骨形態(tài)發(fā)生蛋白5對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制

馬東玥，臧艷，任俏慧，朱欣悅，王蓮子，呂偉，姚駿驍，周心怡，余莉，李濤

1 安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230022；2 病原生物學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

根據(jù)2020 年的全球癌癥統(tǒng)計(jì)，肝癌是第六大常見(jiàn)的惡性腫瘤，居癌癥死亡第三位［1］。肝癌病理生理機(jī)制復(fù)雜，多種因素參與肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤進(jìn)展，包括遺傳易感性、病毒因素、細(xì)胞微環(huán)境等［2］。探索腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞因子對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，可能對(duì)肝癌治療具有潛在意義［3］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）是屬于TGF-β家族的分泌型蛋白［4］，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等多種細(xì)胞生物學(xué)行為［5-6］。已有研究表明，BMP5 可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有關(guān)胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)BMP5 在癌組織中低表達(dá)，使用外源性BMP5 處理胰腺癌細(xì)胞能抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其遷移和侵襲［7］。而在皮膚組織的研究顯示，BMP5 可誘導(dǎo)骨髓來(lái)源細(xì)胞的角蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)慢性皮膚腫瘤的進(jìn)展［8］。然而B(niǎo)MP5在肝癌中的表達(dá)及對(duì)肝癌的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。2023 年1月—12月，本研究檢測(cè)BMP5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，探究其在肝癌細(xì)胞系中對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移能力的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝細(xì)胞系L02 來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室保存，肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7 購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司。RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自南京維森特生物技術(shù)有限公司；總RNA 提取試劑TRIzol、Annexin-V/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific 公司；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 購(gòu)自上海翌圣生物科技股份有限公司；BMP5、GAPDH 引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；GAPDH、PCNA抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity 公司；羊抗兔/羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；BMP5 抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ 及Affinity 公司；SMAD3、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（rh-BMP5）購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自廣州Biosharp 公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)BIO-RAD公司）；Infinite F50型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（瑞士TECAN公司）；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；正置及倒置光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）。

1.2 細(xì)胞中BMP5 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上以cDNA 為模板完成實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)擴(kuò)增檢測(cè)。BMP5 正向引物：5'-TGGCAGGACTGGATTATAGCA-3'，反向引物：5'-CAAGGCTTTGGTACGTGGTC-3'；GAPDH 作為內(nèi)參基因，正向引物：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。檢測(cè)各模板Ct 值，以2-ΔΔCt法分析各細(xì)胞系中BMP5基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞置于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，分別以含10%FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)L02 細(xì)胞、DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)Hep3B、Huh7 細(xì)胞。rh-BMP5 處理人肝癌細(xì)胞系Hep3B、Huh7，分為NC組及rh-BMP5 低劑量組、rh-BMP5 中劑量組、rh-BMP5高劑量組。NC組予以不含rh-BMP5的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，rh-BMP5 低、中、高劑量組予以無(wú)血清培養(yǎng)基配制的1、10、100 ng/mL rh-BMP5 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將NC組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7 細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別用無(wú)血清培養(yǎng)基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5的無(wú)血清培養(yǎng)基重選為細(xì)胞懸液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)僅加無(wú)血清培養(yǎng)基的空白對(duì)照。分別培養(yǎng)24、48 h 后每孔加入CCK-8 試劑10 μL于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光密度（OD）值，以各組OD 值計(jì)算細(xì)胞活力，代表細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞活力=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，As 為加rh-BMP5 的處理孔，Ab 為空白孔，As為對(duì)照孔。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。將NC 組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7 細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板中，收集各組細(xì)胞于BD 適配流式管中，1 000 r/min離心5 min半徑，棄上清，4 ℃預(yù)冷PBS輕柔洗滌細(xì)胞沉淀，重復(fù)1 次。然后配置1×Binding Buffer 洗滌細(xì)胞沉淀1 次，1 000 r/min 離心5 min（半徑7.6 cm），收集細(xì)胞沉淀，195 μL 1× Binding Buffer輕柔重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin-V-FITC 混勻染色，4 ℃避光10 min，200 μL 1× Binding Buffer洗滌細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min（半徑7.6 cm），收集細(xì)胞沉淀，190 μL 1× Binding Buffer 重選細(xì)胞，加入5 μL Propidium Iodide（PI）染色，4 ℃避光5 min，輕柔混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞遷移率測(cè)算 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B、Huh7細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，根據(jù)細(xì)胞的大小控制鋪板密度。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)后于孔板底部作劃痕。加入無(wú)血清培養(yǎng)基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5 的無(wú)血清培養(yǎng)基，再置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h及48 h，200倍倒置顯微鏡下拍照，用ImageJ分析遷移面積并計(jì)算遷移率。

