巖藻黃質(zhì)通過AKT/mTOR途徑調(diào)節(jié)糖酵解代謝促進(jìn)人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡的作用研究

葉松霖 金炫安 杜昊霏 王家誠 金旭東 徐博懷 丁浩淼，*

（1浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100；2寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 寧波 315000）

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，又分為急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）。ALL是兒童最常見的惡性腫瘤［1-3］，復(fù)發(fā)率高，緩解率低，長期生存率低，且發(fā)病率逐年上升［4］。目前ALL的主要治療方法是化療，而多種藥物聯(lián)合和個體化治療提高了ALL患者的5年生存率［5］，但一些患者對這些治療反應(yīng)不佳，因此需要一種對患者副作用小的新型抗腫瘤物質(zhì)。已有研究表明，來自植物、真菌、海洋生物和微生物的天然活性成分具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，且副作用?。?］。因此，研究海洋生物中活性成分的抗腫瘤作用對預(yù)防和治療ALL具有重要意義。

能量代謝的異常改變是腫瘤細(xì)胞的一個突出特征，其特征是傾向于將有氧糖酵解作為能量生成的主要手段［7］。研究表明，抑制腫瘤糖酵解途徑可有效阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡［8］。此外，研究證實，蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路可以促進(jìn)參與糖酵解通路的關(guān)鍵酶的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的攝取增強(qiáng)和糖酵解活性失調(diào)［9］。這種現(xiàn)象有助于增加能量供應(yīng)，促進(jìn)腫瘤生長，控制腫瘤細(xì)胞增殖［10］。上述發(fā)現(xiàn)為AKT/mTOR信號通路與糖酵解代謝之間的顯著關(guān)聯(lián)提供了有力的證據(jù)。因此，靶向AKT/mTOR信號通路控制的糖酵解途徑，減少對腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，可能成為一種治療ALL的有前景的方法。

羊棲菜（Sargassumfusiforme）是一種褐藻門馬尾藻科（Sargassaceae）的植物，在中國和日本作為藥物治療疾病已有數(shù)千年的歷史［11］。研究表明，馬尾藻屬植物提取物具有多種作用，包括抗腫瘤、抗疲勞、抗輻射、抗病毒、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)特性［12-13］。巖藻黃質(zhì)是羊棲菜的主要活性成分。大量研究表明，巖藻黃質(zhì)能夠通過阻滯細(xì)胞周期、抑制DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來阻止腫瘤細(xì)胞增殖。值得注意的是，巖藻黃質(zhì)對多種癌癥有顯著的抑制作用，包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和宮頸癌［14］。在Bae等［15］的研究中，巖藻黃質(zhì)部分減弱了參與糖酵解和線粒體呼吸的基因表達(dá)的變化，這些基因包括己糖激酶、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1β和丙酮酸脫氫酶激酶3。然而，目前關(guān)于巖藻黃質(zhì)對ALL的特異性調(diào)控作用的信息很少。因此，本研究以急性淋巴細(xì)胞白血病CEM/C1細(xì)胞為研究對象，通過觀察巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期的應(yīng)答差異及其相關(guān)糖酵解指標(biāo)的變化，探究巖藻黃質(zhì)抗白血病的機(jī)制，以期為巖藻黃質(zhì)（圖1）應(yīng)用在ALL的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

圖1 羊棲菜中巖藻黃質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of fucoxanthin isolated from Sargassum fusiforme

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

急性淋巴細(xì)胞白血病CEM/C1細(xì)胞購自于上海中科院細(xì)胞庫；RPMI-1640、胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］、磷酸酶抑制劑、苯甲磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶抑制劑購自諾維森生物科技有限公司；Bicinchoninic Acid Assay（BCA）蛋白定量試劑盒購自上海聯(lián)祖生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、碘化丙啶/核糖核酸酶（PI/Rnase）細(xì)胞周期試劑盒購自美國BD公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TransStart?Green qPCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物有限公司；AKT抗體、phospho-AKT抗體、m-TOR抗體、phospho-mTOR抗體、己糖激酶（hexokinases，HK）抗體、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PKM）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

巖藻黃質(zhì)由浙江萬里學(xué)院提供，提取于羊棲菜，純度＞95%［高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定］。

1.2 儀器與設(shè)備

Series Ⅱ Water Jacket恒溫CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；FACSVerse流式細(xì)胞儀，美國BD公司；TI-DH熒光倒置顯微鏡，日本Nikon公司；SpectraMax190連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司；Clinx凝膠成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) CEM/C1細(xì)胞接種于裝有適量RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并將其置于37 ℃以及5% CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［14］。

