中、加入2 mL 0.2 mol·L-1硼酸鹽緩沖液（pH值9.2）和400 μL 2 mol·L-1硼氫化鈉溶液，4 ℃反應(yīng)8 h，加入4 mL 6 mol·L-1HCl溶液后于105 ℃酸解24 h。取1 mL于60～80 ℃烘箱中濃縮至近干，加入2 mL超純水復(fù)溶，取1 mL復(fù)溶液過0.22 μm尼龍濾膜。MCX固相萃取柱分別用3 mL甲醇、2%甲酸水溶液活化和平衡，加入樣品后再分別用其除雜，用2 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫并收集洗脫液，氮吹至近干后用1 mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm尼龍濾膜。用UPLC-MS/MS測定AGEs含量，使用BEH Amide（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱。柱溫35 ℃，流動相A為5 mmol·L-1的乙酸銨和0.1%甲酸的水溶液，B為乙腈；流速0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積3 μL。

1.3.4 PAH4含量測定 PAH4含量測定參考屈巖峰等［19］的方法并稍作修改。稱取4 g熏肉樣于50 mL離心管A中，加入10 mL正己烷后勻漿，渦旋3 min，超聲15 min，4 500 r·min-1、4 ℃離心5 min。取上清液倒入離心管B中，加入10 mL正己烷于A管中重復(fù)一次，將提取液合并于B管中。串聯(lián)固相萃取小柱Bond Elut ENV和Bond Elut SI，用10 mL正己烷活化萃取柱后加入樣品，再用2 mL正己烷清洗B管中殘留液，最后用5 mL洗脫液（正己烷與二氯甲烷1∶1混合）洗脫并收集洗脫液，用1 mL乙腈復(fù)溶氮吹后過0.22 μm尼龍濾膜。用HPLC測定PAH4含量，使用PAH C18反相鍵合固定相色譜柱。柱溫25 ℃，流動相A為超純水，B為乙腈。洗脫梯度：0～7 min為20% A，80% B；7～16 min為15% A，85% B；16～24 min為0% A，100% B；24～30 min為20% A，80% B。

1.3.5 水分、脂肪含量測定 水分和脂肪含量測定分別參考GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》［20］（直接干燥法）和GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》［21］（索氏抽提法）。

1.3.6 肌酐/肌酸含量測定 肌酸和肌酐含量測定參考文娜等［22］的方法并稍作修改。將2 g樣品與10 mL預(yù)冷的0.4 mol·L-1高氯酸混合后勻漿，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，收集上清。按體積1∶1加入0.67 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液中和（pH值6.5）。取1 mL上清液過0.22 μm尼龍膜，用HPLC測定肌酸和肌酐含量。使用ZOBAX NH2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.05 mol·L-1NaH2PO4（pH值5.0），進(jìn)樣量10 μL。柱溫25 ℃，檢測波長210 nm，流速1.0 mL·min-1。

1.3.7 還原糖含量測定 還原糖含量測定參考劉歡［14］的方法并稍作修改。稱取4 g樣品于50 mL離心管中，加入10 mL超純水后勻漿，超聲30 min，于4 ℃、10 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液加超純水定容至10 mL，取1 mL樣液加入1 mL水楊酸，混勻，4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，取1 mL混合液氮吹至近干，超純水定容至10 mL后過0.22 μm尼龍濾膜，用離子色譜儀測定還原糖含量。

1.3.8 游離氨基酸含量測定 游離氨基酸提取參考劉登勇等［23］的方法并稍作修改。稱取4 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2%甲酸水溶液，超聲1 h，每10～15 min渦旋一次?；旌弦河? ℃、10 000 r·min-1離心15 min。取上清液，加入2 mL正己烷，混合振蕩后去除有機(jī)層，取1 mL混合液過0.22 μm尼龍濾膜，使用UPLC-MS/MS測定。氨基酸含量以濕基計。

