非轉(zhuǎn)基因法阿爾茲海默病動物模型的研究進展

吳殿秀，韓雨霖，袁依然，周姝婷，王海鵬 （北華大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，吉林 吉林 132013）

阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）即老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)退行性病變。據(jù)世衛(wèi)組織報道，目前有5500 萬人患有癡呆癥。在我國60 歲及以上老年人中有9.83 萬人患有阿爾茨海默病[1]。有學者推斷，到2050 年我國阿爾茨海默病患者將達到3003 萬人。隨著我國人口老齡化的發(fā)展進程，可以預見AD 將嚴重威脅老年人的生活質(zhì)量和健康狀況，所以對AD 治療方法的研究迫在眉睫。筆者在檢索AD 造模相關(guān)文獻時發(fā)現(xiàn)，多數(shù)文獻來自國外，國內(nèi)對于AD 模型的研究較少。所以本文充分比較不同AD 動物模型的優(yōu)缺點，為科學研究者針對不同的實驗內(nèi)容選取不同的動物模型提供確切的理論依據(jù)。

1 單點或多點注射β-淀粉樣蛋白寡聚體

注射點選擇在AD 主要發(fā)生病變的，且與記憶和學習息息相關(guān)的小鼠海馬的CA1 區(qū)和齒狀回區(qū)。注射物為β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）1-42和Aβ25-23形成的寡聚體。此模型最早在第7 天時出現(xiàn)氧化應(yīng)激，神經(jīng)元死亡以及突觸可塑性降低等病理變化，但由于未形成斑塊且其他病理特征較輕微，行為學特征不夠明顯故不能作為模型使用。該模型到2月齡時出現(xiàn)穩(wěn)定的神經(jīng)元丟失和淀粉樣沉積[2]。該造模方法有許多缺陷，首先注射手法和位置的選擇極其重要，容易傷及腦組織。其次通過注射帶來的病理學特征較為局限，病理特征僅局限于注射區(qū)，但對于某些藥物對單一區(qū)域影響的研究有較大價值。與此同時，關(guān)于AD 的發(fā)病機制，Aβ 沉積是否為關(guān)鍵環(huán)節(jié)還有待商榷，有研究顯示清除Aβ 斑塊并不會改善AD 患者的行為、認知等障礙，并且在無AD 老人腦中也會有Aβ 沉積。但這種造模方式也常用于誘導AD 動物模型聯(lián)合其他轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因方法造模。

2 Tau蛋白相關(guān)病理模型

注射蛋白有人工合成Tau 蛋白纖維和人源Tau蛋白兩種。微管相關(guān)蛋白Tau 是由6 種異構(gòu)體組成的家族，在AD 患者腦內(nèi)發(fā)生神經(jīng)退行性變的神經(jīng)元中異常過度磷酸化并積聚，正常Tau 與AD 過度磷酸化Tau（ADP-Tau）的亞型有特異性相互作用，其中Tau4L 與其結(jié)合能力最強[3]。從AD 腦中獲得的不溶性組分接種Tau 后，宿主Tau 對于注射Tau 的播種和擴散是強制性的，且Tau的播種和擴散是可變的基因型依賴的Tau 磷酸化和Tau 硝基化，MAP2 磷酸化和與異常Tau 沉積共定位的激酶的可變激活。在Tau的體外研究中顯示纖維性Tau 病理形成之前存在替代的Tau 聚集體，這些Tau 的分層寡聚形式也有助于神經(jīng)變性[4]。Tau 注射時，由于小鼠本身含有的宿主Tau和注射區(qū)域的差異，對損傷的細胞以及產(chǎn)生沉積物的分子組成，均會產(chǎn)生影響。越來越多的證據(jù)表明，Tau 聚集物以朊病毒樣的方式傳播和復制，伴隨著病理性Tau 種子的攝取，導致受體細胞中單體Tau的錯誤折疊和聚集。國外的研究者將離心與洗脫法相結(jié)合，從AD腦內(nèi)提取出Tau聚集物，并將該物質(zhì)注射到小鼠的海馬和皮質(zhì)區(qū)，3月齡時即在注射區(qū)檢測到磷酸化Tau蛋白，并且病理變化隨時間呈進行性發(fā)展[5]。在與人源Tau 相結(jié)合的和與人工Tau（Tau-磷脂復合物寡聚體）相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因小鼠的比較中發(fā)現(xiàn)，人源Tau 蛋白模型會顯現(xiàn)出更加明顯的病理特征[6]。但人源AD 的獲取復雜困難，且人工Tau 寡聚體注射后在2 月齡時即可出現(xiàn)典型的Tau 聚集和小鼠功能認知障礙，故人工Tau寡聚體注射的造模方法常單用或者與轉(zhuǎn)基因方法以及其他非轉(zhuǎn)基因方法聯(lián)用，以研究AD 的病理機制以及各種類型的藥物作用篩選。