1.3.2 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞活力的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔5×104個接種于96孔板。試驗分為藥物組、對照組（不含藥物）和空白組（僅加入空白培養(yǎng)基）。孵育24 h后，藥物組加入不同濃度梯度的巖藻黃質(zhì)（0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg·mL-1），對照組加入等量培養(yǎng)基。每種劑量制備6個重復(fù)孔。進(jìn)一步孵育0、8、16和24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液。隨后，細(xì)胞繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（A）值。

1.3.3 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔5×104細(xì)胞密度接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別加入0、2.5、5、7.5 μg·mL-1的巖藻黃質(zhì)作用24 h，收集細(xì)胞并重新懸浮于100 μL的孵育液中。在上述細(xì)胞懸液中分別加入5 μL annexin V-FITC染色液和5 μL碘化丙啶染色液，室溫避光孵育15 min后進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，并計算早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例。

1.3.4 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。加入巖藻黃質(zhì)（0、2.5、5和7.5 μg·mL-1）作用24 h，用冷磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered solution，PBS）連續(xù)洗滌細(xì)胞2次，加入1 mL 70%乙醇在4 ℃下固定18 h。PBS洗滌2次后加入0.5 mL PI/Rnase染料溶液，并在室溫下靜置20 min，采用流式細(xì)胞術(shù)分析各組細(xì)胞周期分布。

1.3.5 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞葡萄糖攝取、ATP生成和乳酸生成的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。巖藻黃質(zhì)處理后收集細(xì)胞，少量細(xì)胞懸液使用細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞計數(shù)。通過測量特定波長的吸光度來評估葡萄糖消耗、ATP生成和乳酸生成。應(yīng)用酶標(biāo)儀分別在555、570和340 nm測定葡萄糖攝取、乳酸和ATP生成的吸光值，并計算葡萄糖消耗、ATP生成和乳酸生成。

1.3.6 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞HK和PK活性的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。用巖藻黃質(zhì)處理后收集細(xì)胞，少量細(xì)胞懸液用細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞計數(shù)。應(yīng)用酶標(biāo)儀在340 nm處測定吸光值，計算HK和PK的酶活性。

1.3.7 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞AKT/mTOR信號通路及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，并將RNA溶解于25 μL DEPC水中，NanoDrop分光光度計測定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進(jìn)行cDNA合成，逆轉(zhuǎn)錄體系為10 μL：PrimeScript Buffer RT Enzyme Mix 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5× PrimeScript Buffer 2 （for Real time） 4.0 μL、Rnase Free dH2O 4.0 μL。程序為：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。PCR循環(huán)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共循環(huán)40次。實時熒光定量PCR反應(yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）中使用的擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.8 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞AKT/mTOR信號通路及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期CEM/C1細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h。巖藻黃質(zhì)處理后收集細(xì)胞，每管加入150 μL含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解物，提取細(xì)胞蛋白。離心和收集上清液后，使用Bradford方法測定蛋白濃度并歸一化。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對總量為30 μg的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，并用5%脫脂牛奶溶液封閉2 h。將抗體AKT（1∶100 0）、mTOR（1∶100 0）、p-AKT（1∶100 0）、p-mTOR（1∶100 0）、HK（1∶100 0）、PKM（1∶100 0）和GAPDH（1∶200 0）孵育過夜。TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，在室溫下與二抗孵育2 h。TBST緩沖液洗滌3次后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，使用Tanon 4800 Multi成像系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.9 分子對接 采用ChemDraw 19.0軟件繪制巖藻黃質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式，進(jìn)一步應(yīng)用Chem3D 14.0軟件將其進(jìn)行能量最小化處理。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB，https：//www.Rcsb.Org/）檢索AKT蛋白（PDB ID：3MVH），保存為pdb格式，通過Pymol 2.5.2對蛋白結(jié)構(gòu)刪除水分子、去除修飾配體，再使用AutoDock Tools 1.5.7將巖藻黃質(zhì)和AKT蛋白轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，并進(jìn)行分子對接［16］。通過LigPlus 2.5.5分析配體與蛋白的氫鍵、疏水作用力等。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 14.0中ANOVA模塊對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，各組試驗至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞活力的影響

采用MTT法檢測巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果如圖2所示。與對照組比較，不同濃度（0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg·mL-1）的巖藻黃質(zhì)處理CEM/C1細(xì)胞8、16、24 h后，細(xì)胞活力均降低，呈時間和劑量依賴性。當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度低于3 μg·mL-1作用8、16 h時，細(xì)胞活力高于90%。3 μg·mL-1的巖藻黃質(zhì)作用24 h后，細(xì)胞活力明顯受到抑制。作用24 h后，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降，其IC50值為6.48 μg·mL-1。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇2.5、5.0、7.5 μg·mL-1的劑量進(jìn)行巖藻黃質(zhì)處理，處理時間為24 h。

