當歸芍藥散含藥血清及其有效成分對腎間質纖維化大鼠的作用及機制

劉化君，張挺

上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203

慢性腎臟疾?。–KD）在全球的患病率為10%～15%［1-2］，長期的腎臟炎癥損傷多會導致腎間質纖維化（RIF）的發(fā)生。RIF 是腎小管上皮細胞（RTECs）和腎小管周圍毛細血管之間細胞外基質（ECM）的過度沉積，導致間質結締組織與膠原纖維增多并伴隨實質細胞減少的一種病理現(xiàn)象［3］，被認為是終末期腎病階段的共同途徑，是CKD 的主要病理過程之一。當歸芍藥散（DSS）用于糖尿病腎病、腎病綜合征等取得較好療效［4］，其活血利水作用可有效抑制腎臟慢性炎癥損傷，緩解RIF，改善腎功能［5］。NLRP3 炎癥小體在誘導腎臟炎癥和纖維化中起重要作用，靶向抑制NLRP3 介導的細胞焦亡相關蛋白已成為治療CKD 的潛在方向［6］。上皮-間質轉化（EMT）過程作為RIF的重要影響因素［7］，影響RTECs黏附蛋白的表型改變及間質纖連蛋白（FN）的表達，是近年RIF 潛在治療機制的研究熱點。2020 年9 月—2022 年12 月，本研究利用TGF-β 誘導NRK-52E大鼠腎小管上皮細胞株腎間質纖維化模型，驗證主要效應成分阿魏酸（FA）、芍藥苷（PF）與當歸芍藥散含藥血清（DSSS）對腎間質纖維化的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Sprague Dawley 大鼠16 只，購買、飼養(yǎng)均于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，動物實驗均經上海中醫(yī)藥大學醫(yī)學倫理研究委員會批準（倫理學批準號PZSHUTCM211115022）。大鼠腎小管上皮細胞株（NRK-52E 細胞），購自上海酶研生物科技有限公司（ATCC 來源）。其他試劑及儀器：胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），100 U/L青鏈霉素、DMEM-F12培養(yǎng)液（Corning公司），胰蛋白酶-EDTA 溶液（Sigma-Aldrich 公司），BCA 蛋白質定量檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），TGF-β1（Peprotech公司），GMTrans脂質體核酸轉染試劑（上海吉滿生物科技有限公司），PF（美國MedChemexpress生物科技有限公司），F(xiàn)A（德國Merck公司），酶標儀（美國Bio-TEK，型號：ELX-800），電泳儀及配套電泳槽（美國Bio-Rad 公司，PowerPac 系列），化學發(fā)光成像分析儀（美國 Protein Simple 公司），CO2細胞培養(yǎng)箱Model370 series（美國Thermo 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 DSS藥液制備 DSS方劑組成為當歸9 g、白芍18 g、茯苓12 g、白術12 g、澤瀉12 g、川芎9 g，均由上?？禈蛑兴庯嬈邢薰咎峁?。將以上中藥清洗后置于去離子水中浸泡0.5 h，使用煎藥鍋熬煮2 h，得到水煎液1.5 L，后濃縮得到0.756 g/mL濃度的DSS藥液；常溫3 000 r/min離心后取上清液，過濾除菌后-20 ℃冷藏備用。

1.2.2 動物分組及處理 16 只大鼠隨機分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組4 只。分組標記后適應性飼養(yǎng)，正常飲食，12 h/12 h 晝夜光照時間，待每組大鼠平均體質量達到180 g即可開始灌胃。灌胃前觀察動物一般狀態(tài)、活動程度、排便情況?？瞻讓φ战M（0.1 mL生理鹽水/10 g體質量）、低劑量組（0.05 mL DSS藥液/10 g體質量）、中劑量組（0.1 mL DSS 藥液/10 g 體質量）、高劑量組（0.2 mL DSS 藥液/10 g 體質量）每日同一時間進行灌胃，持續(xù)7 d。

1.2.3 含藥血清制備 灌胃第7 日，按照原劑量分組標準灌胃40 min后進行大鼠腹腔注射麻醉行腹主動脈取血術。每只大鼠可取3～5 mL 血液，取得血樣置于離心管中室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清并置于-4 ℃保存。待所有大鼠血樣完成離心，按照劑量分組將同組血清混合，獲得低、中、高劑量DSSS。置于56 ℃水浴30 min 后-80 ℃環(huán)境下冷藏。

1.2.4 腎小管上皮細胞培養(yǎng)及分組 將NRK-52E細胞置于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/L青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基）中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，待對數生長期時用于各項實驗。將對數生長期細胞以2×105/孔及2×104/孔密度接種于6孔板和96 孔板中，設置對照組（Control）、模型組（TGF-β 處理）、siRNA 轉染組（TGF-β+siRNA 處理）、FA 組（TGF-β+FA 處理）、PF 組（TGF-β+PF 處理）及DSSS 低、中、高劑量組（TGF-β+DSSS-L、TGF-β+DSSS-M、TGF-β+DSSS-H 分別處理）。siRNA 轉染組以NLRP3 siRNA-脂質體復合物轉染6 h 后，給予4 ng/mL誘導纖維化48 h。siRNA 通過NCBI 數據庫獲得NLRP3 基因序列，選擇siRNA 靶位點后分析序列同源性，避免與其他編碼序列/EST 同源序列。使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選擇合適目標序列，委托吉滿生物科技（上海）有限公司化學合成siRNA，正向引物：5'-GAACUCUUGACCAUUGGCAtt-3'，反向引物：3'-UGCCAAUGGUCAAGAGUUCtt-5'。

