miRNA 在糖尿病周圍神經(jīng)病變中的調(diào)控機制研究進展

王曉月，李捷，張璐璐，徐云生

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，山東濟南 250001）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的微血管并發(fā)癥，以對稱分布的感覺異常為主要臨床表現(xiàn)，DPN從遠端開始逐漸向近端擴散，呈手套和襪子樣分布，約50%的DM 患者會發(fā)生本癥［1］。DPN可進一步發(fā)展為糖尿病足，難以愈合的糖尿病足會引發(fā)壞疽，進而造成截趾或截肢，截趾或截肢后創(chuàng)面常難以愈合，從而引發(fā)各種感染等。因此，闡明DPN致病機制，早期對其進行干預，預防其進展有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNA，miRNA）的差異性表達與DPN的發(fā)病關系緊密［2-3］。因此，本文綜述miRNA 調(diào)控DPN的機制研究進展，闡述如下。

1 miRNA概述

miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性、非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～25個核苷酸，通過調(diào)控特定m RNA靶標的轉(zhuǎn)錄、翻譯和／或降解影響細胞功能［4］。一個miRNA可以同時靶向位于同一細胞信號通路的多個基因，miRNA 表達的任何變化都可能影響靶標調(diào)節(jié)的程度，從而影響細胞穩(wěn)態(tài)。因此，miRNA 的相對水平及其靶標m RNA 在各種疾病中起重要作用。miRNA已被證實可以影響許多重要的生物過程，如細胞生長、組織分化、細胞增殖、胚胎發(fā)育和細胞凋亡，失調(diào)的miRNA在衰老、心血管疾病和癌癥等各種疾病的進展中起關鍵作用，如影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5-6］。miRNA也可作為各種疾病和綜合征診斷和預后的潛在生物標志物。

2 miRNA在DPN中的作用機制

研究表明，miRNA 可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥、疼痛刺激機制和細胞損傷與修復過程參與DPN 的發(fā)?。?-8］。

2.1 調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥 CHANDRAMOORTHY H C等［9］在DPN患者和相關動物模型中發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)周圍的微血管中存在炎癥細胞因子［如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-8等］的異常表達。TNF-α作為細胞信號蛋白參與全身炎性反應，也是急性期炎性反應的關鍵細胞因子。TNF-α與DPN炎性反應密不可分，在DPN 患者血清中明顯升高［10］。TNF-α的激活可引起一系列下游炎性反應的發(fā)生，引起神經(jīng)細胞破壞和脫髓鞘，最終損害周圍神經(jīng)功能。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與炎性反應密切相關［11-13］。

（1）抗炎作用 miR-146a在DM 及DPN患者外周血中的表達均較低，且DPN患者miR-146a表達水平較單純DM 患者更低，可見，miR-146a表達水平與DPN病情嚴重程度有關［14-15］。FENG Y H 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，DPN模型大鼠IL-1β、TNF-α及核因子κB（NF-κB）等細胞因子呈高表達，而miR-146a表達降低。NF-κB是一種促炎轉(zhuǎn)錄因子，在miR-146a轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用。該研究將miR-146a與細胞因子進行Pearson相關分析，結(jié)果顯示，miR-146a與NF-κB、TNF-α和IL-1β的表達呈負相關［16］。IL-1受體相關激酶（IRAK1）和TNF受體關聯(lián)因子6（TRAF6）是Toll樣受體（TLR）啟動炎癥和免疫反應下游途徑的重要分子，miR-146a可通過抑制IRAK1和TRAF6的表達，使細胞因子的產(chǎn)生減少。由此認為，在長期高血糖條件下，miR-146a的表達降低，導致其對IRAK1、TRAF6及NF-κB的抑制作用減弱，并使IL-1β和TNF-α表達水平升高，引發(fā)DPN炎性反應。LIU X S等［17］使用miR-146a模擬物升高DPN模型小鼠血漿和坐骨神經(jīng)組織中的miR-146a水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-146a治療可顯著提高感覺和運動神經(jīng)傳導速度，降低熱刺激閾值，增加周圍神經(jīng)血流灌注、神經(jīng)纖維數(shù)量，促進軸突髓鞘形成，且在DPN 早期階段就開始采用miR-146a模擬治療，效果更佳。miR-146a模擬物可能通過其靶基因抑制NF-κB信號激活的炎性反應，從而發(fā)揮抗炎作用。