圖2 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of Fucoxanthin on the viability of CEM/C1 cells

2.2 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響

如圖3-A所示，對照組CEM/C1細(xì)胞凋亡率為10.92%。當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為2.5 μg·mL-1時，CEM/C1細(xì)胞的凋亡率增加至14.69%；當(dāng)濃度為5 μg·mL-1時，CEM/C1細(xì)胞的凋亡率明顯升高至25.20%；隨著巖藻黃質(zhì)濃度的升高，CEM/C1細(xì)胞的凋亡率持續(xù)升高，在濃度為7.5 μg·mL-1時達(dá)到39.90%。如圖3-B～D所示，隨著巖藻黃質(zhì)濃度的增加，CEM/C1細(xì)胞的凋亡率、早期凋亡率和晚期凋亡率均增加。這些結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)能有效地促進(jìn)CEM/C1細(xì)胞的凋亡，與MTT試驗結(jié)果相符合。

圖3 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effects of Fucoxanthin on apoptosis of CEM/C1 cells

2.3 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞周期的影響

如圖4-A所示，巖藻黃質(zhì)將CEM/C1細(xì)胞周期阻滯于S期。如圖4-B～D所示，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度高于5 μg·mL-1時處于S期的CEM/C1細(xì)胞數(shù)量顯著或極顯著增加（P＜0.05），當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度高于7.5 μg·mL-1時G1期和G2期細(xì)胞比例極顯著降低（P＜0.01）。在7.5 μg·mL-1巖藻黃質(zhì)濃度下，CEM/C1細(xì)胞處于S期的細(xì)胞比例高達(dá)64.52%。

圖4 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of fucoxanthin on CEM/C1 cell cycle

2.4 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成和ATP生成的影響

與對照組相比，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度高于2.5 μg·mL-1時巖藻黃質(zhì)顯著或極顯著抑制CEM/C1細(xì)胞的葡萄糖攝取、ATP生成和乳酸生成（P＜0.05、P＜0.01），呈劑量依賴性（圖5-A～C）。該結(jié)果為巖藻黃質(zhì)參與CEM/C1細(xì)胞糖酵解途徑的調(diào)節(jié)作用提供了有力證據(jù)。

圖5 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量的影響Fig.5 Effect of Fucoxanthin on glucose uptake，lactate production and ATP production in CEM/C1 cells

2.5 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)和活性的影響

巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)酶活性的影響如圖6所示。隨著巖藻黃質(zhì)濃度升高，HK和PK的活性逐漸降低。與對照組相比，2.5 μg·mL-1巖藻黃質(zhì)處理24 h后，HK和PK的活性均顯著降低（P＜0.05）。此外，巖藻黃質(zhì)對HK和PK活性的抑制作用呈劑量依賴性。這些結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)能夠有效抑制CEM/C1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)酶的活性。

圖6 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞HK、PK活性的影響Fig.6 Effect of Fucoxanthin on activities of HK and PK in CEM/C1 cells

2.6 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR信號通路激活及糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR檢測CEM/C1細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的mRNA水平，結(jié)果見圖7-A、B。抗凋亡基因AKT、mTOR隨巖藻黃質(zhì)濃度的增加無明顯變化（P＞0.05）。由圖7-C、D可知，與對照組相比，5 μg·mL-1以上巖藻黃質(zhì)處理組中糖酵解相關(guān)酶HK基因表達(dá)水平顯著或極顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），2.5 μg·mL-1以上巖藻黃質(zhì)處理組中糖酵解相關(guān)酶PKM的基因表達(dá)水平顯著或極顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），說明巖藻黃質(zhì)可以抑制糖酵解相關(guān)酶基因的表達(dá)。

圖7 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR 信號通路和糖酵解相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Fucoxanthin on expressions of AKT/mTOR signaling pathway and glycolysis-related genes in CEM/C1 cells