1.2.5 DSSS、FA、PF、TGF-β1對NRK-52E 細胞干預濃度選擇 待96 孔板中的細胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，棄舊培基，加入不同濃度DSSS、FA、PF、TGF-β 的DMEM 培養(yǎng)基。DSSS 濃度梯度：0、2%、4%、6%、8%、10%、12%，F(xiàn)A 濃度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，PF 濃度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，TGF-β 濃度梯度：0、1.25、2.5、3.75、5、7.5、10 ng/mL；每個濃度設5 個復孔，培養(yǎng)48 h。在檢測時間點取出96 孔板，避光下加入CCK-8 溶液（每孔10 μL），放入培養(yǎng)箱90 min 后，使用酶標儀測定每孔OD 值（波長450 nm），計算每組細胞的存活率及IC50值，確定DSSS、FA、PF、TGF-β對NRK-52E細胞的干預濃度。

1.2.6 DSSS、FA、PF 對各組細胞焦亡相關蛋白及黏附蛋白作用檢測 采用以上實驗確定的DSSS、FA、PF 濃度對NRK-52E 細胞進行干預，取細胞裂解離心后上清液進行BCA蛋白定量。使用RIPA、SDSloadingbuffer 配平后，經常規(guī)電泳、轉膜、封閉，將膜置于相應的一抗稀釋液中，4 ℃孵育12 h，多次洗滌后置于相應的二抗稀釋液中，室溫孵育2 h。加入ECL 檢測試劑，利用凝膠成像系統(tǒng)進行成像檢測，ImageJ V1.8.0 軟件進行灰度值統(tǒng)計分析。以GAPDH 為內參，比較各組間細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18 的表達差異；以β-actin 為內參，比較各組間黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin的表達差異。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時用LSD-t檢驗，方差不齊時用Tamhanes's T2法并行Tukey 事后檢驗；重復測量數據采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DSSS、FA、PF、TGF-β 對NRK-52E 細胞的干預濃度 不同成分干預NRK-52E 細胞48 h 后，酶標儀于450 nm 波長處測量OD 值，計算所得IC50值。DSSS 在血清濃度小于5%時對細胞生長有促進作用，占比為5%時其對于NRK-52E 細胞的生存率影響最小，故DSSS 治療組分別以5%濃度低、中、高劑量DSSS 進行干預，見圖1A。誘導纖維化模型細胞所用TGF-β濃度越高，細胞存活率越低，其IC50在7.352 ng/mL，故模型組給予完全培養(yǎng)基稀釋至4 ng/mL 的TGF-β 溶液誘導纖維化模型，見圖1B。PF 的IC50在350.9 μmol/mL，故篩選200 μmol/mL濃度作為可行的干預濃度，見圖1C。FA 的IC50為222.8 μmol/mL，故篩選75 μmol/mL 為可行的干預濃度，見圖1D。

圖1 不同濃度DSSS、TGF-β、PF、FA對NRK-52E細胞存活率的影響

2.2 各組細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18 表達 使用TGF-β 刺激后，模型組中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18 表達增加，siRNA轉染后可抑制NLRP3 表達，并降低CASP-1、GSDMD、IL-18 表達。相較于模型組，DSSS 各劑量組、FA 組、PF 組細胞焦亡相關蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18表達比較（± s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別對照組模型組siRNA轉染組FA組PF組DSS低劑量組DSS中劑量組DSS高劑量組IL-18 0.210 ± 0.010 1.117 ± 0.090#0.217 ± 0.017*0.767 ± 0.084*0.294 ± 0.035*0.704 ± 0.079*0.536 ± 0.051*0.321 ± 0.062*NLRP3 0.165 ± 0.012 0.794 ± 0.052#0.171 ± 0.011*0.370 ± 0.043*0.183 ± 0.013*0.424 ± 0.070*0.391 ± 0.005*0.153 ± 0.009*GSDMD 0.232 ± 0.024 0.540 ± 0.047#0.111 ± 0.011*0.412 ± 0.081*0.091 ± 0.017*0.170 ± 0.010*0.389 ± 0.059*0.252 ± 0.038*CASP-1 0.159 ± 0.006 1.020 ± 0.029#0.164 ± 0.020*0.541 ± 0.040*0.211 ± 0.014*0.590 ± 0.094*0.276 ± 0.026*0.301 ± 0.045*

2.3 各組細胞纖維化相關蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表達 使用TGF-β 刺激后，細胞FN 蛋白表達增加，E-Cadherin 表達下降，N-Cadherin 表達上升，E-Cadherin 與N-Cadherin 表達比值下降。DSSS中、高劑量可降低FN 蛋白表達；DSSS 各種劑量可抑制N-Cadherin 表達，并降低E-Cadherin/N-Cadherin比值；FA、PF 均能改善纖維化相關黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表達情況；相較于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞纖維化相關蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin表達比較（± s）