3 神經(jīng)炎癥相關(guān)模型

3.1 側(cè)腦室和腦內(nèi)注射鏈脲佐菌素

炎癥有助于機體的自身防御，但在腦神經(jīng)細胞中長期的炎癥則會造成神經(jīng)炎癥。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要是小膠質(zhì)細胞釋放大量炎癥因子促發(fā)慢性炎癥，造成神經(jīng)組織的損傷，參加神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。同時促炎因子也可以促進Aβ 斑塊的沉積和Tau磷酸化[7]。

側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）誘導的腦狀態(tài)是一種廣泛使用的散發(fā)性阿爾茨海默病（sAD）模型。注射后3 個月觀察到背側(cè)海馬內(nèi)神經(jīng)元丟失，激活了神經(jīng)炎癥，膽堿能傳遞不足，谷胱甘肽水平降低[8]。STZ處理的大鼠在21 d時空間學習和識別記憶、社會認知和視覺記憶中表現(xiàn)出顯著損傷。研究顯示實驗結(jié)果與STZ 劑量的應(yīng)用和食物的攝入有關(guān)，故還需進一步研究加強明確造模方法[9]。在AD 患者分子病理中，以胰島素抵抗腦狀態(tài)和腦葡萄糖代謝改變?yōu)楸憩F(xiàn)的中樞代謝功能障礙最近受到關(guān)注。胰島素抵抗腦狀態(tài)現(xiàn)被認為是一種常見的潛在代謝病理和神經(jīng)退行性過程的貢獻者，而不是特定的神經(jīng)退行性疾病的直接原因[10]。sAD 被認為與腦內(nèi)胰島素受體信號受損有關(guān)。使用β 細胞毒性藥物STZ進行側(cè)腦室注射后，模型大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗的大腦狀態(tài)[11]。故該模型也常用于胰島素信號與AD在大腦中聯(lián)系的研究。但該模型具有局限性，在造模過程中發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠對于STZ 的敏感性高于雌性大鼠，這與AD 女性多與男性的發(fā)病相悖，目前尚不清楚哪些變化是由于性類固醇調(diào)節(jié)引起的[12]。

3.2 側(cè)腦室和腦內(nèi)注射脂多糖

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又叫內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分。慢性脂多糖處理誘導的系統(tǒng)性炎癥導致轉(zhuǎn)基因AD 小鼠模型腦內(nèi)脂代謝異常，與cPLA2 活性的潛在變化有關(guān)。其表現(xiàn)為區(qū)分功能障礙，但對空間記憶沒有影響[13]。而長期LPS 刺激可導致記憶和學習障礙[14]。不同年齡的大鼠對于LPS 的敏感度即神經(jīng)炎性反應(yīng)也不同，其中最敏感的為老齡組大鼠（23 月齡），其表現(xiàn)為產(chǎn)生γ干擾素[15]。該方法通常與轉(zhuǎn)基因方法聯(lián)用，加重AD病理表現(xiàn)，縮短造模時間。

