靜磁場對蜜環(huán)菌發(fā)酵產物結構和理化特性的影響

高 飛，趙宇楠，張 鑫，張思琳，蔡 丹，劉景圣

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程中心，吉林 長春 130118）

玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白，具有良好的理化和加工特性[1]。由于玉米醇溶蛋白分子內部含有大量的疏水性氨基酸，導致玉米醇溶蛋白溶解性差，只溶于部分濃度的乙醇溶液，一定程度上限制了玉米醇溶蛋白的應用范圍[2]。因此需要針對其結構、性質進行改性，增大玉米醇溶蛋白的開發(fā)和利用的程度，進一步提高其在食品工業(yè)中的應用。目前主要的改性方法包括物理改性、化學改性和生物改性[3]，但各改性方法均有不同利弊，單一的改性方法不能充分改善玉米醇溶蛋白的特性[4-5]。所以，開發(fā)新型、高效的玉米醇溶蛋白復合改性方法值得深入研究，也必將成為玉米醇溶蛋白改性研究的熱點。

磁場是傳輸電荷或電流之間相互作用并由移動電荷或電流產生的物理場，可以產生積極的生物學效應[6]，而發(fā)酵具有轉化率高、環(huán)保安全及對原料營養(yǎng)成分破壞小等優(yōu)點。如今，國內外越來越多的研究發(fā)現(xiàn)選擇適宜的磁場參數(shù)可以促進微生物生長和代謝[7-8]。在液態(tài)發(fā)酵方面，低頻磁場輔助發(fā)酵使樟芝菌絲體生物量提高率為15.87%，多糖得率與總三萜得率分別增加了24.26%與26.85%[9]；低強度交變磁場明顯改變了灰樹花菌絲體形態(tài)，使菌絲體分枝數(shù)量增加，且磁處理后的菌絲體更為松散[10]。在固態(tài)發(fā)酵方面，低頻磁場輔助發(fā)酵使豆粕多肽含量相比于未加磁場組提高了12.32%[11]；在低頻磁場條件下，紫色紅曲菌發(fā)酵產γ-氨基丁酸最終產量增加了35.7%[12]。因此，磁場是一種具有開發(fā)潛力的良好輔助發(fā)酵方式。關于靜磁場對真菌發(fā)酵玉米醇溶蛋白方面目前鮮有研究報道。

本研究通過靜磁場輔助蜜環(huán)菌發(fā)酵玉米醇溶蛋白，比較靜磁場處理前后發(fā)酵產物的結構和理化特性的差異，為蛋白質改性提供基礎依據(jù)，以期發(fā)現(xiàn)更有效的復合改性方法，從而改變玉米醇溶蛋白結構并改善其理化特性，以增加玉米醇溶蛋白的附加值，提高利用效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）Am-07-22由吉林農業(yè)大學小麥和玉米深加工國家工程中心提供。

玉米醇溶蛋白（≥92%）上海瑞永生物科技有限公司；無水葡萄糖 天津市大茂化學試劑廠；蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、硫酸銨、溴化鉀天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設備

Stab S2振蕩培養(yǎng)箱 上海潤度生物科技有限公司；SJ810C立式壓力蒸汽滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司；MFI-L1磁場振蕩光照培養(yǎng)箱 英都斯特感應科技有限公司；TGL-20bR離心機 上海安亭科學儀器廠；VERTEX 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；UV-26001紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；Sigma 300掃描電子顯微鏡 德國ZEISS公司；Q2000差示掃描量熱儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

菌種活化：將保藏的蜜環(huán)菌轉接至麥芽汁斜面培養(yǎng)基，放于27 ℃培養(yǎng)箱中生長12 d，待斜面長滿菌絲體，將斜面菌種接種至30 mL液體培養(yǎng)基中，轉速160 r/min、27 ℃條件下恒溫培養(yǎng)6 d，制備一級種子液，再將一級種子液打碎，然后以8%的接種量接種至200 mL的液體培養(yǎng)基中，于27 ℃、160 r/min條件下再次培養(yǎng)6 d，得到二級種子液。

液體培養(yǎng)基：蠶蛹粉0.5%、馬鈴薯20%、葡萄糖1%、酵母浸粉2%、蔗糖1%、MgSO4·7H2O 0.075%、KH2PO40.15%、VB10.001%，配制后121 ℃滅菌20 min，27 ℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)6 d。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米醇溶蛋白6.5%、馬鈴薯20%、葡萄糖1%、蔗糖1%、MgSO4·7H2O 0.075%、KH2PO40.15%、VB10.001%，配制后121 ℃滅菌20 min，將二級種子液按照接種量為10%接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件27 ℃、160 r/min。

