色譜結(jié)合光譜技術(shù)建立棗仁寧神膠囊質(zhì)量控制方法※

郭丁妮，席嘯虎

（山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012）

棗仁寧神膠囊由炒酸棗仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首烏藤、太子參、苦參、丹參、烏梅、合歡皮、全蝎、甘草等組成，具有養(yǎng)心安神、健脾養(yǎng)血的功效，可用于治療心煩、心悸、失眠多夢(mèng)、健忘、焦慮等癥。棗仁寧神膠囊為本院院內(nèi)制劑，目前醫(yī)院制劑質(zhì)量控制手段主要為處方中1／3以上藥味完成薄層色譜法（TLC）定性檢測(cè)及1味以上關(guān)鍵藥味指標(biāo)成分完成含量測(cè)定［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，可采用TLC進(jìn)行中藥制劑定性檢測(cè)和高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行定量檢測(cè)［2-4］。在實(shí)際操作過(guò)程中，此標(biāo)準(zhǔn)還有一些待改進(jìn)之處：醫(yī)院制劑基本為水提，大多藥材水提后指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率較低，檢測(cè)效果不佳；TLC及HPLC不能有效驗(yàn)證動(dòng)物類藥材，同時(shí)不能對(duì)制劑的綜合成分進(jìn)行分析；TLC和HPLC技術(shù)需要的人力、財(cái)力和時(shí)間較多。醫(yī)院制劑質(zhì)量控制需對(duì)制劑中不同功效藥材的綜合成分進(jìn)行綜合把控，對(duì)主要藥材及其主要成分進(jìn)行重點(diǎn)把控，并合理、有效、及時(shí)地反饋質(zhì)量信息［5］。近紅外光譜技術(shù)（NIRS）是一種間接分析技術(shù)，具有分析速度快、多成分分析、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于中藥定性鑒別、有效成分定量分析等方面的研究［6-8］。本研究采用色譜結(jié)合NIRS，通過(guò)建立指紋圖譜和近紅外快速檢測(cè)模型，對(duì)棗仁寧神膠囊的綜合成分和主要藥材進(jìn)行質(zhì)量控制分析，以探索適合醫(yī)院制劑質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)體系。

1 儀器與藥材

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent公司）；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Grace公司）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）（Agilent公司）；AntarisⅡ傅立葉近紅外光譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；BP211D、BP310P電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥 棗仁寧神膠囊為山西省中醫(yī)藥研究院院內(nèi)制劑，收集2019年3月至2021年8月共18個(gè)批次用于本研究。棗仁寧神膠囊的組成藥物炒酸棗仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首烏藤、太子參、苦參、丹參、烏梅、合歡皮、全蝎、甘草經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院藥劑科主任藥師鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 試劑 對(duì)照品丹參素鈉（批號(hào)：110855-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)純度＞98%）、甘草苷（批號(hào)：111610-202209，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。芹糖甘草苷（批號(hào)：190907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)純度＞98%）、甘草素（批號(hào)：191018，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。其余試劑為分析純或色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜及指標(biāo)成分含量測(cè)定

（1）色譜條件 色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～10 min，5%A；10～60 min，5%～40%A；60～70 min，40%～5%A），流速為1 m L·min－1；柱溫為30℃，波長(zhǎng)為230 nm，進(jìn)樣量為10μL。

（2）溶液的制備及色譜圖 ①對(duì)照品溶液的制備：精密稱定丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素等對(duì)照品適量，加甲醇配制成一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，濃度依次為：200.2、66.2、54.6、61.2、109.8μg／m L。②供試品溶液的制備：稱取棗仁寧神膠囊粉末2.5 g，精密稱定，置100 m L具塞錐形瓶中，加85%甲醇100 m L，稱定重量，80℃水浴中加熱回流30 min，超聲處理20 min，冷卻，補(bǔ)足重量，取續(xù)濾液，即得。棗仁寧神膠囊對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1、圖2。

圖1 棗仁寧神膠囊對(duì)照品色譜圖

圖2 棗仁寧神膠囊供試品色譜圖

（3）方法學(xué)考察 取20210614批次棗仁寧神膠囊若干份，每份約2.5 g，精密稱定，運(yùn)用HPLC同時(shí)檢測(cè)棗仁寧神膠囊中5種化學(xué)成分的含量，進(jìn)行系統(tǒng)的方法學(xué)考察。結(jié)果顯示，丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）依次為1.77%、1.97%、2.01%、1.12%、1.25%（連續(xù)進(jìn)樣5次），重復(fù)性RSD 依次為2.85%、2.36%、2.66%、1.54%、2.38%（連續(xù)進(jìn)樣5次），穩(wěn)定性（樣品溶液制備后1、2、4、6、12 h）RSD 依次為1.02%、1.14%、1.33%、1.85%、0.95%（連續(xù)進(jìn)樣5次），說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確性。加樣回收率結(jié)果見表1。