4 腺相關(guān)病毒模型

腦定位注射腺相關(guān)病毒。腺相關(guān)病毒是一種不依賴于包膜的細小DNA病毒。該模型病理檢測發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)突觸損傷、Aβ 沉積以及神經(jīng)炎等病理特征，顯著損害了空間記憶和長期記憶。在體外實驗中可以發(fā)現(xiàn)Aβ 能誘導星形膠質(zhì)細胞中GluN2A 顯著增加[16]。該成果迅速運用到腺相關(guān)病毒模型的制作中，給小鼠腦內(nèi)輸入含有星型膠質(zhì)細胞特異性啟動子的GluN2AA-shRNA 腺相關(guān)病毒，結(jié)果顯示這一操作加重了小鼠的空間行為認知障礙。該造模方法簡單易操作且造模時間短，但無可避免的會對腦組織造成一定傷害。若通過靜脈注射，黏膜給藥等方法，由于血腦屏障的存在，會減少入腦病毒的濃度。該方法亦可用在轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠中，以加快造模進程。

5 衰老相關(guān)模型

制作方法為腹腔或皮下注射D-半乳糖，連續(xù)90 d，通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，加重神經(jīng)炎性反應(yīng)，影響線粒體功能促進細胞凋亡等制備衰老AD 模型。90 d 后小鼠的學習記憶能力顯著下降，腦組織氧化還原酶等下降，腦細胞萎縮凋亡[17]。此法也可以同時注射亞硝酸鈉，使血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力，加重多器官缺血缺氧，加快造模進程。該方法常與其他轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因辦法同時應(yīng)用，誘發(fā)或加重AD 相關(guān)病理表現(xiàn)。此方法若單獨使用局限性較大，其造模時間長，且不具備典型的AD 病理特征，并且不同品種，不同年齡小鼠對D-半乳糖敏感程度不同，其造模時間與病理檢測時間相對不好制定。近些年有研究證明小劑量的D-半乳糖或可增強小鼠的空間記憶學習能力，且有研究表明短期的（小于8 周）的給藥未造成小鼠類似AD 的病理表現(xiàn)[18]，故據(jù)此得出結(jié)論D-半乳糖的給藥時間以及劑量的確定對于造模非常重要。

6 飲食及環(huán)境相關(guān)模型

無論是在模型的制作中還是在人AD 的發(fā)病誘因中，都不可忽視飲食和環(huán)境的因素。長期高糖、高脂、高鹽飲食會增加患AD 的風險。但在近期研究中給AD 患者使用降膽固醇他汀類藥物并不能有效延緩或是緩解AD 的發(fā)病進程，且高膽固醇飲食模型腦內(nèi)Aβ 沉積以及腦萎縮現(xiàn)象均不明顯[19]。也有研究顯示，膽固醇調(diào)節(jié)基因變異會增加AD 的患病風險，故使用高膽固醇飼喂方法對于AD 的造模還有很大的爭議。郭琳等[20]給予小鼠吸入可吸入顆粒物PM10，實驗結(jié)果顯示，小鼠大腦皮層有助于記憶功能的NR2B 蛋白的表達與PM10的暴露濃度呈正相關(guān)，且大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元突觸減少，突觸前突觸小泡增多，突觸后致密物增厚也與PM10暴露濃度呈正相關(guān)，即可吸入顆粒造成神經(jīng)功能損傷。劉穎等[21]給予小鼠吸入大氣顆粒物，并同時進行高質(zhì)高糖飼喂，結(jié)果3 個月后實驗小鼠即出現(xiàn)空間記憶損傷，且隨時間損傷程度逐漸增加，該試驗方法有效的降低了實驗鼠的學習記憶能力。國外學者用2%~3.8%的甲醛溶液飼喂小鼠，10 d 后造成小鼠空間記憶受損，海馬體萎縮，Tau 蛋白磷酸化水平升高，但無Aβ 斑塊沉積[22]。還有學者研究了丙烯醛處理小鼠，導致小鼠在一月齡時即出現(xiàn)AD 的經(jīng)典病變和嗅覺障礙，丙烯醛模型小鼠突觸損傷和神經(jīng)炎癥的原因可能是激活海馬RhoA/ROCK2/p-cofilin 相關(guān)通路[23]。應(yīng)用興奮性毒素如鵝膏蕈氨酸、奎司奎酸、紅藻氨酸等，也可一定程度上引發(fā)AD 樣病理表現(xiàn)。但由于產(chǎn)生Aβ 斑塊能力不穩(wěn)定，Tau磷酸化程度參差不齊故對于病理特點的研究意義不大，常聯(lián)合其他造模方法同時使用，縮短造模時間。