ZHANG Y Z等［18］在DPN模型小鼠中發(fā)現(xiàn)miR-25的表達水平降低，TNF-α和IL-1β表達水平升高，而miR-25過表達能顯著降低TNF-α和IL-1β的表達，表明miR-25是一種抗炎保護因子。另外，miR-25還可下調(diào)Nox4（一種炎癥促進因子）和活性氧（ROS）的表達，從而減輕氧化應激引發(fā)的細胞損傷，并通過下調(diào)晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）、晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）水平，減少蛋白激酶C-α磷酸化，進而抑制NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用，這表明miR-25可能是DPN的潛在診斷和治療靶點［18］。

以上研究表明，miRNA 可通過下調(diào)炎癥細胞因子的表達而抑制炎性反應，外源性miRNA 干預可防止血管神經(jīng)功能的進一步損害，減輕炎性反應，改善DPN癥狀，為通過miRNA 臨床診斷及治療DPN 提供了指導。

（2）促炎作用 CHEN J等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155拮抗劑可減輕周圍神經(jīng)的炎性反應，該結(jié)果與此前其他研究一致。miR-155 拮抗劑可降低促炎細胞因子（如TNF-α和IL-6）水平［20］。研究發(fā)現(xiàn)，在外周血巨噬細胞中，抑制miR-155可下調(diào)TNF-α和IL-1的表達水平［21］。此外，miR-155 抑制劑有助于降低IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白質(zhì)水平，從而減輕炎性反應［22］。CHEN J等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155靶向并抑制核因子E2相關因子2（Nrf2）的表達。Nrf2 的缺失會導致NF-κB活性增加，從而產(chǎn)生過多的細胞因子，引發(fā)炎性反應［23］。抑制miR-155或恢復Nrf2可促進大鼠雪旺細胞增殖并抑制體外細胞凋亡，減少ROS的產(chǎn)生和減輕炎性反應［19］。由此認為，靶向抑制miR-155-Nrf2治療可能有助于減少高血糖誘導的氧化應激和凋亡。可見，miRNA抑制劑能有效逆轉(zhuǎn)miRNA 引發(fā)的炎癥刺激，防治DPN。

2.2 疼痛刺激機制 YANG D等［24］通過建立糖尿病神經(jīng)性疼痛小鼠模型，證實miR-190a-5p 通過靶向SLC17A6導致糖尿病神經(jīng)性疼痛，SLC17A6也被稱為囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白2 基因（VGLUT2）。VGLUT2可誘導谷氨酸釋放增加，從而導致神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛的發(fā)生［25］。YANG D等［24］研究同時發(fā)現(xiàn)，用SLC17A6抑制劑治療后，糖尿病神經(jīng)性疼痛模型小鼠腰椎背角IL-1β和IL-6水平下調(diào)，小鼠疼痛行為改善。該研究發(fā)現(xiàn)，miR-190a-5p 的下調(diào)會導致SLC17A6水平升高，增強炎性反應，進而導致疼痛的發(fā)生［24］。

LIU W 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病神經(jīng)性疼痛模型大鼠脊髓背角神經(jīng)元中miR-9水平上調(diào)，且與鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑1（CALHM1）的表達呈正相關。CALHM1是一種新的鈣通道，位于神經(jīng)元膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。LIU W等［26］發(fā)現(xiàn)CALHM1可通過增加神經(jīng)元中Ca2＋流入和促進ATP的產(chǎn)生誘導嘌呤能P2X7受體（P2X7R）在脊髓背角膠質(zhì)細胞中的表達，而P2X7可調(diào)控神經(jīng)性疼痛中的ATP 釋放和Ca2＋濃度，miR-9 在激活ATP-P2X7R信號通路中的作用與CALHM1相同。另外，miR-9 可下調(diào)單核細胞趨化蛋白誘導蛋白1（MCPIP1），介導小膠質(zhì)細胞活化，導致促炎細胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）上調(diào)，引發(fā)神經(jīng)炎癥［27］。