注：與對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別對照組模型組siRNA轉染組FA組PF組DSS低劑量組DSS中劑量組DSS高劑量組E-Cadherin/N-Cadherin 2.606 ± 0.107 0.733 ± 0.015#1.234 ± 0.026*1.013 ± 0.032*2.322 ± 0.095*1.548 ± 0.035*1.831 ± 0.059*2.444 ± 0.157*FN 0.730 ± 0.079 1.436 ± 0.052#0.464 ± 0.037*1.193 ± 0.070*1.018 ± 0.020*1.388 ± 0.036 0.858 ± 0.037*0.640 ± 0.033*E-Cadherin 1.330 ± 0.046 0.922 ± 0.008#1.178 ± 0.014*1.141 ± 0.119*1.354 ± 0.037*1.016 ± 0.017 0.829 ± 0.029 1.064 ± 0.039 N-Cadherin 0.511 ± 0.031 1.258 ± 0.025#0.955 ± 0.023*1.124 ± 0.081*0.584 ± 0.028*0.656 ± 0.009*0.453 ± 0.001*0.436 ± 0.012*

3 討論

RTF 是CKD 的主要病理癥狀之一，其纖維化過程的關鍵步驟包括：①腎臟損傷引發(fā)的炎癥激活和免疫細胞浸潤；②生長因子、趨化因子和細胞因子等促纖維化介質的釋放；③細胞外基質合成/降解的不平衡，肌成纖維細胞的激活和ECM 在腎小管間質的過度積聚；④EMT 和實質細胞的不可逆轉的損失；⑤腎臟微血管的減少［8］。RETCs 廣泛參與RIF 過程，RETCs 的氧化損傷、炎癥募集、黏附蛋白表達、EMT等過程促使RIF進展［9-11］。

細胞焦亡是一種高度促炎性的細胞程序性死亡方式，其促炎性來自于裂解性細胞死亡釋放炎癥因子IL-18、IL-1β，經典通路中NLRP3 炎癥小體介導CASP-1、GSDMD蛋白的活化、成熟［12］，最終由GSDMD在細胞膜上形成寡聚孔道，使細胞腫脹破裂，釋放被CASP-1 剪切成熟的促炎物質IL-18、IL-1β 等，放大腎臟炎癥，在RIF 炎癥過程中起重要作用。故使用藥物對NLRP3、CASP-1、GSDMD 進行抑制，可影響細胞焦亡的激活、炎癥蛋白的剪切與活化、穿孔素導致的細胞死亡及促炎作用，從而干擾細胞焦亡進程，減輕腎臟炎癥及纖維化進程［13］。

本研究用于制作纖維化模型NRK-52E 細胞的TGF-β分子，是纖維化過程的主要效應子［14］。TGF-β結合于RETCs 表面受體，并發(fā)起下游信號轉導，促使RETCs 改變增強EMT 過程，加速ECM 的產生和堆積；能激活MAPK、TNF、NF-κB等蛋白促進炎癥表達［15］，激活細胞焦亡通路。在RIF 過程中EMT 不可忽視，RETCs 表面黏附蛋白的表達變化，如E-Cadherin 蛋白的降低和N-Cadherin 蛋白的增加［16］，被認為是EMT 進展的常見情況。隨著EMT 過程和炎癥信號的增強，免疫細胞募集浸潤、RETCs 穩(wěn)態(tài)丟失、黏附蛋白表型改變、亞穩(wěn)態(tài)間充質細胞增加、細胞外基質蛋白沉積等因素綜合后，則在腎間質形成慢性炎癥和纖維化環(huán)境［17］。

在體外實驗中，使用4 ng/mL濃度的TGF-β可增強NRK-52E 細胞焦亡核心分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白與炎性因子IL-18 表達，提示激活了NLRP3 炎癥小體的組裝和促炎因子的釋放；細胞表層E-cadherin 表達減少，F(xiàn)N 和N-cadherin 表達增加，提示ECM中FN的數量增加，間質纖維化進展并伴隨EMT過程的發(fā)生。在使用NLRP3 siRNA脂質粒復合體轉染沉默NLRP3 蛋白合成后，可觀察到焦亡通路受抑制對RETCs黏附蛋白表型的保護作用。纖維化標志物FN 的表達降低及E-Cadherin/N-Cadherin 的增大，提示EMT 與RIF 進展被抑制。研究表明，NLRP3 炎癥小體介導的細胞焦亡被抑制，RIF 被緩解［18］，均佐證NLRP3 炎癥小體介導的經典途徑焦亡與RIF、EMT過程有較強的相關性。

綜上所述，DSSS及其有效成分中的FA、PF均能明顯抑制TGF-β 誘導的NRK-52E 細胞纖維化模型中焦亡相關蛋白及纖維化蛋白表達，緩解RIF 及RETCs的EMT的發(fā)生發(fā)展。