穩(wěn)定表達ATP5a 細胞系的建立

閆浩鑫，李明蔚，吳 洋，郭龍軍★，馮 力，★

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

線粒體ATP 合酶是一種位于線粒體膜內(nèi)的多亞基酶復合物，是生理條件下氧化磷酸化所必需的。ATP 合酶由兩部分組成：F1 的水溶性蛋白質復合物和疏水部分F0。F1 由3 種α 亞基和3 種β亞基交替排列,組成六聚環(huán)狀定子。F0 部分由a、b2、c10～15 等3 種亞基組成。其中F1 部分的α 亞基由ATP5a(55kd)編碼，ATP5a 在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能，例如ATP5a 在結腸癌的細胞增殖中起促進作用，以及其與前列腺癌發(fā)展之間存在相互關聯(lián)。ATP5a 的表達失調(diào)在已在幾種惡性腫瘤中報道，但它在不同的癌癥類型中顯示出致癌或腫瘤抑制作用。但與病毒之間的關系尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)編碼的E 蛋白可以通過抑制ATP5a 誘導細胞凋亡，從而促進病毒的復制。另有研究表明，ATP5a 與輪狀病毒（Rotavirus,RV）的3'UTR 具有高親和力。ATP5a 的基因缺失減少了感染性病毒子代的產(chǎn)生，并在RV 基因組組裝和顆粒形成中起一定的作用。

雖然ATP5a 參與了許多癌變與病毒感染過程，但該蛋白的生物學功能尚不清楚。為進一步研究ATP5a 的功能，構建一個穩(wěn)定的、可表達ATP5a 的細胞系，將有助于相關研究領域的發(fā)展。本研究將ATP5a 克隆到修飾過的PLVX-IRES-ZsGreen1 載體上，建立了穩(wěn)定表達ATP5F1A 的細胞系。我們通過Western Blotting 驗證ATP5a 細胞系的穩(wěn)定表達。

1 材料與方法

1.1 細胞與質粒 293T 細胞和IPI-2I 細胞保存于本實驗室，DH5α 感受態(tài)和慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1 及相應的輔助質粒PSPAI2、PMG 2.0 保存于本實驗室。

1.2 試 劑 T4 連接酶、PCR 酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司和Thermos Scientific 公司；KOD NEO高保真DNA 聚合酶購自TOYOBO 公司；PCR 清潔試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購于Axygen 有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Gibico 公司；胎牛血清購自內(nèi)蒙古奧普賽生物科技有限公司；轉染試劑購自Roche 公司；anti-HA tag（1∶10000）以及anti-β-actin（1∶3000）購自Sigma 公司；羊抗鼠IgG（H&L）-Dy680（1∶10000）購自LI-COR 公司。

1.3 ATP5a 引物設計 根據(jù)GenBank 網(wǎng)站中的上huATP5aCDS 區(qū)序列（NG_041769.2），使用軟件SnapGene4.1.9 設計一對擴增ATP5a 的特異性引物，引物序列（見表1）。

表1 引物序列

1.4 慢病毒表達質粒的構建 以本實驗室保存的PCAGGS-ATP5a 質粒作為模板，以Ecor1-F 和Xbal-R 為引物。進行人ATP5a 基因的擴增。獲得PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，使用PCR 清潔試劑盒去除雜質，將ATP5a 片段與PLV-IRES-Zs-Green1 載體均使用Ecor1 和Xbal 雙酶切，條件為37 ℃，酶切1 h。酶切完畢后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并利用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物。使用T4 連接酶體系16 ℃過夜連接。次日連接產(chǎn)物用DH5α 感受態(tài)進行轉化，經(jīng)由菌落PCR 鑒定后測序。將測序正確的質粒命名為PLV-IRES-Zs-Green1-ATP5a 并保存于-20 ℃冰箱中。

1.5 慢病毒的包裝 使用去除內(nèi)毒素質粒提取試劑盒提取慢病毒表達質粒pLVX-IRES-Zs-Green1-ATP5a,并與輔助質粒PSPAI2 和輔助質粒PMG2.0 組成三質粒慢病毒包被體系pLVX-IRES-Z sGreen1-ATP5a、PSPAI2 和PMG2.0 質量比為3：2：1，用Roche 轉染試劑共轉HEK-293T 細胞中，48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況，收取上清培養(yǎng)基，過0.45 μm 濾膜。收集病毒，測定重組慢病毒滴度，并分裝于-80 ℃保存。

將IPI-2I 細胞平鋪于100 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞密度達至70%～90%時。接種重組慢病毒3 mL，并加入6 μL 的Polybrene，充分混勻后在37 ℃細胞箱敷育1 h。補充培養(yǎng)液至10 mL。36 h 后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的熒光情況，利用流式細胞術篩選表達綠色熒光的IPI-2I 細胞，經(jīng)由培養(yǎng)傳代后可得到穩(wěn)定表達ATP5a 的IPI-2I 細胞系。

