雙酶輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油及其GC-MS成分分析

蓋旭 程庠 姜子濤 羅君萍

摘要：采用雙酶輔助水蒸氣蒸餾法提取廣西產(chǎn)肉豆蔻的精油，并通過GC-MS對其進行成分分析。正交實驗結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝條件為加酶量2%、酶解pH 4.0、酶解溫度40 ℃，在此條件下，肉豆蔻精油的得率為6.50 mL/100 g。利用GC-MS和保留指數(shù)法從精油中鑒定出56種化合物，占精油總量的99.71%，主要成分為肉豆蔻醚（16.60%）、甲基丁香酚（14.78%）、檜烯（13.47%）、（+）-檸檬烯（7.29%）、4-萜烯醇（6.75%）、欖香素（6.62%）、γ-松油烯（4.28%）、反式-甲基異丁香酚（3.73%）、β-蒎烯（3.59%）和黃樟素（3.22%）。

關(guān)鍵詞：肉豆蔻精油；雙酶輔助水蒸氣蒸餾；提?。粴庀嗌V-質(zhì)譜；成分分析；保留指數(shù)

中圖分類號：TS225.19????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2024）02-0165-06

Extraction of Myristica fragrans Houtt. Essential Oil by Dual Enzyme Assisted Steam Distillation and Its Component Analysis by GC-MS

Abstract： Dual enzyme assisted steam distillation is used to extract essential oil from Myristica fragrans Houtt. in Guangxi， and its components are analyzed by GC-MS. The orthogonal experimental results indicate that the optimal extraction process conditions are enzyme addition amount of 2%， enzymatic hydrolysis pH of 4.0 and enzymatic hydrolysis temperature of 40 ℃. Under these conditions， the yield of essential oil from Myristica fragrans Houtt. is 6.50 mL/100 g. Fifty-six compounds are identified in essential oil by GC-MS and retention index method， accounting for 99.71% of the total essential oil. The main components are myristicin （16.60%）， methyleugenol （14.78%）， sabinene （13.47%）， （+）-limonene （7.29%）， terpinen-4-ol （6.75%）， elemicin （6.62%）， γ-terpinene （4.28%）， trans-methyl eugenol （3.73%）， β-pinene （3.59%） and safrole （3.22%）.

Key words： essential oil from Myristica fragrans Houtt.; dual enzyme assisted steam distillation; extraction; GC-MS; component analysis; retention index

肉豆蔻（Myristica fragrans Houtt.），又稱頂頭肉、玉果、扎地，是木蘭目肉豆蔻科豆蔻屬喬木植物肉豆蔻的干燥種仁，原產(chǎn)于馬魯古群島，如今在印度尼西亞、馬來西亞、西印度群島、巴西以及我國的粵、桂、瓊、閩、黔和臺灣等熱帶、亞熱帶地區(qū)分布廣泛[1]，其外表呈橢圓形，黑褐色，有皺紋，內(nèi)部有斑纈紋，易與草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata）和白豆蔻（Amomum verum Blackw.）混淆。肉豆蔻具有較高的藥食兩用價值，作為食品中常用的香辛料，有去異味、去腥、增香等功效，常用于鹵水及火鍋等中；另外，還有澀腸止瀉、溫中行氣、抑菌和平喘等藥用功效。肉豆蔻中含有肉豆蔻油、木脂素、苯丙素、總酚、黃酮、無機必需元素等成分[2]，其中精油含量較高，約占8%～15%，研究表明其具有抗癌、抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、保肝護肝等多種功能活性，有重要的開發(fā)利用價值[3-5]。

目前肉豆蔻精油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法、微波輔助水蒸氣蒸餾法、超聲-微波輔助水蒸氣蒸餾法以及超臨界CO2萃取法等[6-9]。酶輔助法是在水蒸氣蒸餾前加入適宜的酶對原料進行處理，使植物細胞壁組織水解，有效成分溶出，以提高精油得率的一種方法。此法可以縮短整體提取時間，且無需特殊設(shè)備、操作簡便。目前采用混合酶輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油并進行成分分析的研究鮮有報道。本研究以廣西產(chǎn)肉豆蔻為對象，優(yōu)化纖維素酶和果膠酶雙酶輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油的工藝，并采用GC-MS分析其成分，為完善和豐富肉豆蔻揮發(fā)性物質(zhì)的提取方法和指紋圖譜提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為其在天然抗氧化劑、保鮮劑以及抗菌劑等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉豆蔻：產(chǎn)地廣西壯族自治區(qū)；纖維素酶（10萬U/g）、果膠酶（6萬U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；無水硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；乙酸乙酯、正己烷（均為色譜純）：默克股份兩合公司；C7～C40正構(gòu)烷烴標準品：Sigma-Aldrich 公司；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