1.3.9 游離脂肪酸含量測定 游離脂肪酸提取根據(jù)劉歡等［14］的方法。稱取3 g肉樣，加入30 mL氯仿-甲醇混合溶液（2∶1）后勻漿，靜置1 h、過濾，加入6 mL飽和NaCl后靜置分層，取下層清液，加4 g無水硫酸鈉除水分，過濾，于45 ℃水浴下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得到脂質(zhì)樣品。用3 mL二氯甲烷活化氨丙基硅膠小柱，將經(jīng)4 mL 0.02%二丁基羥基甲苯/正己烷處理的脂肪溶液注入小柱，用5 mL 2%乙醚/乙酸溶液洗脫并收集洗脫液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?0 μL十一酸甲酯和1 mL（13%）三氟化硼甲醇溶液，于50 ℃水浴甲酯化20 min，加入4 mL正己烷溶液提?。▌?0 s，靜置1 h），取樣液1 μL進(jìn)樣分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、鄧肯式多重差異分析（P＜0.05表示差異顯著），每個試驗至少重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Origin 2023b軟件進(jìn)行繪圖和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熏雞揮發(fā)性香氣化合物

對不同熏制時間條件下熏雞腿肉進(jìn)行風(fēng)味定性分析，共鑒定出67種香氣化合物，包括酚、醛、醇、酮、酸、酯、呋喃及吡嗪等類物質(zhì)（圖1-A）。在未熏制雞腿肉中僅鑒定出28種，而熏制6 h時達(dá)54種。酚類為煙熏肉主要的香氣化合物，如圖1-B所示，未熏制條件下僅可檢出7種酚類物質(zhì)且含量較低，在熏制過程中檢測到多達(dá)21種。熏雞腿肉中OAVs＞1的香氣化合物共24種，對熏雞香氣有重大貢獻(xiàn)（圖1-B），酚類有愈創(chuàng)木酚、對甲酚、苯酚、2-甲基苯酚、3-甲基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等9種關(guān)鍵化合物，其中愈創(chuàng)木酚（13≤OAV≤2 435）最豐富，貢獻(xiàn)率最高。由嗅聞可知，熏制時間適當(dāng)時，酚類物質(zhì)主要表現(xiàn)為煙熏香味、焦糖味和木香味等令人愉悅且易接受的氣味；但熏制時間過長時，由于含量過高出現(xiàn)煙臭味和苦味（如愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚等），因此熏制時間選擇6 h左右最為合適。

圖1 熏制過程中雞腿香氣化合物半定性定量分析Fig.1 Semi-qualitative and quantitative analysis of aroma compounds in chicken thigh in the smoking processes

醛類被認(rèn)為是脂肪的主要二次氧化產(chǎn)物，己醛和壬醛在未熏制雞腿肉中最為豐富，但熏制過程中正辛醛、壬醛、己醛、反式-2-壬烯醛、（E）-2-辛烯醛、2，4-癸二烯醛等氣味閾值低的物質(zhì)含量減少甚至未檢測出（圖1-C）。在熏制過程中，呋喃和吡嗪類物質(zhì)含量變化無差異，但種類增多，其中2-戊基呋喃、2，5-二甲基吡嗪的OAVs值較高，對熏肉風(fēng)味貢獻(xiàn)率大。

2.2 熏雞危害物分析結(jié)果

2.2.1 HAs分析結(jié)果 由圖2可知，雞腿肉在熏制過程中共檢測出6種HAs，包括MeIQx、Harman、IQx、Norharman、PhIP和MeIQ。在熏制0～12 h過程中，Norharman從3.42增至37.38 ng·g-1，高于其他HAs；其次為Harman。它們促進(jìn)了非極性HAs含量的增加。Norharman和Harman為熏雞腿肉中最主要的HAs，這與Zhang等［12］的結(jié)果一致。除MeIQ外，其他極性HAs與熏制時間呈正相關(guān)，但含量相對較低，PhIP和MeIQx以足夠水平產(chǎn)生時，誘導(dǎo)癌癥發(fā)生的可能性增加。

2.2.2 AGEs分析結(jié)果 由于肉制品中蛋白質(zhì)和脂肪含量高，與水果和蔬菜等食物相比更易產(chǎn)生AGEs［18］。如圖3所示，主要對CML、CEL、MG-H1進(jìn)行定量分析，在熏制過程中，CEL（59.86～180.13 μg·g-1）與CML（8.17～123.94 μg·g-1）含量高于MG-H1（2.99～9.01 μg·g-1），這可能是因為CML與CEL除了由賴氨酸或精氨酸與二羰基化合物在美拉德反應(yīng)中生成外，還通過蛋白質(zhì)和脂肪氧化途徑產(chǎn)生，且脂質(zhì)氧化和美拉德反應(yīng)可能對肉中CML的產(chǎn)生有協(xié)同效應(yīng)，而MG-H1由精氨酸殘基與乙二醛或甲基乙二醛反應(yīng)形成［4］。攝入人體內(nèi)的AGEs難以被排除體外而積累，從而易誘發(fā)系列慢性疾病，在熏制過程中其含量與熏制時間呈正相關(guān)，因此需要對熏制時間進(jìn)行精準(zhǔn)控制。