2.7 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR信號通路激活及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探索巖藻黃質(zhì)調(diào)控CEM/C1細(xì)胞糖酵解的機(jī)制，試驗檢測了糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)。蛋白AKT和mTOR的相對表達(dá)量隨巖藻黃質(zhì)濃度的增加無明顯變化（圖8-B、D）；當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為7.5 μg·mL-1時，p-AKT蛋白的相對表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01，圖8-C）；當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為7.5 μg·mL-1時，p-mTOR蛋白的相對表達(dá)水平極顯著降低（P＜0.01，圖8-E）。上述結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)抑制了CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR信號通路的激活。當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為5 μg·mL-1時，糖酵解相關(guān)蛋白HK的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05，圖8-F）。如圖8-G所示，當(dāng)巖藻黃質(zhì)濃度為2.5 μg·mL-1時，糖酵解相關(guān)蛋白PKM的相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表明巖藻黃質(zhì)可通過AKT/mTOR信號級聯(lián)調(diào)控CEM/C1細(xì)胞的糖酵解通路。

圖8 巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR 信號通路和糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of Fucoxanthin on expressions of AKT/mTOR signaling pathway and glycolysis-related proteins in CEM/C1 cells

2.8 分子對接驗證

為了進(jìn)步一探索巖藻黃質(zhì)與目標(biāo)蛋白之間的關(guān)系，試驗進(jìn)行了巖藻黃質(zhì)與AKT的分子對接模擬。通過Pymol 2.1軟件對巖藻黃質(zhì)-AKT蛋白進(jìn)行可視化，得到強(qiáng)制模式，可以清晰看到結(jié)合位點上相互作用的氨基酸殘基。分子對接結(jié)果如圖9顯示，巖藻黃質(zhì)與AKT蛋白之間的結(jié)合能小于-5.01 kcal·mol-1，與mTOR蛋白之間的結(jié)合能小于-5.53 kcal·mol-1，表明結(jié)合效率較高。AKT上的關(guān)鍵活性位點殘基主要包括LEU295、GLY294、SER7以及AGR4等，mTOR的關(guān)鍵活性位點殘基主要包含GLN1627、HIS2401以及ILE2398等。此外，巖藻黃質(zhì)可以與氫鍵距離較短的殘基形成強(qiáng)氫鍵（約1.9 ?），使巖藻黃質(zhì)與AKT和mTOR蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

圖9 巖藻黃質(zhì)與AKT以及mTOR蛋白的分子對接結(jié)果Fig.9 Molecular docking results of Fucoxanthin with AKT and mTOR protein

3 討論

由于缺乏有效的治療方法，癌癥已成為第二大死亡原因［17］。嚴(yán)重的副作用和化療耐藥性是限制當(dāng)前化療的主要問題［18］，而天然物質(zhì)因具有較少的副作用和更強(qiáng)的藥理學(xué)特性，成為制藥行業(yè)的寶貴資源［19］。目前巖藻黃質(zhì)的最主要來源依舊是海藻［20］，其因具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、減肥等藥理作用，已成為藥物研究與開發(fā)的熱點之一［21-23］。本研究通過MMT試驗發(fā)現(xiàn)，巖藻黃質(zhì)對CEM/C1細(xì)胞的活性表現(xiàn)出時間和劑量依賴性的抑制作用，說明巖藻黃質(zhì)可以降低急性淋巴白血病細(xì)胞活力。巖藻黃質(zhì)是一種新型潛在抗癌藥物，可以通過多種途徑抑制腫瘤發(fā)展。Calabrone等［24］發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)具有抑制前列腺癌細(xì)胞生長和阻礙內(nèi)皮細(xì)胞形成血管網(wǎng)絡(luò)的能力。Wang等［25］觀察到巖藻黃質(zhì)有效抑制炎癥因子誘導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子（cell adhesion molecules，CAMs）的表達(dá)，從而減少MCF-7細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附。此外，巖藻黃質(zhì)還可以提高非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼敏感性從而達(dá)到抗腫瘤的作用［26］。目前系統(tǒng)研究巖藻黃質(zhì)促進(jìn)急性淋巴白血病細(xì)胞凋亡作用的報道較少，本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，巖藻黃質(zhì)在CEM/C1細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡并將細(xì)胞周期阻滯于S期。Fang等［27］證明了巖藻黃質(zhì)能夠阻滯非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞周期在G0/G1期從而抑制其增殖、遷移和侵襲。這與本研究結(jié)果不同，說明巖藻黃質(zhì)促進(jìn)CEM/C1細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚，因此在后續(xù)研究中進(jìn)行了進(jìn)一步探索。

