QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中甲硝唑和地美硝唑藥物殘留量

摘 要：建立了QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中甲硝唑和地美硝唑殘留量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS凈化后，使用Agilent Eclipse Plus C18柱分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測模式下檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，甲硝唑和地美硝唑的質(zhì)量濃度在0～50 ng·mL-1時(shí)線性關(guān)系良好（r2＞0.999），檢出限分別為0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1；在低、中、高3個(gè)添加水平下甲硝唑和地美硝唑的加標(biāo)回收率分別為95.79%～97.80%、95.66%～100.10%。該方法前處理簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于雞蛋中甲硝唑、地美硝唑的測定。

關(guān)鍵詞：雞蛋；甲硝唑；地美硝唑；QuEChERS；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

Determination of Metronidazole and Dimetridazole Residues in Eggs by QuEChERS Combined with Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry

WANG Yi

（Guangdong Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute， Huizhou 516000， China）

Abstract： A QuEChERS combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method was established to determine the residues of metronidazole and dimetridazole in eggs. The sample was extracted with acetonitrile， purified with QuEChERS， and separated using an Agilent Eclipse Plus C18 column. The mobile phase was eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution， and detected under multiple reaction monitoring mode. The external standard method was used for quantification. The results showed that the mass concentrations of metronidazole and dimetridazole were linear in the range of 0～50 ng·mL-1?（r2＞0.999）， and the detection limits were 0.002 μg·kg-1 and 0.007 μg·kg-1; under low， medium and high addition levels， the recoveries were 95.79%～97.80%， 95.66%～100.10% respectively. The method is simple， reproducible and sensitive， and is suitable for the determination of metronidazole and dimetridazole in eggs.

Keywords： eggs; metronidazole; dimetridazole; QuEChERS; ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry

雞蛋含有非常豐富的卵磷脂、脂肪、蛋白質(zhì)、微生物、礦物質(zhì)、微量元素等營養(yǎng)成分，被譽(yù)為“全營養(yǎng)”食品[1]，現(xiàn)已成為日常飲食中的重要組成部分。

甲硝唑、地美硝唑是人工合成的硝基咪唑類藥物，主要用于治療或者預(yù)防家禽的厭氧菌感染、滴蟲病感染以及生殖系統(tǒng)疾病等[2]，但該藥物對人體會(huì)產(chǎn)生較大危害。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019），甲硝唑和地美硝唑可以作為治療使用，但不可以在動(dòng)物性食品中檢出[3]。但部分養(yǎng)殖戶對此類藥物的毒副作用了解不全面，在飼養(yǎng)過程中超量使用，帶來了藥物殘留問題[4]。

近幾年，我國制定、發(fā)布了一些針對硝基咪唑類等藥物的檢驗(yàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)[5-7]，但是針對雞蛋中硝基咪唑藥物殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)較少。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性好以及穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為檢測這些藥物的首選方法[8]。在前處理環(huán)節(jié)，常用的凈化方式有固相萃取凈化法、分子印跡凈化法等[9]，但存在操作較復(fù)雜、試劑消耗量大、檢測耗時(shí)長、容易損失等問題。QuEChERS法具有快速、簡單、廉價(jià)、高效、可靠和安全的特點(diǎn)[10]，目前在獸藥殘留分析中已逐漸推廣和應(yīng)用。

本文結(jié)合QuEChERS法，通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對雞蛋中甲硝唑、地美硝唑進(jìn)行測定，有效縮短了實(shí)驗(yàn)分析時(shí)間，同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)回收率、節(jié)約了檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，市售；甲硝唑（MNZ）、地美硝唑（DMZ）標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞99%，購于DR；甲醇、乙腈（色譜純，默克）；甲酸（色譜純，阿拉?。?；實(shí)驗(yàn)用水為純水機(jī)制備的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC1290超高效液相色譜儀、QQQ-6470液質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫）；KQ-600DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TurboVap氮吹儀（Biotage）；BC-1000多管渦旋混合儀（深州逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司）；H1750R冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；UPL-Ⅱ-40U落地式超純水機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg·L-1）：分別精密稱取甲硝唑、地美硝唑10 mg，用甲醇稀釋并定容至10 mL，配制成濃度為1 000 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取甲硝唑、地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至終濃度為1.0 mg·L-1。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別稱取6份5 g不含甲硝唑、地美硝唑的雞蛋樣品于50 mL塑料離心管，分別準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，使得最終濃度為0 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1，其余操作同上。