7 岡田酸誘導模型

岡田酸（okadaic acid，OA）也叫軟海綿酸，是腹瀉型貝毒的一種。OA 有神經(jīng)毒性，影響海馬神經(jīng)遞質(zhì)的活性，使Tau 蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而導致嚴重的記憶障礙。通過腦內(nèi)注射和鼻腔給藥兩種方法，常與缺氧方法聯(lián)用[24]。吳敏霞等[25]研究顯示，模型小鼠在Morris水迷宮和逃避與潛伏實驗中產(chǎn)生明顯的空間記憶障礙，且小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生明顯的神經(jīng)纖維纏結(jié)和Tau過磷酸化現(xiàn)象。是制作研究AD病理特征，治療方法的良好模型。但此法也不可避免地損傷部分腦細胞，且對于OA 的最佳給藥時間和頻次相關(guān)研究較少，還需繼續(xù)研究探索。

8 金屬離子紊亂相關(guān)模型

AD 的組織病理學特征是細胞內(nèi)的神經(jīng)纖維纏結(jié)和細胞外由Aβ 與銅、鐵或鋅等金屬離子聚集形成的老年斑。當與Aβ 結(jié)合時，氧化還原活性金屬離子。如銅可以催化產(chǎn)生活性氧，尤其是反應(yīng)活性最強的羥基自由基，可能對Aβ 肽本身及周圍分子造成氧化損傷[26]。有學者成功用三氯化鋁和硫酸銅處理大鼠成功制作了AD 動物模型，其產(chǎn)生嚴重的空間記憶能力損害，并失去物體辨別能力，產(chǎn)生中樞神經(jīng)炎癥，膽堿能傳遞障礙等病理特征[27]。銻、鋅等金屬離子也可產(chǎn)生類似的效果[28]。這造模方法較為簡單，通過飼喂即可誘導模型產(chǎn)生。但單一的金屬離子誘導模型困難，最好聯(lián)合轉(zhuǎn)基因方法或其他非轉(zhuǎn)基因方法例如Aβ寡聚體注射等。

9 總結(jié)與展望

現(xiàn)存的AD 轉(zhuǎn)基因造模方法費用昂貴且造模時間長，但病理變化特征和人類AD 較為類似。而非轉(zhuǎn)基因方法大多利用AD 的誘發(fā)因素進行操作，雖然操作簡單造模成本低，但注射的方法都無法避免一定程度的腦損傷，且因注射位置固定導致病變范圍較為局限，與AD 的全身性的病理特征有較大區(qū)別。每一種造模方法都有自己的優(yōu)缺點，并沒有一種模型能概括AD 的所有特征，選擇合適的模型來評估潛在的治療干預措施。最重要的是明確臨床治療的相關(guān)目標，確定治療相關(guān)的時間點，所以實驗者可以根據(jù)實驗所需選擇適合的模型進行造模。

非轉(zhuǎn)基因方法未來的發(fā)展是解決腦外傷的問題，尋找一類可以通過血腦屏障的藥物，或是對現(xiàn)存的藥物進行修飾使之能過通過靜脈注射，跨越血腦屏障發(fā)揮生物效應(yīng)。現(xiàn)階段對于Tau 過磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及中樞神經(jīng)炎癥的研究處于高速發(fā)展階段，這也將是動物模型的發(fā)展方向。目前AD動物模型造模方法已經(jīng)取得了一定的進展，但由于AD 發(fā)病機制以及神經(jīng)生物學基礎(chǔ)、免疫基礎(chǔ)以及生活中各類影響因素的研究尚未完善，對于AD 動物模型的研究依舊處于發(fā)展階段，對于各種類型的AD 模型還需進一步研究和完善。