WU B等［28］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病神經(jīng)性疼痛模型小鼠miR-193a水平下調(diào)，高遷移率族蛋白1（HMGB1）表達上調(diào)，且熒光酶測定結(jié)果證實miR-193a直接靶向HMGB1。研究證實，HMGB1在周圍神經(jīng)炎癥中發(fā)揮炎癥介質(zhì)作用，并參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制［29］。WU B等［28］給糖尿病神經(jīng)性疼痛模型小鼠注射miR-193a 模擬物后，逆轉(zhuǎn)了原本過表達的HMGB1水平，表明HMGB1在糖尿病神經(jīng)性疼痛中的過表達是由miR-193a水平下調(diào)引起的。另外，該研究證實HMGB1的過表達能顯著上調(diào)糖尿病神經(jīng)性疼痛模型小鼠腰椎背角中炎癥細胞因子（如IL-6、IL-1β和TNF-α）水平［28］，這與REN P C等［30］的研究結(jié)果吻合；而注射miR-193a模擬物后，炎癥細胞因子水平顯著降低，說明miR-193a能抑制由HMGB1過表達引起的增強的周圍神經(jīng)炎癥。因此，miR-193a可通過抑制HMGB1表達，減輕糖尿病神經(jīng)性疼痛。

不同miRNA分別通過不同的作用靶點引發(fā)或減輕下游炎性反應，引起或拮抗DPN 神經(jīng)性疼痛，干預miRNA 或其作用靶點，可有效減輕炎性反應，緩解疼痛。

2.3 影響軸突生長 ZHANG X N 等［31］研究發(fā)現(xiàn)，DM 晚期模型大鼠的原代分離背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元中miR-29b表達下調(diào)，DRG 神經(jīng)元細胞凋亡增加，軸突腫脹嚴重，同時，軸突生成基因被抑制，而神經(jīng)退行性基因被激活，進行模擬實驗恢復miR-29b的表達，結(jié)果顯示，miR-29b的恢復能促進軸突生成，抑制神經(jīng)變性，表明miR-29b可保護DRG 神經(jīng)元免受高血糖的損害。miR-29家族的另一個成員miR-29c也在軸突生長中起重要作用，miR-29c在DPN 模型小鼠DRG 神經(jīng)元、坐骨神經(jīng)和足墊組織中表達上調(diào)，而PRKCI蛋白呈現(xiàn)與之相反的變化，生物信息學分析、雙熒光素酶測定結(jié)果顯示PRKCI蛋白是miR-29的靶標，體外研究顯示，高葡萄糖可分別上調(diào)和降低DRG神經(jīng)元中的miR-29c和PRKCI蛋白水平，這與軸突生長的顯著抑制有關，該結(jié)果表明在高血糖下miR-29c可通過靶向PRKCI阻斷軸突生長［32］。

CHENG C等［33］研究發(fā)現(xiàn)，DM 模型小鼠感覺神經(jīng)元中mmu-let-7i水平下調(diào)，mmu-miR-341水平上調(diào)，分別使用mmu-let-7i模擬物進行外源性補充和用抗miR 拮抗mmu-miR-341的上調(diào)，結(jié)果顯示，補充mmu-let-7i和敲除mmu-miR-341小鼠的電生理學、結(jié)構(gòu)和行為異常均得到改善，但不改變高血糖狀態(tài)；另外，暴露于外源性mmu-let-7i模擬物的解離成人感覺神經(jīng)元生長增強，分支增多，證實mmu-let-7i具有神經(jīng)營養(yǎng)活性。

DPN的主要病理改變?yōu)橹車窠?jīng)脫髓鞘、腫脹，軸突變性，伴有髓鞘再生，雪旺細胞去分化，以上研究表明，miRNA可通過不同靶點促進或抑制軸突生長，改變神經(jīng)功能，使用保護性miRNA 模擬物或拮抗抑制性miRNA可以促進神經(jīng)元生長，改善神經(jīng)功能。

3 miRNA在DPN治療中的潛在靶點

3.1 外泌體 外泌體是由細胞分泌的直徑為50～100 nm 的膜狀納米囊泡，通過轉(zhuǎn)運其內(nèi)包含的功能性m RNA、miRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)參與細胞通訊。