1.3.2 玉米醇溶蛋白發(fā)酵產物的制備

靜磁場處理條件為磁場強度4.3 mT、介入時間1.5 h、處理時長3.5 h，分別在第3、4、5、6、7天取樣提取玉米醇溶蛋白發(fā)酵產物。首先將發(fā)酵后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基用4 層紗布過濾，5000 r/min離心30 min得到發(fā)酵上清液，取不同條件下的發(fā)酵上清液，之后加入飽和度為50%的硫酸銨溶液獲得玉米醇溶蛋白發(fā)酵產物，8000 r/min離心10 min，將沉淀物在4 ℃條件下用蒸餾水透析24 h以除去鹽分，冷凍干燥后備用[13]。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

稱取2 mg蛋白（指蛋白發(fā)酵產物，下同）樣品與0.2 g溴化鉀混合充分研磨成均勻粉末，使用壓片機壓制成薄片，在4000～400 cm-1處進行全波段掃描。采用軟件Peak Fit v4.12對圖譜的酰胺I帶進行分析，并計算各二級結構相對含量。

1.3.4 紫外吸收光譜分析

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、0.01 mol/L）配制1.0 mg/mL的蛋白溶液，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、0.01 mol/L）作為空白。在波長為250～450 nm、頻率為0.1 nm/s的條件下進行掃描。

1.3.5 內源熒光光譜分析

用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、0.01 mol/L）配制1.0 mg/mL的蛋白溶液，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2、0.01 mol/L）作為空白。激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為270～470 nm，狹縫寬均為5 nm。

1.3.6 掃描電子顯微鏡觀察

使用導電雙面膠將少量凍干后的蛋白樣品固定在金屬樣品臺上，在樣品艙內噴金后進行觀察，放大倍數(shù)為1000 倍和2000 倍。

1.3.7 熱穩(wěn)定性分析

稱取3 mg蛋白樣品于鋁堝中，并用空白鋁堝作為對照。以10 ℃/min的速率由20 ℃升溫到180 ℃，采用Universal Analysis軟件分析獲得熱曲線。

1.3.8 Zeta電位與粒徑分析

將樣品配制成1 mg/mL的蛋白溶液進行測定，折射率為1.330，吸光度0.001，平衡時間為120 s。

1.3.9 游離巰基及二硫鍵測定

參照Cabra等[14]的方法并進行改進。游離巰基含量（c游）的測定：取2.0 mg/mL的蛋白溶液0.5 mL，先加入0.1%的Tris-甘氨酸溶液2.5 mL，再加入50 μL的4 mg/mL的5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液，混勻后靜置15 min，在412 nm波長處測定其吸光度?？値€基含量（c總）的測定：將上述蛋白溶液中加入含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸溶液中，其他步驟相同。游離巰基和二硫鍵含量分別按式（1）、（2）計算：

式中：A412nm為樣品在412 nm波長處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ρ為樣品質量濃度/（mg/mL）。

1.3.10 持水性和持油性測定

參照Guo Qiyuan等[15]的方法并進行改進。稱取0.2 g蛋白樣品于離心管中，記總質量為m1。加入4 g蒸餾水，搖勻，在室溫下靜置5 h。5000 r/min離心10 min，去除多余的水分，記總質量為m2。蛋白持水性按式（3）計算：

稱取0.2 g蛋白樣品于離心管中，記總質量為M1。加入4 g大豆油，搖勻，在室溫下靜置5 h。4000 r/min離心20 min，棄去多余的油，記總質量為M2。蛋白持油性按式（4）計算：

1.3.11 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

參照Wang Yingying等[16]的方法并進行改進。取15 mL 1 mg/mL樣品溶液與5 mL大豆油混合加入到離心管中，用均質機在10000 r/min轉速條件下均質2 min，取15 μL蛋白-大豆油乳化液，向其中加入4 mL 0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液，在500 nm波長處測定吸光度，記為A0。乳化液靜置10 min后采用相同的方式測定吸光度，記為A10。乳化性和乳化穩(wěn)定性分別按式（5）、（6）計算：

式中：ρ為樣品質量濃度/（g/mL）；φ為大豆油占比（0.25）；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.12 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定