YP1201N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；800Y高速粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；XMTD-204水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；TSQ8000氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司；水蒸氣蒸餾裝置 上海予申儀器有限公司。

1.3 肉豆蔻精油的提取

1.3.1 原料前處理

將干燥、完整的原料肉豆蔻用高速粉碎機粉碎后，過80目篩，常溫密封備用。

1.3.2 提取工藝

根據(jù)《中國藥典》（2020年版）四部通則2204 揮發(fā)油測定法[10]和徐興堂等[11]的方法進行改良。稱取肉豆蔻粉末20 g，放入1 000 mL圓底燒瓶中，按料水比1∶10加入去離子水，加入2%的雙酶（纖維素酶∶果膠酶為1∶1），并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0，50 ℃下水浴酶解40 min；連接油水分離器和冷凝管，采用電熱套加熱至沸騰，水蒸氣蒸餾提取3 h。餾出液冷卻靜置30 min，讀取精油體積，計算提取得率。得率的計算公式如下：

1.3.3 單因素實驗設(shè)計

1.3.3.1 加酶量

分別加入0.5%、1%、2%、3%、4%的酶進行酶解反應(yīng)，其他步驟同1.3.2。

1.3.3.2 酶的比例

分別添加纖維素酶、果膠酶，纖維素酶和果膠酶的比例分別為2∶1、1∶1、1∶2，進行酶解反應(yīng)，其他步驟同1.3.2。

1.3.3.3 酶解時間

分別選擇10，20，40，60，80 min進行酶解反應(yīng)，其他步驟同1.3.2。

1.3.3.4 酶解溫度

分別于30，40，50，60，70 ℃水浴加熱進行酶解反應(yīng)，其他步驟同1.3.2。

1.3.3.5 酶解pH

分別將提取液的pH值調(diào)整至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0進行酶解反應(yīng)，其他步驟同1.3.2。

1.3.4 正交實驗優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇加酶量、酶解pH、酶解溫度3個因素，以精油提取得率作為考察指標，設(shè)計L9（33）正交實驗，篩選最佳提取工藝。正交實驗因素水平表見表1。

1.4 肉豆蔻精油的GC-MS成分分析

C7～C40正構(gòu)烷烴標準品用正己烷稀釋至100 μg/mL， 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供GC-MS進行保留指數(shù)分析。提取所得肉豆蔻精油樣品，加入無水硫酸鈉除水后，離心，取上清液，用乙酸乙酯稀釋至一定濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供GC-MS分析。

氣相色譜條件：HP-5MS 石英毛細管柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度260 ℃，載氣：氦氣，載氣流速 1 mL/min，進樣量1 μL。程序升溫：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至70 ℃（保持5 min），以5 ℃/min的速率升溫至160 ℃（保持5 min），以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃（保持2 min）；質(zhì)譜條件：離子源 EI 源，離子源溫度250 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，倍增管電壓1.2 kV，接口溫度260 ℃，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：40～550 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 加酶量對肉豆蔻精油提取得率的影響

酶的添加能分解構(gòu)成肉豆蔻細胞壁的纖維素、半纖維素及果膠，從而破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生局部的坍塌、溶解、疏松，減少溶劑提取時來自細胞壁和細胞間質(zhì)的阻力，加快精油成分溶出細胞的速率。不同加酶量下精油的提取得率見圖1。

由圖1可知，加酶量在2%時得率最高。在一定范圍內(nèi)，得率隨著加酶量的升高而增加，這是由于酶用量的增加使得酶解反應(yīng)更加充分、完整，因此提取得率顯著增加。當加酶量大于2%時，得率反而降低，可能是因為酶與肉豆蔻充分接觸，反應(yīng)更快、更徹底，導(dǎo)致后期步驟中部分精油揮發(fā)而損失，使最終得率不高[12]。且酶用量增加會使生產(chǎn)成本增加，因此較優(yōu)的加酶量為2%。

2.1.2 酶的比例對肉豆蔻精油提取得率的影響

不同酶的比例下精油的提取得率見圖2。

由圖2可知，雙酶復(fù)合提取肉豆蔻精油的得率高于單酶。當纖維素酶和果膠酶的比例為1∶1時得率最高。這是因為雙酶協(xié)同作用提升了原料細胞壁中纖維和果膠等成分的分解效果，得率提高。因此，較優(yōu)的酶的比例為1∶1。