1.7 SMAD信號(hào)分子和PCNA蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。將NC 組及rh-BMP5 低、中、高劑量組的Hep3B、Huh7細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入適量含PMSF 的RIPA 蛋白裂解液，充分吹打混勻，冰上靜置30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min（半徑8.5 cm），收集上清液測(cè)定蛋白濃度。然后經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗（SMAD3 1∶1 000、p-SMAD3 1∶1 000、PCNA 1∶2 000、GAPDH 1∶2 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST 洗膜后二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液顯影并存檔。ImageJ軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度識(shí)別，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH 的灰度比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism9.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMP5 mRNA 在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) 正常肝細(xì)胞系L02、肝癌細(xì)胞系Hep3B 和Huh7 中BMP5 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.000、4.929 ± 0.486、27.75 ± 1.975，與正常肝細(xì)胞系L02 相比，BMP5 mRNA 在肝癌細(xì)胞系Hep3B 和Huh7 中相對(duì)表達(dá)量升高（P均＜0.05）。

2.2 BMP5 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 與NC 組相比，低劑量組在培養(yǎng)24、48 h時(shí)細(xì)胞增殖能力增加，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而中、高劑量組在24、48 h較NC組細(xì)胞增殖能力均顯著增加（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力（%， ± s）

表1 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組96.01 ± 6.49 153.40 ± 8.97 185.70 ± 21.59 224.20 ± 15.00 Hep3B細(xì)胞活力24 h48 h 113.6 ± 9.98 176.4 ± 14.89 241.8 ± 12.08 266.0 ± 22.19 Huh7細(xì)胞活力24 h 98.41 ± 0.74 104.00 ± 0.77 113.6 ± 2.59 118.7 ± 2.23 48 h 100.9 ± 2.65 125.6 ± 1.29 128.1 ± 3.52 129.3 ± 4.82

2.3 BMP5對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 在Hep3B細(xì)胞中，與NC 組相比，培養(yǎng)24 h 后，低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率下降（P均＜0.05）；培養(yǎng)48 h后，低、中劑量組與NC 組相比凋亡率下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組凋亡率低于NC 組（P＜0.05）。在Huh7細(xì)胞中，rh-BMP5 低劑量組凋亡率在24、48 h 較對(duì)照組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而中、高劑量組與NC 組相比凋亡率顯著下降（P均＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率（%， ± s）

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞凋亡率（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組10.03 ± 0.93 4.90 ± 1.12 3.23 ± 0.39 2.48 ± 0.21 Hep3B細(xì)胞凋亡率24 h48 h 10.82 ± 0.65 10.68 ± 0.61 7.98 ± 0.57 6.19 ± 0.68 Huh7細(xì)胞凋亡率24 h 9.10 ± 0.59 6.04 ± 0.94 3.37 ± 0.16 3.26 ± 0.17 48 h 11.04 ± 0.87 6.58 ± 1.24 5.49 ± 1.00 4.36 ± 0.75

2.4 BMP5 對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響 在處理24 及48 h 后，與NC 組相比，rh-BMP5 低、中劑量組的Hep3B、Huh7 細(xì)胞遷移率增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而高劑量組在24 h 及48 h 與NC組相比遷移率均顯著增加（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞遷移率（%， ± s）