參照Liu Fenfang等[17]的方法并進行改進。制備0.1 g/mL的蛋白溶液，取1 mL溶液滴入30 mL磷酸鹽緩沖液（pH 7.2、0.01 mol/L）中，使用高速均質機10000 r/min均質2 min，均質后測量液面體積，記為V0，靜置20 min，再次測量液面體積記為V20。起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別按式（7）、（8）計算：

1.4 統(tǒng)計分析

本研究采用SPSS 23.0和Orgin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進行分析，所有實驗重復3 次。

2 結果與分析

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜是分子振動光譜，能夠比較準確地分析出蛋白質分子的二級結構相對含量，1700～1600 cm-1波長處為酰胺I帶通常用來分析蛋白質的二級結構，該類譜峰主要歸屬于C＝O鍵伸縮振動及肽鍵的C—N伸縮振動，二者之間可形成氫鍵[18-20]，二級結構相對含量的變化可表明包括氫鍵在內維系蛋白二級結構的作用力發(fā)生改變。從圖1A可知，靜磁場輔助發(fā)酵前后蛋白的紅外光譜圖基本一致，這表明處理前后蛋白主體結構較為完整，并未發(fā)生變化，這與李楠研究結果[21]一致。

圖1 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的傅里葉變換紅外光譜圖（A）及二級結構（B）Fig.1 FTIR spectra (A) and secondary structure (B) of fermentation products under different conditions

由圖1B可知，靜磁場輔助發(fā)酵對產物蛋白的二級結構存在一定的影響。在第3、4、5、6、7天時，與普通發(fā)酵相比，靜磁場輔助發(fā)酵條件下β-折疊相對含量分別降至24.16%、24.15%、23.93%、23.60%、22.98%，無規(guī)卷曲相對含量分別增加至40.68%、43.00%、41.65%、41.27%、44.80%，這可能是由于靜磁場輔助發(fā)酵使維系該結構的部分氫鍵斷裂，發(fā)生解折疊，蛋白結構由緊密變得松散，產物蛋白的無序性增大，從而促使蛋白的二級結構發(fā)生變化。

2.2 紫外吸收光譜分析

紫外光譜掃描可以直接反映蛋白質的結構及化學變化[22]。如圖2所示，蛋白溶液在276～283 nm波長范圍內出現(xiàn)紫外吸收峰，這是因為色氨酸和酪氨酸的特征吸收峰在280 nm波長附近[23]。有研究報道，蛋白分子的構象會影響吸光度大小[24]，經(jīng)靜磁場處理后產物蛋白紫外吸收值明顯增大，最大吸收峰發(fā)生了紅移，原因可能是靜磁場可以使蛋白結構更加舒展，色氨酸和酪氨酸殘基暴露于蛋白質分子表面。同樣，羅娟研究表明，超聲波輔助發(fā)酵可以增加可溶性蛋白的紫外吸收峰強度，并使最大吸收峰發(fā)生紅移[25]。

圖2 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectra of fermentation products under different conditions

2.3 內源熒光光譜分析

內源熒光光譜可通過微環(huán)境極性變化對熒光氨基酸的影響情況反映蛋白質的三級構象[26]。蛋白質分子中的熒光強度：色氨酸（Trp）＞酪氨酸（Tyr）＞苯丙氨酸（Phe）殘基，其中，色氨酸的峰值位于348 nm波長附近[27]。有研究表明，蛋白質激發(fā)熒光強度或者發(fā)射波長均會因蛋白質分子結構的改變從而發(fā)生改變[28-29]。圖3為靜磁場輔助發(fā)酵前后產物蛋白熒光光譜的變化情況，在280 nm的激發(fā)波長條件下，其產物蛋白的最高熒光強度出現(xiàn)在345 nm波長附近，表明Trp殘基所發(fā)射的光譜在產物蛋白熒光光譜中占最大比例。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜磁場處理后，所有靜磁場輔助發(fā)酵相較于普通發(fā)酵來說，熒光光譜的峰形沒有發(fā)生改變，熒光強度有不同程度的升高，最大吸收波長發(fā)生紅移現(xiàn)象，這可能是因為蛋白質分子展開，Trp殘基暴露于表面，這與上述紫外吸收強度的變化結果一致。此外，Zhao Chengbin[23]和Ye Lin[30]等研究表明，蛋白質過度氧化會形成聚集體，迫使熒光氨基酸重新嵌入分子內部的疏水環(huán)境中，導致熒光強度降低。

圖3 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的內源熒光光譜圖Fig.3 Intrinsic fluorescence spectra of fermentation products under different conditions