2.1.3 酶解時間對肉豆蔻精油提取得率的影響

不同酶解時間下精油的提取得率見圖3。

由圖3可知，隨著酶解時間的增加，酶與肉豆蔻的接觸時間更長，酶解更徹底，得率增大。當酶解時間超過40 min后，得率顯著降低，可能是因為酶解時間過長，酶活性逐漸降低，甚至失活。因此，較優(yōu)的酶解時間為40 min。

2.1.4 酶解溫度對肉豆蔻精油提取得率的影響

不同種類的酶作用溫度不同，纖維素酶的反應(yīng)溫度范圍為40～50 ℃，果膠酶的作用溫度范圍為15～55 ℃。不同酶解溫度下精油的提取得率見圖4。

由圖4可知，酶解溫度在50 ℃時得率最高，低于50 ℃時，得率隨溫度的升高而增加。因為隨著溫度升高，纖維素酶、果膠酶的活力提高，促進了肉豆蔻細胞壁中纖維素、果膠的分解，使得率相應(yīng)增加。當溫度超過50 ℃后，得率降低，這是因為溫度過高，超過了纖維素酶和果膠酶協(xié)同作用的最適溫度，酶活降低，減緩了分解速度，使得率降低。因此，較優(yōu)的酶解溫度為50 ℃。

2.1.5 酶解pH對肉豆蔻精油提取得率的影響

不同種類的酶作用pH不同，在一定pH范圍內(nèi)，酶均有一定活性。根據(jù)酶的產(chǎn)品說明，纖維素酶的作用pH為4.5～6.5，最適pH為4.8；果膠酶的作用pH為2.5～6.0，最適pH為3.5。不同酶解pH下精油的提取得率見圖5。

由圖5可知，酶解pH越接近4.0，精油得率越高。這是因為越接近雙酶協(xié)同的最適pH，酶活越高，促進了細胞壁分解和產(chǎn)物釋放；當酶解pH小于或者大于4.0時，即高于或低于最適pH，都會導(dǎo)致酶的活性降低，甚至逐漸失活，得率降低[12]。pH為2.0時得率最低，僅有3.50%。因此，較優(yōu)的酶解pH為4.0。

2.2 正交實驗結(jié)果分析

正交實驗結(jié)果見表2。

由表2可知，R值反映各因素影響實驗結(jié)果的主次關(guān)系，R值越大，表明該因素對實驗指標的影響越大，該因素越重要[13]。由極差分析結(jié)果可知，3個因素對得率的影響程度為A>B>C，正交實驗范圍內(nèi)的最優(yōu)條件為A2B2C1，即加酶量2%、酶解pH 4.0、酶解溫度40 ℃。

2.3 精油成分分析

所提取的肉豆蔻精油經(jīng)GC-MS分離出58種化合物，與NIST質(zhì)譜圖庫比對并結(jié)合保留指數(shù)，共鑒定出56種成分，占精油成分總量的99.71%，未鑒定出化合物2種，總離子流色譜圖見圖6。通過峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，精油成分及含量見表3。

文獻[14-19]研究表明，不同部位、季節(jié)、產(chǎn)地、提取方法得到的肉豆蔻精油成分及含量差異比較大，但均以萜烯類和酚類化合物為主。由表3可知，含量大于3%的成分有10種，其中肉豆蔻醚含量（16.60%）最高，其次為甲基丁香酚（14.78%）、檜烯（13.47%）、（+）-檸檬烯（7.29%）、4-萜烯醇（6.75%）、欖香素（6.62%）、γ-松油烯（4.28%）、β-蒎烯（4.17%）、反式-甲基異丁香酚（3.73%）和黃樟素（3.22%）。精油中肉豆蔻醚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚、4-萜烯醇和欖香素等含氧化合物含量較高，對于其抗氧化性和抑菌性起到了較關(guān)鍵的作用。同時，順式-摩勒-4（15），5二烯、欖香烯、δ-欖香烯3種成分為首次發(fā)現(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究以廣西產(chǎn)肉豆蔻為原料，采用纖維素酶、果膠酶雙酶輔助水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻精油，通過正交實驗得到的最優(yōu)工藝條件為加酶量2%、酶解pH 4.0、酶解時間3 h，在此條件下提取得率為6.50 mL/100 g，3個因素對得率的影響程度為加酶量＞酶解pH＞酶解時間；利用GC-MS對所提取的精油進行成分分析，共鑒定出化合物56種，占精油總量的99.71%，其中含量大于3%的成分有10種，首次發(fā)現(xiàn)的成分有3種。綜上所述，雙酶輔助水蒸氣蒸餾法較傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法整體提取時間縮短，得率有一定提高；所提取的精油在成分上與我國云南產(chǎn)的肉豆蔻精油較接近，但是甲基丁香酚和欖香素的含量與其他產(chǎn)地和提取方法的肉豆蔻精油相比明顯較高。

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