1.3.2 樣品處理

（1）樣品制備。取有代表性的樣品約500 g，敲入足夠大的容器中，用組織搗碎機(jī)混勻后分裝入潔凈容器中，待處理[11]。

（2）樣品的提取。稱取5 g上述已制備好的樣品于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，再加入緩沖鹽包（安譜dSPE定制獸藥緩沖鹽包），渦旋10 min，超聲波提取5 min后，9 000 r·min-1離心

5 min，得到上清液待凈化。

（3）凈化和濃縮。將上述提取液轉(zhuǎn)移至凈化管（安譜dSPE定制獸藥凈化管），渦旋5 min，9 000 r·min-1離心5 min。取5 mL上清液于10 mL玻璃試管中，40 ℃下氮吹至近干狀態(tài)，加入10%乙腈水溶液復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，待測定。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件

流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量為5 μL；色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源AJS-ESI；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥器溫度300 ℃；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流量12 L·min-1；干燥氣流量13 L·min-1；霧化氣壓力35 psi；多重反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化方式和復(fù)溶劑的選擇

分別使用固相萃取小柱（混合型強(qiáng)陽離子交換反向固相萃取柱）和QuEChERS對樣品進(jìn)行處理，選擇高效凈化雞蛋的方法。結(jié)果顯示，使用QuEChERS凈化的回收率高于固相萃取小柱，綜合考慮固相萃取小柱需要活化以及洗脫、溶劑使用量大、效率較下等因素，本文選用QuEChERS法凈化樣品。

前期實(shí)驗(yàn)采用10%乙腈水溶液、50%乙腈溶液以及純乙腈溶液進(jìn)行復(fù)溶。結(jié)果顯示，使用10%乙腈水時(shí)目標(biāo)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度最高，峰型以及分離度最佳，故本文選用10%乙腈水溶液進(jìn)行復(fù)溶。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

對濃度為0.1 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行SCAN全掃描，確定母離子、定性離子和定量離子，在多反應(yīng)檢測模式下對碰撞電壓、碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，最終確定質(zhì)譜條件，詳見表2。

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察流動(dòng)相體系中加入甲酸、乙酸銨和甲酸銨對目標(biāo)物的分離效果以及離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流動(dòng)相體系加入甲酸后，目標(biāo)物離子響應(yīng)強(qiáng)度增大，峰型對稱尖銳，分離效果好；加入乙酸銨和甲酸銨后，目標(biāo)物離子響應(yīng)強(qiáng)度下降，色譜峰存在展寬、拖尾的現(xiàn)象，故本文選用0.1%甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effects，ME）是保證定量結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵控制點(diǎn)，本次研究使用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行判定。當(dāng)ME=1時(shí)，基質(zhì)對目標(biāo)化合物沒有基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＞1時(shí)，基質(zhì)對目標(biāo)化合物有增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME＜1時(shí)，基質(zhì)對目標(biāo)化合物有抑制效應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，甲硝唑和地美硝唑的ME分別為1.71、2.31，表明雞蛋對兩個(gè)目標(biāo)化合物均有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，故選用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線對待測物進(jìn)行定量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.4項(xiàng)條件進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)如表3所示，在0～50 ng·mL-1，峰面積與目標(biāo)物濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

2.6 方法檢出限與定量限

分別以3倍和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限，結(jié)果見表3。甲硝唑和地美硝唑的檢出限分別為0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1，定量限分別為0.007 μg·kg-1、0.023 μg·kg-1，此方法檢出限較低，滿足測定要求。

2.7 精密度和加標(biāo)回收率

按1.3.2項(xiàng)下方法對樣品進(jìn)行處理，進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算甲硝唑、地美硝唑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表4可知，甲硝唑加標(biāo)回收率在95.79%～97.80%，RSD在2.22%～4.16%；地美硝唑加標(biāo)回收率在95.66%～100.10%，RSD為2.17%～3.65%。

2.8 樣品分析

隨機(jī)抽取市售雞蛋共20批次，采用本方法進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，這20批次雞蛋中均未檢出甲硝唑和地美硝唑。

3 結(jié)論

本研究建立了雞蛋中甲硝唑和地美硝唑殘留量的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測方法。樣品經(jīng)過乙腈提取，QuEChERS凈化濃縮后供UPLC-MS/MS檢測，該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以為雞蛋質(zhì)量安全監(jiān)測提供一定的技術(shù)支持。

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作者簡介：王易（1997—），女，浙江寧波人，本科，工程師。研究方向?yàn)槭称贩较颉?/p>