2.4 掃描電子顯微鏡觀察結果

如圖4所示，經(jīng)靜磁場輔助發(fā)酵后，樣品表面更加粗糙，出現(xiàn)一些孔洞，比表面積增大。這說明經(jīng)過靜磁場處理能更大程度地破壞蛋白質的結構，使原本的結構變得更加疏松多孔。這種疏松多孔的結構可以導致大量的疏水性氨基酸能夠釋放，從而提高蛋白質的理化特性[31]。張明珠等[32]報道了超聲波法和超聲輔助α-淀粉酶法可使玉米醇溶蛋白微觀結構變得更加松散，表面出現(xiàn)孔洞。趙飛[33]報道了高壓均質處理可使大豆蛋白質球狀致密結構遭到破壞，產生不同形狀和大小的塊狀結構，質地變得疏松。本研究也表現(xiàn)出類似的變化及相關特征。

圖4 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of fermentation products under different conditions

2.5 熱穩(wěn)定性分析

差示掃描量熱儀是在研究物質的性質時依據(jù)溫度變化來確定其熱穩(wěn)定性的一種分析儀器[34]。研究表明，蛋白質的熱變性與其空間結構的改變有密切關系，空間構象的變化會對蛋白質的理化特性產生影響[35]。由圖5可以看出，靜磁場輔助發(fā)酵的產物蛋白變性溫度明顯升高，在發(fā)酵第3、4、5、6、7天時，分別上升至102.61、106.25、108.68、113.04、115.77 ℃，說明產物蛋白的熱穩(wěn)定性不僅與發(fā)酵時間有關，還與靜磁場處理有關。通過傅里葉變換紅外光譜分析結果得出，這一現(xiàn)象可能是蛋白質在加熱時，分子內的氫鍵斷裂，導致蛋白質多肽鏈伸展開，而分子伸展過程需要吸收一定的熱能。

圖5 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的熱穩(wěn)定性圖譜Fig.5 Differential scanning calorimetric patterns of fermentation products under different conditions

2.6 粒徑與Zeta電位分析

產物蛋白中的微粒大小會影響溶液的穩(wěn)定性，可以直觀地表現(xiàn)出蛋白質的聚集程度，影響蛋白質的功能特性[36]。如圖6A所示，總體來看粒徑大小呈現(xiàn)下降趨勢，在第7天時普通發(fā)酵和靜磁場輔助發(fā)酵粒徑分別為291.83 nm和289.07 nm。說明隨著發(fā)酵時間的延長以及靜磁場處理能夠使蛋白分子結構的展開，使平均粒徑減小，這與上述研究結果一致。

圖6 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的粒徑（A）和Zeta電位（B）Fig.6 Particle size (A) and zeta potential (B) of fermentation products under different conditions

Zeta電位反映溶液微粒表面的帶電性質，能夠反映出體系的穩(wěn)定性。Zeta電位的絕對值越大，粒子間靜電作用力越強，其在溶液中的分散穩(wěn)定性越好[37]。如圖6B所示，產物蛋白帶有負電荷，其絕對值呈現(xiàn)增加的趨勢，這說明靜磁場處理可以破壞蛋白結構，增大Zeta電位絕對值，從而減少顆粒的聚集，使溶液更加穩(wěn)定，普通發(fā)酵和靜磁場輔助發(fā)酵的Zeta電位在第7天時為最低點，分別為-15.04 mV和-15.21 mV。

2.7 游離巰基及二硫鍵測定結果

蛋白質中含有游離巰基和二硫鍵并且對其結構和理化性質起著重要作用，一定的外界作用會使蛋白結構展開引起巰基的變化和二硫鍵的斷裂，疏基與二硫鍵之間相互轉換從而影響蛋白質的理化性質[38-39]。如圖7所示，產物蛋白的巰基和二硫鍵含量發(fā)生明顯變化，說明在發(fā)酵過程中存在巰基-二硫鍵交換反應。整體來看，游離巰基含量呈現(xiàn)上升趨勢，二硫鍵含量呈現(xiàn)下降趨勢。靜磁場輔助發(fā)酵在第7天時游離巰基含量最高，為16.46 μmol/g，相比于普通發(fā)酵提高了18.05%，此時，二硫鍵含量最低，為10.13 μmol/g，相比于普通發(fā)酵降低了12.48%。說明蛋白分子中的部分亞基解離，二硫鍵斷裂生成巰基，或靜磁場輔助發(fā)酵加速了蛋白內部結構展開，導致內部巰基暴露量增加[35]。