表1 棗仁寧神膠囊加樣回收率結(jié)果

（4）特征圖譜的建立及5種成分含量下限確定選擇2019年3月至2021年8月本院生產(chǎn)棗仁寧神膠囊的13個(gè)批次，按照2.1項(xiàng)下“色譜條件”構(gòu)建特征圖譜，結(jié)果見圖3。通過(guò)對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)13個(gè)共有峰，其中可指認(rèn)色譜峰5個(gè)，依次為丹參素鈉（3號(hào)峰）、芹糖甘草苷（6號(hào)峰）、甘草苷（8號(hào)峰）、甘草素（10號(hào)峰）、大黃素（12號(hào)峰），平均含量依次為0.181 8%、0.030 6%、0.022 7%、0.053 4%、0.002 6%，含量下限按平均值下浮20%，依次確定為0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，具體見表2。

表2 棗仁寧神膠囊5種指標(biāo)成分含量下限確定

圖3 棗仁寧神膠囊特征圖譜

2.2 NIRS光譜分析

（1）圖譜的采集 醫(yī)院制劑室實(shí)際生產(chǎn)工藝優(yōu)化后做實(shí)驗(yàn)室研究，全蝎、太子參、百合直接粉碎，其余加水浸泡2 h，提取2次，每次2 h，過(guò)濾，取濾液，濃縮至一定濃度，加全蝎、太子參、百合粉末，混勻，干燥，粉碎，過(guò)篩。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別制備包含酸棗仁、珍珠母的全處方原方劑量提取物及依次缺失上述單味藥的對(duì)照提取物，按制劑制備工藝制成粗粉，備用。共制備棗仁寧神方全方提取物粗粉20批次，缺棗仁方提取物粗粉15批次，缺珍珠母方提取物粗粉15批次。各樣品置于樣品杯中，等量裝樣，約5 g，有效覆蓋樣品杯底面。采集條件：分辨率8 cm－1，掃描次數(shù)32次，掃描范圍4 000～10 000 cm－1，每次掃描前搖蕩樣品杯，每個(gè)樣品重復(fù)裝樣并掃描3次，同時(shí)獲取平均值圖譜。20批全方、15批缺棗仁方、15批缺珍珠母方共50批的200條NIRS圖疊加圖見圖4。

圖4 棗仁寧神膠囊近紅外光譜疊加圖

（2）NIRS模型的建立及驗(yàn)證 在TQ analyst光譜分析軟件中導(dǎo)入已采集好的200條光譜，按4∶1的比例分配定標(biāo)集和驗(yàn)證集，對(duì)選中光譜進(jìn)行波長(zhǎng)選擇、標(biāo)準(zhǔn)化處理和微分計(jì)算，建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，并進(jìn)行模型內(nèi)驗(yàn)證。最終確定的模型數(shù)據(jù)為：Constant預(yù)處理，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為4 000～10 000 cm－1全譜。模型驗(yàn)證，準(zhǔn)確度依次為：是否缺酸棗仁100.0%，是否缺珍珠母97.5%。

3 討論

本研究運(yùn)用色譜結(jié)合光譜技術(shù)建立棗仁寧神膠囊質(zhì)量控制方法，首先通過(guò)建立特征圖譜，發(fā)現(xiàn)有13個(gè)共有峰，其中可指認(rèn)的有5個(gè)成分，分別為丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素，并按照平均值的80%確定各成分的含量下限，依次為0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，結(jié)合特征圖譜中未能指認(rèn)的共有峰對(duì)處方中的整體成分進(jìn)行有效把控。大黃素為首烏藤檢測(cè)成分，首烏藤可養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)；丹參素鈉為丹參指標(biāo)成分，丹參可行氣活血、清心除煩以安神；芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素為甘草指標(biāo)成分，甘草能健脾益氣、調(diào)和諸藥。上述藥物與其他藥物配伍，可養(yǎng)心安神、健脾養(yǎng)血、疏肝解郁、調(diào)暢情志。

棗仁寧神膠囊重用炒酸棗仁為君藥，酸棗仁可收斂生津、滋補(bǔ)肝膽、寧心安神，適用于治療虛煩難以入眠、驚悸多夢(mèng)等病證，珍珠母可定肝潛陽(yáng)、定驚安神，與酸棗仁配伍，可加強(qiáng)養(yǎng)心安神之效。酸棗仁皂苷A 和B均為脂溶性成分，在棗仁寧神膠囊生產(chǎn)過(guò)程中轉(zhuǎn)移率較低，無(wú)法用HPLC有效檢測(cè)；珍珠母為動(dòng)物類藥，其成分無(wú)法用TLC和HPLC有效檢測(cè)，或檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有專屬性。因此本研究采用NIRS對(duì)2種藥味建立快速定性檢測(cè)模型，以檢測(cè)制劑中是否含有這兩種藥材，結(jié)果顯示準(zhǔn)確率依次為100.0%和97.5%，但對(duì)其定量檢測(cè)仍需進(jìn)一步建立檢測(cè)模型。