1.6 Western Blotting 選取培養(yǎng)傳代后得到得IPI-FX/ATP5F1A 細胞，收集細胞沉淀，加入含有PMSF 的RIPA 細胞裂解液，冰上裂解30 min，離心收集上清加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min，上樣（濃縮膠80 V，分離膠120 V）,將凝膠轉移至NC膜,冰浴恒流200 mA 90 min，提前配制封閉液（一直用的4% TBST 配制的脫脂奶粉），將膜放入含有5%脫脂乳的封閉液中室溫孵育1 h，棄去封閉液，PBST 洗2 次，加入5%BSA 稀釋的一抗4 ℃過夜孵育，次日，PBST 洗膜3 次×5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育45 min，利用顯色。

2 結果

2.1 ATP5a 擴增產(chǎn)物的鑒定以及雙酶切鑒定 目的基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1528bp 的特異性目的條帶，與預期結果一致，見圖1a。重組慢病毒表達質粒經(jīng)ECORI 和Xbal 雙酶切，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1528bp 的特異性目的條帶，與預期結果一致，見圖1b，表明ATP5a 基因成功插入慢病毒基因組內(nèi)。

圖1 PCR 擴增產(chǎn)物及酶切鑒定

2.2 重組慢病毒表達質粒的表達 將感染慢病毒的293T 細胞在顯微鏡下觀察熒光，收集沉淀通過Western blotting 檢測ATP5a 的表達，與對照相比，轉染細胞組在55KD 出現(xiàn)特異性目的條帶，重組質粒成功表達（見圖2）。

圖2 293T 細胞Western Blot 分析

2.3 ATP5a 過表達IPI-2I 細胞中ATP5a 熒光觀察 將感染重組慢病毒的IPI-2I 細胞顯微鏡下觀察熒光，結果顯示，與對照IPI-2I 細胞相比，IPI-2I-ATP5a 細胞中的綠色熒光明顯增多（見圖3），表明IPI-2I-ATP5a 細胞系構建成功。

圖3 IPI-2I 細胞的熒光圖像

2.4 流式細胞術鑒定IPI-2I-ATP5a 細胞系 將感染重組慢病毒的IPI-2I 細胞和對照細胞通過流式分選，結果顯示，與對照IPI-2I 細胞相比，獲得更多的IPI-2I-ATP5a 細胞（見圖4），表明IPI-2I-ATP5a細胞系構建成功。

圖4 IPI-2I 細胞流式細胞術篩選

2.5 IPI-2I-ATP5a 細胞中ATP5a 的檢測結果 收集IPI-2I-ATP5a 和IPI-2I-PLVX 細胞沉淀，通過western blotting 檢測ATP5a 的表達，與對照相比，IPI-2I-ATP5a 細胞組在55KD 出現(xiàn)特異性目的條帶，表明IPI-2I-ATP5a 細胞系構建成功（見圖5）。

圖5 IPI-FX/ATP5F1A western blot 分析

3 討論

慢病毒最早可追溯至1989 年開發(fā)的一種可攜帶外源目的基因的復制型慢病毒，由于初代慢病毒來自于HIV 病毒因而具有高突變率具有安全隱患。因此為了提高慢病毒的安全性開發(fā)了第一代至第四代慢病毒載體系統(tǒng)，第一代系統(tǒng)采取三質粒系統(tǒng)包含包裝質粒、包膜蛋白質粒、穿梭質粒組成。以后的三代都是在一代的載體系統(tǒng)上優(yōu)化而來。其中我們選取的PLVX-IRES-ZsGreen1 也安全的應用在其他的慢病毒包裝體系。

ATP 合酶是幾乎所有真核生物和原核生物中主要的能量生產(chǎn)酶，近年來對ATP 合酶的不斷研究。其中ATP5a 是ATP 合酶重要的組成部分，ATP5a 與PRRSV 病毒的Gp5 蛋白之間存在相互作用，Gp5 可能與PSSRV E 蛋白共同作用ATP5a 來感染宿主。在細胞系研究中，科學家通常會使用基因編輯技術如CRISPR/Cas9 來改變ATP5a 基因的表達水平，以觀察細胞內(nèi)能量代謝的變化。這樣的研究有助于揭示ATP5a 基因的功能和調(diào)控機制，在細胞生物學和醫(yī)學研究領域具有重要意義。此外，ATP5a 細胞系還可以應用于藥物篩選和治療方法的研究。通過研究ATP5a 基因的功能和與之相關的信號通路，科學家可以發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點，為相關疾病的治療提供新途徑。

穩(wěn)定表達ATP5a 細胞系是一種用于研究細胞能量合成和與之相關疾病的重要工具。通過對該細胞系的研究，我們可以更好地理解細胞內(nèi)能量代謝的機制，并為相關疾病的治療提供科學依據(jù)。