圖7 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的游離巰基（A）和二硫鍵（B）含量Fig.7 Contents of free sulfhydryl groups (A) and disulfide bonds (B)of fermentation products under different conditions

2.8 持水性和持油性測定結果

如圖8所示，與普通發(fā)酵相比，在靜磁場輔助發(fā)酵期間持水性和持油性更高，這是由于靜磁場處理后，蛋白質分子的空間結構更疏展，表面出現(xiàn)大量孔洞，親水親油基團暴露，有利于增強持水及持油能力[40]。同時，紫外吸收光譜、熒光光譜及掃描電子顯微鏡分析結果也驗證了這一現(xiàn)象。隨著發(fā)酵時間的延長，持水性和持油性均呈現(xiàn)上升的趨勢，這可能是由于發(fā)酵過程中蛋白的理化性質受氨基酸序列、蛋白結構及蛋白形態(tài)等因素的影響[25]。在第7天時普通發(fā)酵和靜磁場輔助發(fā)酵持水性與持油性達到最大值，持水性分別為3.30 g/g和3.86 g/g，持油性分別為4.15 g/g和4.22 g/g。綜上，靜磁場輔助發(fā)酵能夠更好地改善產物蛋白的持水性和持油性，為食品的加工和品控方面提供了新思路。

圖8 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的持水性（A）和持油性（B）Fig.8 Water-holding capacity (A) and oil-holding capacity (B) of fermentation products under different conditions

2.9 乳化性和乳化穩(wěn)定性測定結果

蛋白質具有乳化活性，主要表現(xiàn)為可以迅速地吸附到界面并展開，同時到達界面后可以與相鄰的分子形成膜[41-42]。如圖9所示，整體來看，產物蛋白乳化性呈現(xiàn)上升趨勢，乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)下降趨勢。在第7天時普通發(fā)酵和靜磁場輔助發(fā)酵乳化性達到最高值，分別為25.03 m2/g和26.83 m2/g，乳化穩(wěn)定性降低至最小值，分別為35.94%和34.10%。這可能歸因于靜磁場處理使其結構松散，極性基團使其親水性和親油性增加，雙親性逐漸到達一定的平衡狀態(tài)，從而乳化性增大；而靜磁場處理使肽鏈長度變短，可吸附的蛋白數(shù)量變少，導致界面膜的厚度和強度均下降，從而乳化穩(wěn)定性降低[43-44]。

圖9 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）Fig.9 Emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of fermentation products under different conditions

2.10 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定結果

有研究表明，影響蛋白質起泡性的主要因素有分子兩親性、濃度、極性基團和帶電基團的分布[45]。如圖10所示，產物蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性隨發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢，在第7天時，普通發(fā)酵和靜磁場輔助發(fā)酵起泡性分別為28%和37.67%，泡沫穩(wěn)定性分別為48.03%和58.12%。這可能與極性基團有關，也可能由于發(fā)酵時間的延長使產物蛋白中部分肽鏈在界面上伸展開，通過分子間或分子內的肽鏈之間的相互作用形成一個保護網(wǎng)使界面膜得以加強，從而促進泡沫的形成和穩(wěn)定[46]。

圖10 不同條件下發(fā)酵產物蛋白的起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）Fig.10 Foaming capacity (A) and foam stability (B) of fermentation products under different conditions

3 結論

本實驗采用靜磁場輔助蜜環(huán)菌發(fā)酵玉米醇溶蛋白，并對其產物蛋白的結構和理化特性進行研究。結果發(fā)現(xiàn)靜磁場輔助發(fā)酵能夠改變產物蛋白的結構，使產物蛋白內部氫鍵斷裂，發(fā)生解折疊，無序性增大，蛋白分子結構舒展、基團暴露，表面粗糙多孔，擁有更高的熱穩(wěn)定性，且使粒徑減小，Zeta電位絕對值增大，游離巰基含量呈現(xiàn)上升趨勢，二硫鍵含量呈現(xiàn)下降趨勢，產物蛋白結構的變化進而改善其理化特性，與普通發(fā)酵相比，經(jīng)靜磁場輔助發(fā)酵后的產物蛋白擁有更好的理化特性，其持水性、持油性、乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性均明顯升高，乳化穩(wěn)定性明顯降低。綜上可說明靜磁場輔助蜜環(huán)菌發(fā)酵可以改變產物蛋白的結構，并有效改善其理化特性，本實驗為復合改性玉米醇溶蛋白提供了一定的參考，為拓寬玉米醇溶蛋白的應用領域提供了理論依據(jù)。未來可進一步開展更深層次的機理研究。