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞遷移率（%， ± s）

組別NC組低劑量組中劑量組高劑量組Hep3B細(xì)胞遷移率24 h48 h24 h48 h 43 ± 4.0059.91 ± 1.0412.37 ± 3.5324.50 ± 5.21 50 ± 6.4863.57 ± 1.1615.43 ± 5.5027.48 ± 8.68 61 ± 5.5270.77 ± 1.3623.02 ± 5.1839.86 ± 6.16 68 ± 7.2774.92 ± 5.0734.81 ± 8.4351.60 ± 2.23 27.37.43.54.Huh7細(xì)胞遷移率

2.5 不同濃度BMP5對(duì)肝癌細(xì)胞SMAD通路蛋白表達(dá)的影響 選取0、1、10、100 ng/mL濃度的rh-BMP5處理肝癌細(xì)胞系Hep3B 及Huh7，Western blotting 結(jié)果顯示，與0 ng/mL濃度相比，rh-BMP5 100 ng/mL濃度處理細(xì)胞后PCNA蛋白表達(dá)上調(diào)，p-SMAD3蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同濃度BMP5對(duì)肝癌細(xì)胞SMAD通路蛋白表達(dá)的影響（ ± s）

表4 不同濃度BMP5對(duì)肝癌細(xì)胞SMAD通路蛋白表達(dá)的影響（ ± s）

細(xì)胞系蛋白相對(duì)表達(dá)量/GAPDH NC組低劑量組中劑量組高劑量組Hep3B p-SMAD3 PCNA Huh7 0.054 ± 0.003 0.826 ± 0.113 0.067 ± 0.004 1.074 ± 0.077 0.114 ± 0.004 1.144 ± 0.050 0.475 ± 0.029 1.380 ± 0.059 p-SMAD3 PCNA 0.124 ± 0.007 0.695 ± 0.022 0.126 ± 0.004 0.882 ± 0.048 0.127 ± 0.002 0.920 ± 0.048 0.318 ± 0.007 1.282 ± 0.034

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的癌癥之一，預(yù)計(jì)到2025 年肝癌發(fā)病人數(shù)將超過(guò) 100 萬(wàn)例［2］。2020年，肝癌在46個(gè)國(guó)家位列癌癥死亡原因的前三名，并且是癌癥導(dǎo)致過(guò)早死亡的第二大常見(jiàn)原因［9］。盡管目前肝癌在外科治療、化療、免疫治療等方面均取得一定進(jìn)展［10-12］，但肝癌的臨床治療效果仍不能達(dá)到預(yù)期水平。因此，探索肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新的有效治療靶點(diǎn)，成為肝癌不斷研究的重點(diǎn)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一種多功能的生長(zhǎng)因子蛋白，屬于TGF-β 家族［13］，最初發(fā)現(xiàn)在骨形成中起作用，因其在多器官中的功能受到關(guān)注。BMP 通過(guò)跨膜受體由胞質(zhì)內(nèi)SMAD 介導(dǎo)參與多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)［14-15］。當(dāng)前研究表明BMP5 可能參與多種癌癥的發(fā)生［16］。除前述提及的胰腺癌、皮膚病變之外，在腎上腺皮質(zhì)腺癌中，使用BMP5 重組蛋白處理腫瘤細(xì)胞可通過(guò)激活SMAD 信號(hào)通路抑制癌細(xì)胞增殖［17］。但目前BMP5 在肝癌細(xì)胞的表達(dá)及作用仍不明確，因此本研究首先在正常肝細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系中進(jìn)行檢測(cè)，BMP5 mRNA 在Hep3B 及Huh7 肝癌細(xì)胞系中表達(dá)高于正常肝細(xì)胞系L02，提示BMP5可能參與肝癌的發(fā)生。