圖3 熏制過程中雞腿AGEs含量Fig.3 AGEs contents in chicken thigh during smoking processes

2.2.3 PAH4分析結(jié)果 PAHs由兩個或兩個以上的的稠合芳環(huán)組成，是致癌、致畸、致突變的有毒物質(zhì)［2］。如圖4所示，在相同溫度熏制條件下，熏制時間0～12 h內(nèi)PAH4含量隨熏制時間的延長而增加，Chr、BaA、BbF和BaP含量分別為4.20～41.10、0.10～15.34、0.13～0.36和0.07～0.14 μg·kg-1，當(dāng)熏制時間達(dá)到8 h，PAH4總含量為32.69 μg·kg-1，熏制12 h時高達(dá)67.80 μg·kg-1，超過了歐盟規(guī)定的PAH4含量不應(yīng)高于30 μg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)，但熏雞腿肉中BaP含量未超過歐盟規(guī)定的不得超過5 μg·kg-1［24］的標(biāo)準(zhǔn)。對熏雞熏制過程中HAs、AGEs和PAH4定性定量分析發(fā)現(xiàn)，熏制時間與危害物生成量呈正相關(guān)。因此，熏雞長時間熏制并非有利，根據(jù)歐盟要求PAH4≤30 μg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)將熏制時間控制在8 h以下。

圖4 熏制過程中雞腿PAH4含量Fig.4 PAH4 contents in chicken thigh during smoking processes

2.3 熏雞前體物質(zhì)分析結(jié)果

2.3.1 脂肪含量、含水量分析結(jié)果 如表1所示，雞腿肉中脂肪含量為5.10%～9.47%，其與熏制時間未呈現(xiàn)規(guī)律性變化，但與未熏制（0 h）雞腿肉相比，熏制2～10 h的雞腿肉脂肪含量顯著減少（P＜0.05）。水分含量與熏制時間呈負(fù)相關(guān)，水分含量越高，危害物含量越低。這可能是由于高水分含量可抑制美拉德反應(yīng)速率，從而影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（HAs和AGEs）形成，導(dǎo)致更多危害物在熏制過程中產(chǎn)生。

表1 熏制過程雞腿中水分、脂肪、肌酐/酸和還原糖含量Table 1 Moisture，fat，creatinine，creatine and reducing sugar contents in chicken thigh during the smoking processes

2.3.2 肌酐、肌酸和還原糖含量分析結(jié)果 肌酐和肌酸是形成HAs的重要前體。如表1所示，肌酐含量整體高于肌酸，分別為2.13～3.55、1.47～2.58 mg·g-1。雞腿肉中肌酐和肌酸含量隨熏制時間延長先增加后減少。這可能是由于煙熏過程中特殊的溫濕度和適宜熏制時間有利于肌酐和肌酸生成，但熏制時間過長會導(dǎo)致肌酐和肌酸被消耗生成更多HAs［25］。

肉制品中的主要還原糖為葡萄糖和核糖。兩者都能與氨基酸和多肽反應(yīng)生成香氣化合物、HAs和AGEs。由表1可知，與0 h相比，熏制6 h后葡萄糖含量逐漸減少，在加熱條件下，其參與美拉德反應(yīng)生成危害物，為HAs和AGEs的主要前體物。而熏制條件下核糖含量增加，可能是核糖生成速率大于消耗速率而積累，這與Shi等［26］的研究結(jié)果一致。劉歡等［16］研究表明，核糖與含硫氨基酸反應(yīng)可形成含硫揮發(fā)性化合物，如二甲基三硫，但僅少量含硫類化合物在熏雞腿中被鑒定出。