間充質(zhì)基質(zhì)細胞（MSCs）目前被發(fā)現(xiàn)可應用于細胞療法。間充質(zhì)干細胞（MSC）主要通過旁分泌效應及分泌血管生成因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗炎分子促進周圍神經(jīng)病變的修復，MSC 來源的外泌體（MSC 外泌體）的治療效果已在癌癥、心腦血管疾病的臨床前研究中得到證實，可恢復外周組織的血流。FAN B Y等［34］將MSC外泌體作用于DPN 小鼠，發(fā)現(xiàn)MSC外泌體可降低促炎細胞因子水平，并通過將DM 小鼠坐骨神經(jīng)中的炎性巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M2表型以抑制炎性反應；研究同時發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體包含let-7a、miR-23a和miR-125b等miRNA，并協(xié)同靶向TLR4／NF-κB信號通路；此外，MSC外泌體可下調(diào)TLR4、IRAK1和磷酸化NF-κB p65的表達。另外有研究證實，MSC外泌體通過抑制TLR信號傳導，抑制巨噬細胞活化［35］。FAN B Y 等［34］研究證實，MSC外泌體含有多種miRNA，這些內(nèi)含的miRNA 可進一步影響炎癥通路的激活，減輕DM 小鼠的炎性反應，并促進DPN 小鼠的神經(jīng)血管重塑和功能恢復。可見，使用MSC 外泌體作為DPN患者的潛在治療方法具有廣泛前景。

雪旺細胞是包裹在周圍神經(jīng)纖維上的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，能通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促使受損的神經(jīng)元存活，以及促進軸突的再生以調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)功能。已有研究證實，來自健康雪旺細胞（SC-Exos）的外泌體可顯著增強坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠受傷外周軸突的再生［36］。WANG L等［37］對采用SC-Exos治療的db／db小鼠進行足底試驗（熱潛伏期）和von Frey試驗（機械潛伏期），結(jié)果發(fā)現(xiàn)db／db小鼠的運動神經(jīng)傳導速度和感覺神經(jīng)傳導速度顯著改善；同時發(fā)現(xiàn)，采用SC-Exos治療可使db／db小鼠脫髓鞘和軸突損傷顯著減少，髓鞘再生增加。DPN小鼠坐骨神經(jīng)組織中的許多miRNA（包括miR-21、27a、146a）水平顯著降低，而采用SC-Exo治療后，坐骨神經(jīng)組織中的miR-21、27a、146a水平顯著上升，說明SC-Exo可能通過提高miRNA水平改善周圍神經(jīng)功能［37］。為研究SC-Exos對DRG神經(jīng)元軸突生長的直接影響，WANG L等［37］進行了體外實驗，發(fā)現(xiàn)SC-Exos被DRG 軸突內(nèi)化，并促進糖尿病DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長和雪旺細胞的遷移，說明SC-Exo內(nèi)含有的miRNA 有助于SC-Exos促進糖尿病DRG神經(jīng)元中的神經(jīng)突生長和雪旺細胞遷移。通過該研究推測，SC-Exos可能通過升高保護性miRNA水平，發(fā)揮保護和／或逆轉(zhuǎn)受損的周圍神經(jīng)纖維作用。有必要開展更多研究評估SC-Exo治療能否逆轉(zhuǎn)周圍神經(jīng)纖維損傷，并探索SC-Exo 治療DPN 的時間窗口。

以上研究證實，多種細胞來源的外泌體可通過抗炎、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等途徑，使脫髓鞘、軸突損傷減少，軸突再生增加，進而改善周圍神經(jīng)功能，而該作用可能是通過外泌體內(nèi)含有的多種miRNA 實現(xiàn)的。使用外泌體治療DPN 可能是有效的，以上研究為臨床治療提供了新思路，但需要更多研究評估其可行性。

3.2 中藥復方與單體

（1）糖絡寧 LI Y X 等［38］研究糖絡寧（黃芪、地黃、當歸、狗脊、牛膝、木瓜、續(xù)斷、丹參）治療DPN大鼠的miRNA表達譜，分別比較DPN 大鼠和正常大鼠坐骨神經(jīng)miRNA表達譜，以及接受糖絡寧治療的DPN大鼠和未接受糖絡寧治療的DPN 大鼠的坐骨神經(jīng)miRNA表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個miRNA 水平顯著改變（上調(diào)或下調(diào)），對兩個結(jié)果分別進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)基因均可清楚地聚為兩類，并在2次分析的差異表達基因中觀察到19 個重疊基因，將接受糖絡寧治療的DPN大鼠和正常大鼠的這19個基因進行比較，發(fā)現(xiàn)糖絡寧可逆轉(zhuǎn)DPN 誘導的這19種miRNA 的變化，表明糖絡寧對DPN 的治療作用可能與miRNA 表達譜的改變有關。該研究通過進一步的通路和基因分析，認為糖絡寧可能通過作用于蓬亂蛋白1（DVL1）和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NTF3）基因影響Wnt和神經(jīng)營養(yǎng)因子途徑［38］。此外，糖絡寧可通過影響定位、細胞質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合過程，改善DPN癥狀［38］。