鑒于BMP5 是一種分泌型蛋白，BMP5 在胞外可通過(guò)與膜受體結(jié)合進(jìn)行跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此我們采用rh-BMP5 進(jìn)一步研究BMP5 對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特征的影響。我們選取兩種常用的人肝癌細(xì)胞系Hep3B 和Huh7 進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度rh-BMP5 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及遷移等生物學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示中劑量組（10 ng/mL）及高劑量組（100 ng/mL）的rh-BMP5 對(duì)Hep3B 和Huh7 增殖均有促進(jìn)作用，而在低劑量組（1 ng/mL）中，細(xì)胞活力在培養(yǎng)24 h 和48 h 與NC 組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示BMP5 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的作用可能與其濃度有關(guān)。與細(xì)胞增殖類似，在凋亡方面，高劑量rh-BMP5能顯著抑制肝癌細(xì)胞凋亡，而低劑量組與NC 組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，高劑量rh-BMP5對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力具有促進(jìn)作用，并且與處理時(shí)間有關(guān)，在24 h時(shí)即可促進(jìn)細(xì)胞遷移，且在48 h時(shí)更為明顯。本研究結(jié)果顯示BMP5 能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，提示BMP5 可能對(duì)肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為有促進(jìn)作用。

我們進(jìn)一步研究BMP5 對(duì)下游信號(hào)通路的影響。在依賴SMAD 的經(jīng)典BMP 信號(hào)通路中，BMP 配體與靶細(xì)胞表面的BMPⅠ型和Ⅱ型絲/蘇氨酸激酶受體結(jié)合發(fā)揮其細(xì)胞效應(yīng)［14，18］。BMPⅡ型受體具有激酶活性，在BMP 信號(hào)誘導(dǎo)的受體復(fù)合物形成后可以磷酸化Ⅰ型受體，而Ⅰ型受體的激活會(huì)進(jìn)一步磷酸化胞內(nèi)的受體調(diào)控SMAD（R-SMAD），并募集SMAD4，易位進(jìn)入細(xì)胞核［18-20］，與 DNA 結(jié)合，作為轉(zhuǎn)錄因子參與下游靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［21］。JIN 等［22］研究發(fā)現(xiàn)，BMP5 處理乳腺癌細(xì)胞系可增加磷酸化SMAD1/5/9 的表達(dá)。外源性BMP2 可誘導(dǎo)膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的小鼠和人類癌細(xì)胞系模型SMAD2 和/或SMAD3 磷酸化，入核并誘導(dǎo)下游靶基因表達(dá)［23］。說(shuō)明不同BMPs 可能通過(guò)不同下游SMADs 分子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Western blotting 結(jié)果顯示，高劑量組rh-BMP5 處理肝癌細(xì)胞后p-SMAD3 升高，說(shuō)明BMP5 可能通過(guò)SMAD3 活化行使其生物學(xué)效應(yīng)。此外，對(duì)增殖相關(guān)蛋白PCNA 的檢測(cè)顯示，BMP5 處理可增加PCNA 的表達(dá)，這與前述BMP5 促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的結(jié)果一致。

值得注意的是，雖然BMP5 對(duì)Hep3B 和Huh7 細(xì)胞生物學(xué)特性的促進(jìn)作用趨勢(shì)總體一致，但Hep3B和Huh7 對(duì)BMP5 的反應(yīng)性存在差異。在細(xì)胞增殖方面，高劑量BMP5 對(duì)Hep3B 細(xì)胞活力的促進(jìn)作用相較于Huh7 更加明顯，可增加Hep3B 細(xì)胞活力1 倍以上；而在SMAD3磷酸化方面，BMP5誘導(dǎo)Hep3B中SMAD3 的活化也較Huh7 更為顯著。我們推測(cè)這可能是由于Hep3B 和Huh7 細(xì)胞系在來(lái)源上具有異質(zhì)性，與Hep3B 相比，Huh7 存在更高的基線BMP5 表達(dá)，因此對(duì)外源性BMP5的反應(yīng)性低于Hep3B細(xì)胞。綜上所述，BMP5 在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，具有促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖及遷移、抑制細(xì)胞凋亡的作用，并能增加SMAD3 磷酸化，提示BMP5 在肝癌中具有潛在的促癌作用，但其臨床價(jià)值及深入分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究闡明。