2.3.3 氨基酸含量分析結(jié)果 由表2可知，雞腿肉熏制過程中共檢測出18種游離氨基酸，總含量為1 062.98～1 372.30 mg·kg-1，其中谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等為鮮味、甜味氨基酸［27］，其含量隨熏制時間延長先增加后減少。谷氨酸含量高于天冬氨酸，其為熏雞提供了強(qiáng)烈鮮味，為重要的鮮味氨基酸，而與對照相比，熏雞腿肉中苯丙氨酸、亮氨酸等苦味氨基酸含量在6～12 h顯著增加（P＜0.05），這與劉登勇等［23］的結(jié)果一致。而色氨酸、脯氨酸、精氨酸、賴氨酸含量逐漸減少，這可能是因為在美拉德反應(yīng)末期，色氨酸與乙醛在低溫下（100～130 ℃）反應(yīng)形成Harman和Norharman，賴氨酸/精氨酸與二羰基化合物反應(yīng)生成CML與CEL被消耗［4，28］。

表2 熏制過程雞腿中游離氨基酸含量Table 2 Free amino acid contents in chicken thigh during smoking processes/（mg·kg-1）

2.3.4 游離脂肪酸含量分析結(jié)果 游離脂肪酸為醛、醇類揮發(fā)性化合物的重要前體。如表3所示，對4個熏制時間點(diǎn)雞腿肉中游離脂肪酸進(jìn)行定性定量分析，共檢測出15種游離脂肪酸，包括6種飽和脂肪酸和9種不飽和脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸4種、多不飽和脂肪酸5種。熏雞腿中油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸含量較高，為主要的不飽和脂肪酸，與對照相比，其含量隨熏制時間增加先降低后升高，但花生四烯酸、二十二碳六烯酸無顯著差異（P＞0.05），這可能是因為花生四烯酸可氧化形成己醛、庚醛、辛醛和壬醛等［29］，但在熏制過程中醛類化合物生成較少，減少了對脂肪酸的消耗。

表3 熏制過程雞腿中游離脂肪酸含量Table 3 Free fatty acid contents in chicken thigh during smoking processes/（mg·kg-1）

2.4 關(guān)鍵香氣化合物、危害物與前體物含量的相關(guān)性

熏雞腿中醛類、醇類和吡嗪類物質(zhì)與肉中前體物有潛在相關(guān)性，因此對其OAVs＞1的香氣化合物與前體物相關(guān)性進(jìn)行分析。如圖5-A所示，醛類（辛醛、己醛、壬醛等）和醇類（1-辛烯-3-醇、（Z）-2-辛烯-1-醇）含量與核糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，壬醛、1-辛烯-3-醇含量分別與異亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、組氨酸含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。苯甲醛和糠醛含量與油酸、亞油酸和α-亞麻酸等不飽和游離氨基酸含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。辛醛、壬醛主要由油酸氧化而來，己醛、2，4-癸二烯醛主要由亞油酸氧化而來，而本研究中上述指標(biāo)間的相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。吡嗪中的2，5-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪含量與苯丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸等氨基酸含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與甘氨酸、色氨酸和十四碳一烯酸含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖5 熏制過程雞腿中關(guān)鍵香氣化合物（A）、危害物（B）與前體物的相關(guān)性Fig.5 Correlation of key aroma compounds，hazardous compounds and precursors in chicken thigh during the smoking processes