張晨等［39］將糖絡寧（川牛膝、黃芪、狗脊、全蝎、丹參）作用于大鼠背根神經(jīng)元，以探究糖絡寧是否通過影響miR-211下調(diào)凋亡通路以保護背根神經(jīng)元細胞。該研究以新生大鼠背根神經(jīng)元細胞作為研究對象，將其分為正常組、高糖組、糖絡寧組、miR-211抑制劑陰性組和miR-211抑制劑組，結(jié)果顯示，與正常組比較，高糖組細胞凋亡率、miR-211 基因表達及蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、真核翻譯起始因子2α（eIF2α）、激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）、C／EBP環(huán)磷酸腺苷反應元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）蛋白表達水平均較高，而與高糖組比較，糖絡寧組和miR-211抑制劑組細胞凋亡率、miR-211 基因表達及PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平均較低，由此認為糖絡寧可能通過作用于miR-211下調(diào)凋亡通路，保護背根神經(jīng)元細胞，發(fā)揮治療DPN的作用［39］。

以上兩個研究中的糖絡寧藥物組成不同，但均證實糖絡寧可通過作用于miRNA 發(fā)揮治療DPN 的作用，且均從miRNA層面分析中藥復方治療DPN 的機制，為中藥復方治療DPN的有效性提供了依據(jù)。

（2）三七 三七皂苷R1是三七的主要生物活性成分之一，現(xiàn)代藥理學研究提示，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用和神經(jīng)保護特性［40］。WANG W W 等［41］研究三七皂苷R1 對DPN 的作用，通過高糖刺激RSC96細胞建立DPN的細胞模型，在DPN 細胞模型中發(fā)現(xiàn)細胞活力受到抑制，高糖可誘導細胞凋亡，當用三七皂苷R1預處理時，發(fā)現(xiàn)ROS減少，神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制減弱。另外研究發(fā)現(xiàn)，高糖處理上調(diào)了miR-503的表達，而三七皂苷R1則顯著抑制miR-503的表達［41］。為探究三七皂苷R1細胞保護的機制，WANG W W等［41］重點研究了與DPN發(fā)病機制密切相關的兩種信號通路（PI3K／AKT 和β-連環(huán)蛋白），結(jié)果顯示，高糖抑制PI3K和AKT磷酸化，并下調(diào)β-連環(huán)蛋白表達，然而三七皂苷R1預處理可改善高糖誘導的上述蛋白質(zhì)的改變。當使用miR-503模擬物使miR-503過表達時，三七皂苷R1并沒有逆轉(zhuǎn)相應改變［41］。因此該研究證明，三七皂苷R1能通過下調(diào)miR-503水平，在高糖水平下激活PI3K／AKT和β-連環(huán)蛋白信號傳導通路。三七皂苷R1在RSC96細胞中的神經(jīng)保護和神經(jīng)營養(yǎng)功能可能是通過其對miR-503表達的調(diào)節(jié)和激活下游信號傳導通路如PI3K／AKT和β-連環(huán)蛋白實現(xiàn)的。該研究為DPN的新治療策略提供了新思路。

中藥治療DPN效如桴鼓，具有對癥治療不可比擬的優(yōu)越性，越來越多的研究證實中藥治療的有效性。以上研究說明部分中藥可能具有調(diào)節(jié)相關miRNA 水平的作用，通過miRNA 影響下游信號可營養(yǎng)和保護周圍神經(jīng)。

4 小結(jié)

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 參與DPN 的發(fā)生發(fā)展，部分研究使用模擬物補充保護性miRNA 或抑制有害性miRNA，調(diào)節(jié)靶基因，改善DPN 癥狀，為DPN的預防和治療提供了潛在治療靶點和治療途徑，也豐富了治療思路，但miRNA 作為治療DPN 的方法的可能用途還需進一步研究，藥物研發(fā)及臨床療效驗證也需要時間。miRNA參與DPN 發(fā)病的機制復雜，且部分miRNA具有多個靶向位點，是否通過調(diào)節(jié)多種通路參與DPN的發(fā)病尚不明確，同時許多miRNA 參與DPN的機制尚未得到闡述，因此仍需要更多的研究進行闡述和證實，為DPN 的預防、診斷、治療提供新思路。