泰山黃精寄生真菌的分離鑒定

穆淑媛 付均惠 秦寧 董斌 龐獻(xiàn)偉 仉勁

摘? ?要? ?在山東省泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)泰山黃精栽培基地采集泰山黃精病株，用組織分離法對(duì)其寄生真菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定，共分離出寄生真菌18株，其中鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌7株、刺盤(pán)孢屬（Colletotrichum sp.）真菌5株、鐮刀菌屬（Fusarium sp.）真菌2株，其他聚生小穴殼菌（Dothiorella gregaria）、高粱附球菌（Epicoccum sorghinum）、Diaporthe eres、數(shù)絲頂多毛孢（Bartalinia robillardoides）各1株。

關(guān)鍵詞? ?泰山黃精;病害;寄生真菌;鑒定

黃精（Polygonatum sibiricum Red.），又名老虎姜、仙人余糧，為百合科黃精屬多年生草本植物，是泰山四大名藥之一，在國(guó)內(nèi)享有盛譽(yù)。黃精以其根莖入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤(rùn)肺、益腎的功效，在我國(guó)已有2 000多年的藥用歷史。其根莖富含多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素等，兼具藥用和食用價(jià)值，國(guó)內(nèi)研發(fā)了多種具有保健功能的黃精食品、飲品、護(hù)膚品等。目前在四川、貴州、安徽、河南、遼寧等地已有規(guī)?；斯ぴ耘?，山東泰安、威海等地也得到快速發(fā)展。但隨著集中栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大，黃精病害也日益嚴(yán)重，影響了黃精的產(chǎn)量和質(zhì)量。已報(bào)道的黃精病害主要有葉斑病、炭疽病、葉枯病、根腐病、花腐病、病毒病等，以真菌病害為主，但目前對(duì)泰山黃精病害的研究較少。筆者對(duì)泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)人工栽培的泰山黃精的寄生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，為病害防治提供依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料? ?2021年6月，在泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)黃精栽培基地采集泰山黃精病株7株。

1.2? ?方法

1.2.1? ?真菌分離? ?將不同癥狀的病葉、病根用清水清洗晾干后，用75%酒精浸沒(méi)消毒30 s，0.1%升汞浸沒(méi)消毒1 min，無(wú)菌水清洗3遍，用無(wú)菌吸水紙吸取葉片水分后，剪取病健交界部放到PDA培養(yǎng)皿上，28 ℃避光培養(yǎng)3～5 d，觀察同一培養(yǎng)物上長(zhǎng)出的菌落顏色、形狀等是否相同，若有則進(jìn)一步分離純化，直至長(zhǎng)出單一菌落。

1.2.2? ?形態(tài)學(xué)鑒定? ?觀察PDA培養(yǎng)基上菌落的顏色、形態(tài)變化，并在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄孢子形態(tài)特征。查閱《真菌鑒定手冊(cè)》等，初步鑒定菌株種類(lèi)。

1.2.3? ?分子生物學(xué)鑒定? ?用真菌基因組DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）提取菌株的基因組DNA。ITS序列PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×PCR Buffer、2 μL dNTPs（10 mmol/L）、1 μL ITS1、? ? 1 μL ITS4、0.25 μL Taq酶、1 μL DNA模板，17.25 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，55 ℃? ?1 min，72 ℃1 min，33個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。ITS序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）的合成及PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序均由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司完成。通過(guò)NCBI-Nucleotide BLAST分析測(cè)序結(jié)果，以相似度最高的序列作為參考序列，根據(jù)Per.Ident值確定目的菌株分類(lèi)地位。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?寄生真菌分離結(jié)果? ?從采集樣品中共分離出18皿真菌（圖1），對(duì)分離出的寄生真菌菌落形態(tài)特征觀察記錄并統(tǒng)計(jì)（表1），分析可知，18株菌株可歸為11組。

2.2? ?分子生物學(xué)鑒定結(jié)果? ?由表2可知，各菌株ITS序列與參考序列的相似值均超過(guò)99%，可初步認(rèn)定為同一種。綜合分析表1～2、圖2可知，分離出鏈格孢屬真菌共7株，占菌落總數(shù)的38.89%，其中包括細(xì)極鏈格孢菌2株，交互鏈格孢菌5株;分離出刺盤(pán)孢屬真菌共6株，占菌落總數(shù)的27.78%，其中包括旋卷蔥刺盤(pán)孢菌2株、山茶刺盤(pán)孢菌2株、膠孢炭疽菌1株;鐮刀菌屬真菌2株，占菌落總數(shù)的11.11%;此外還分離出聚生小穴殼菌、高粱附球菌、Diaporthe eres、數(shù)絲頂多毛孢各1株。

因此，可初步認(rèn)定，泰安市林業(yè)局實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)人工栽培黃精的優(yōu)勢(shì)寄生種為鏈格孢屬真菌和刺盤(pán)孢屬真菌，且有包括鐮刀菌在內(nèi)的其他多種寄生真菌混合侵染。

3? ?討論與結(jié)論

本研究確定泰山黃精的葉部病害主要致病菌為鏈格孢屬和刺盤(pán)孢屬真菌。刺盤(pán)孢屬真菌能引起黃精炭疽病，但對(duì)葉斑病病原菌研究有不同觀點(diǎn)，主要認(rèn)為葉斑病的病原菌有交互鏈格孢菌（A.alternata）、細(xì)極鏈格孢菌（A.tenuissima）、葉點(diǎn)霉屬（Phyllostictasp. sp）等。因此，根據(jù)本次分離鑒定結(jié)果和發(fā)病癥狀，初步認(rèn)為鏈格孢菌侵染泰山黃精引起葉斑病、刺盤(pán)孢屬真菌引起黃精炭疽病，在防治泰山黃精病害時(shí)，應(yīng)以鏈格孢屬和刺盤(pán)孢屬真菌為主，篩選敏感藥劑，提高防治效果。

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【基金項(xiàng)目】：泰安市農(nóng)業(yè)良種項(xiàng)目“泰山黃精新品種選育與示范推廣”（2023NYLZ11）;泰安市科技創(chuàng)新發(fā)展項(xiàng)目（政策引導(dǎo)類(lèi)）“泰山黃精主要病蟲(chóng)害發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)研究”（2020NS063）。

穆淑媛，付均惠，秦寧，龐獻(xiàn)偉，仉勁，山東省泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院，郵編271000;董斌，泰安市泰山森林病蟲(chóng)害防治檢疫站。

收稿日期：2023-12-13

*通訊作者：仉勁（E-mail：zhjin0214@163.com）