危害物與前體物含量相關(guān)性分析如圖5-B所示，除MeIQ外，HAs（MeIQx、PhIP、IQx、Norharman、Harman）含量與苯丙氨酸、甲硫氨酸含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，與脯氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、色氨酸、水分和肌酐含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），與Gibis等［30］的研究結(jié)果一致。AGEs（CML、CEL、MG-H1）和PAH4含量也與苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸含量呈顯著正相關(guān)，與脯氨酸、蘇氨酸、色氨酸和水分含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01）。賴氨酸和精氨酸為生成CML與CEL的重要前體物［4］，相互間存在相關(guān)性但不顯著（P＞0.05）。危害物含量間表現(xiàn)出顯著正相關(guān)，這可能歸因于化合物間的協(xié)同生成效應(yīng)，且具有共同的前體物質(zhì)及類似的生成反應(yīng)條件。綜上，苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸等對香氣化合物和危害物形成有共同顯著調(diào)控作用（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在熏制過程中，聊城熏雞腿肉酚類化合物種類及含量增加，從7種增至21種。Pham等［31］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，消費(fèi)者更喜愛煙熏火腿中的愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2，6-二氧基苯酚氣味（P＜0.05）。上述物質(zhì)也是聊城熏雞腿肉中的關(guān)鍵香氣化合物，這可能是其深受消費(fèi)者喜愛的原因之一。醛類閾值低且呈肉香味，經(jīng)鹵煮后的雞腿肉中醛類物質(zhì)較多，但在熏制過程中的種類與數(shù)量逐漸減少，推測其在煙熏過程中有損失，且強(qiáng)煙熏味對醛類的肉香味有掩蓋作用，但具體原因有待進(jìn)一步探究。除酚類外，呋喃和吡嗪類被認(rèn)為是煙熏肉中重要的香氣化合物。呋喃類可以緩和酚類帶來的強(qiáng)烈煙熏味，使煙熏產(chǎn)品形成令人愉悅、易接受的混合煙熏香味［5］。熏雞腿肉中除苯并呋喃、2-戊基呋喃外，二苯并呋喃、2-乙?；?5-甲基呋喃、3，4-二甲基呋喃、2-甲基苯并呋喃等為熏制過程中產(chǎn)生的化合物。吡嗪類是雜環(huán)含氮化合物，由于木材含有氮源，雞腿肉在煙熏過程中產(chǎn)生了7種吡嗪類物質(zhì)，包括2-乙基-5-甲基吡嗪、2，6-二乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、甲基吡嗪和2-乙基-3-乙基吡嗪。

食品中的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物及其中間體在高溫下不僅產(chǎn)生香氣化合物，還可生成HAs、AGEs、PAHs等潛在致癌物質(zhì)，從而對人體健康造成危害。Yu等［4］對煙熏香腸中脂質(zhì)氧化和CML、CEL生成之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)氧化值和CML、CEL含量間呈指數(shù)相關(guān)性，儲藏期間易發(fā)生脂質(zhì)氧化。因此，肉制品在加熱及儲藏過程中均可促進(jìn)CML和CEL的積累，這可能也是本研究熏雞腿肉中CML和CEL含量較高的原因之一。脂肪、脂肪酸是形成PAHs的重要前體物質(zhì)，熏雞腿中檢測到不飽和脂肪酸共9種，且油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸為主要的不飽和脂肪酸，這表明香氣化合物產(chǎn)生的同時也有利于PAHs的生成，與Silva等［8］的研究結(jié)果一致。

Montazeri等［32］研究表明，熏雞揮發(fā)性化合物和危害物的形成主要與煙熏材料的類型和化學(xué)成分有關(guān)。除熏制材料外，對香氣化合物和危害物影響的主要因素為熏制溫度、時間和熏材含水量等［33］。另外，HAs的形成受到前體物類型和水平及其相互間摩爾比的影響。非極性HAs不依賴于肌酸的存在，因為它們僅由碳水化合物和氨基酸形成，如色氨酸［34］。熏制樣品中HAs成分的變化可能是由煙霧成分在生成HAs中的貢獻(xiàn)所致。如煙霧中的醇類可能在高溫下反應(yīng)形成醛或酮類，醛、酮類可能與吡啶/吡嗪及肌酐反應(yīng)促進(jìn)極性HAs生成［35］，這進(jìn)一步解釋了溫熏條件下極性HAs增加的原因。

4 結(jié)論

本研究初步揭示了煙熏雞腿肉關(guān)鍵香氣化合物為愈創(chuàng)木酚，主要危害物為Norharman、CML、CEL和Chr，且煙熏可增加關(guān)鍵酚類物質(zhì)和危害物的種類及含量?？刂茻熝瑫r間在6 h左右可使熏雞保持令人愉悅的香氣，同時危害物含量較低。初步闡明了香氣化合物和危害物協(xié)同底物伴生關(guān)系，熏雞關(guān)鍵香氣化合物含量與核糖、游離氨基酸酪氨酸、色氨酸和游離脂肪酸油酸、亞油酸、α-亞麻酸等含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與苯丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸等含量呈顯著正相關(guān)；HAs、AGEs、PAH4含量與水分、葡萄糖、肌酐和游離氨基酸蘇氨酸、色氨酸等含量呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)，與苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等含量呈顯著正相關(guān)。