通過無氧糖酵解和增加的葡萄糖攝取是腫瘤組織葡萄糖代謝的重要特征。雖然氧化磷酸化在產(chǎn)生凈ATP方面效率高于無氧糖酵解，但無氧糖酵解能快速提供能量，從而滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的能量需求［28］。治療癌癥的有效方法之一是抑制腫瘤細(xì)胞的能量代謝，但仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。Qi等［29］發(fā)現(xiàn)，電刺激誘導(dǎo)線粒體功能障礙，阻礙電子傳遞鏈和糖酵解途徑，導(dǎo)致能量供應(yīng)危機(jī)和癌細(xì)胞死亡。此外，腫瘤細(xì)胞通過增加葡萄糖攝取來促進(jìn)糖酵解途徑。本研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能夠顯著減少CEM/C1細(xì)胞的葡萄糖攝取、ATP生成和乳酸產(chǎn)生。低水平的糖酵解難以為腫瘤細(xì)胞的無限增殖提供能量，而這個過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物也成為遏制腫瘤生長的因素。糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平或活性的增加是腫瘤細(xì)胞異常活動的主要原因之一［30］。本研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能夠降低HK酶活性和HK蛋白的表達(dá)水平，HK催化己糖第六位羥基的磷酸化反應(yīng)，是糖酵解的第一步，在各種癌癥中呈異常表達(dá)［31］。Li等［32］發(fā)現(xiàn)，microRNA-let-7b-5p（let-7b-5p）通過與HK2 mRNA的3'非翻譯區(qū)相互作用，對HK2的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。通過抑制HK2介導(dǎo)的無氧糖酵解，let-7b-5p有效限制了乳腺腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在體外和體內(nèi)試驗中都得到證實，這與本研究結(jié)果一致。與此同時，在不同濃度的巖藻黃質(zhì)干預(yù)后，CEM/C1細(xì)胞中糖酵解相關(guān)蛋白PK的表達(dá)水平顯著降低，PK酶活力也顯著降低。PK酶是糖酵解過程中的主要限速酶之一，臨床發(fā)現(xiàn)在髓性白血病人血清中PK總活性明顯增高，這種酶在宮頸癌、淋巴肉瘤和髓性白血病等腫瘤的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用［33］。綜上所述，巖藻黃質(zhì)可以通過抑制糖酵解途徑，阻斷腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，AKT/mTOR信號通路是細(xì)胞過程中細(xì)胞對環(huán)境信號反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可以控制細(xì)胞的糖酵解代謝。AKT可以通過提高葡萄糖轉(zhuǎn)運體的膜轉(zhuǎn)位和表達(dá)，以及通過磷酸化糖酵解關(guān)鍵的酶來調(diào)節(jié)糖酵解的進(jìn)程，因此AKT也是腫瘤細(xì)胞糖酵解表型的重要推動因子［34］。磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶可以激活A(yù)KT，磷酸化的AKT是mTOR信號通路的重要上游調(diào)控者，mTOR在細(xì)胞內(nèi)存在兩種不同的蛋白復(fù)合物分別為mTORC1和mTORC2。研究報道，mTORC1主要由mTOR、mLST8和Raptor組成，是調(diào)節(jié)糖酵解過程的核心蛋白復(fù)合物［35］。本研究的結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)能夠降低CEM/C1細(xì)胞中AKT/mTOR通路中p-AKT和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平。Triptolide（TP）的治療顯示出顯著的劑量和時間依賴性抑制ICC細(xì)胞的增殖和糖酵解。隨后的分析揭示了TP通過靶向AKT/mTOR信號通路對ICC細(xì)胞糖酵解的抑制作用［36］，與本研究結(jié)果一致。明加雄［37］證明了海帶提取物巖藻黃質(zhì)可以一直肺癌轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/AKT/NFκB信號通路，抑制人肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。因此，本研究認(rèn)為巖藻黃質(zhì)可能通過AKT/mTOR信號通路對CEM/C1細(xì)胞的糖酵解途徑產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步闡明巖藻黃質(zhì)對AKT和mTOR蛋白的作用機(jī)制，通過分子對接模擬發(fā)現(xiàn)，巖藻黃質(zhì)與AKT和mTOR蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，因巖藻黃質(zhì)與AKT和mTOR蛋白殘基形成較強(qiáng)相互作用的氫鍵，而氫鍵距離較短，故使絡(luò)合物之間能夠穩(wěn)定結(jié)合。

4 結(jié)論

巖藻黃質(zhì)可能通過抑制AKT/mTOR信號通路阻斷腫瘤細(xì)胞糖酵解，降低腫瘤細(xì)胞能量供應(yīng)，并將CEM/C1細(xì)胞周期阻滯于S期，從而促進(jìn)CEM/C1細(xì)胞凋亡。需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)試驗探討巖藻黃質(zhì)的作用機(jī)制，為開發(fā)巖藻黃質(zhì)作為急性淋巴細(xì)胞白血病的潛在治療劑提供科學(xué)依據(jù)。