谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化交聯(lián)對(duì)肌原纖維蛋白凝膠特性影響的研究進(jìn)展

張靖銘，馮旸旸，時(shí)平茹，孔保華，曹傳愛(ài)，王 輝，劉 騫

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是肉蛋白中最重要的組成部分，約占總蛋白質(zhì)含量的55%～60%，其在熱處理?xiàng)l件下會(huì)通過(guò)非共價(jià)相互作用和共價(jià)交聯(lián)形成有序的三維網(wǎng)狀的凝膠基質(zhì)，賦予肉制品良好的保水、保油特性和感官特性[1]。隨著人們對(duì)高品質(zhì)肉制品需求的不斷增加，研究人員正在努力提高M(jìn)P的凝膠特性，包括持水性、硬度、彈性、致密性等。考慮到非共價(jià)相互作用的鍵能較低，反應(yīng)通常是不穩(wěn)定和可逆的[2]，而共價(jià)交聯(lián)在理想情況下能達(dá)到電子飽和的狀態(tài)，形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定和堅(jiān)固，因此研究MP的共價(jià)交聯(lián)具有更深遠(yuǎn)的意義。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（transglutaminase，TGase）能夠催化蛋白質(zhì)多肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基與賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，產(chǎn)生ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，增強(qiáng)蛋白分子內(nèi)或分子間的共價(jià)交聯(lián)（圖1），其交聯(lián)度（degree of cross-linking，DCL）對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠特性起到?jīng)Q定性作用[3]。DCL首先取決于底物蛋白質(zhì)的種類，不同的蛋白質(zhì)對(duì)TGase表現(xiàn)出不同的親和性，MP頭部的肌球蛋白中含有豐富且充分暴露的賴氨酸和谷氨酰胺殘基，使其成為TGase作用的良好底物[4]。目前已有大量學(xué)者研究了TGase的共價(jià)交聯(lián)對(duì)MP凝膠特性的影響，他們發(fā)現(xiàn)，該酶通過(guò)降低α-螺旋含量和增加β-折疊含量，顯著改變了MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其形成了大分子聚合物[5-7]。這些結(jié)構(gòu)的變化使MP的熱誘導(dǎo)凝膠具有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度，且在一定范圍內(nèi)DCL與凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性[8]。有研究證明，提升的凝膠強(qiáng)度也賦予肉制品更優(yōu)越的硬度、彈性、黏結(jié)性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特征[9-10]。同時(shí)，由于凝膠結(jié)構(gòu)變化減少了風(fēng)味前體物質(zhì)的損失，產(chǎn)品會(huì)表現(xiàn)出更加突出的風(fēng)味特征[11]。此外，有研究表明隨著DCL增加，肌球蛋白的水解增強(qiáng)，消化物中存在生物活性肽的可能性也增加[12]。

圖1 TGase催化共價(jià)交聯(lián)過(guò)程Fig.1 Covalent cross-linking process catalyzed by TGase

現(xiàn)階段對(duì)于TGase催化共價(jià)交聯(lián)改善MP凝膠特性的研究已經(jīng)趨于完善，然而在實(shí)際應(yīng)用方面還存在著一些亟待解決的問(wèn)題，如TGase催化交聯(lián)會(huì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用而抑制蛋白質(zhì)-水的相互作用，導(dǎo)致凝膠的持水性降低[13]，在產(chǎn)品中表現(xiàn)出較大的蒸煮損失。因此，近年來(lái)研究者開(kāi)始關(guān)注外源添加物和新型加工技術(shù)協(xié)同TGase對(duì)MP凝膠特性的影響，但現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)其影響DCL的情況和機(jī)制缺乏歸納總結(jié)。本文詳細(xì)介紹了TGase催化MP-DCL測(cè)定和表征方法，通過(guò)分析其影響因素揭示TGase改善MP凝膠品質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制，并綜述了外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同TGase對(duì)MP凝膠特性的影響及分子作用機(jī)制，為后續(xù)TGase在現(xiàn)代肉制品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 DCL的表征及其影響因素

1.1 DCL的測(cè)定和表征

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于表征TGase催化效果的DCL的測(cè)定方法如表1所示。ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵是TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)過(guò)程中形成的一種異肽鍵，其含量的多少直接表明了DCL的數(shù)量多少。同時(shí)，因?yàn)镸P中的游離氨基參與異肽鍵形成，所以游離氨基含量的降低可間接反映ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的增加，即DCL增加，可用下式表示[8]。此外，大分子聚集物的形成或肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）的減少也可以表示DCL的增加。

表1 DCL的測(cè)定和表征方法Table 1 Summary of methods for determination and characterization of DCL

式中：a表示酶處理前游離氨基含量；a′表示酶處理后游離氨基含量。

1.2 DCL的影響因素

TGase作為一種蛋白質(zhì)交聯(lián)酶，其催化MP共價(jià)交聯(lián)的過(guò)程符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此DCL受內(nèi)部因素和反應(yīng)環(huán)境的制約，其中內(nèi)部因素包括酶濃度、底物濃度和底物結(jié)構(gòu)，反應(yīng)環(huán)境包括溫度、時(shí)間和離子強(qiáng)度（圖2）。

圖2 TGase催化MP交聯(lián)的影響因素Fig.2 Factors influencing MP cross-linking catalyzed by TGase

1.2.1 酶濃度和底物濃度

在酶促反應(yīng)中，酶濃度和底物的濃度是限制反應(yīng)速率的最主要因素。研究發(fā)現(xiàn)，TGase添加量的增加使MP的G′值顯著增大，其原因是當(dāng)TGase添加量較低時(shí)，只有少部分MP分子能夠產(chǎn)生交聯(lián)，當(dāng)TGase添加量充足時(shí)，MP分子之間才會(huì)充分交聯(lián)[22]。同時(shí)，楊明柳等[23]研究發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE圖譜中MHC帶隨TGase添加量的增加逐漸減弱，同樣說(shuō)明了DCL隨TGase添加量的增加而增加。但值得注意的是，由于MP中的谷氨酰胺和賴氨酸殘基含量有限，所以DCL并不是隨著TGase添加量的增加而無(wú)限增加[24]。

1.2.2 底物結(jié)構(gòu)

氧化會(huì)改變MP結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響MP分子內(nèi)及分子間的共價(jià)交聯(lián)。Li Chunqiang等[25]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)TGase處理的輕度氧化MP的DCL為87.6%，未氧化MP的DCL為64.7%，而過(guò)度氧化MP的DCL僅為33.8%，說(shuō)明輕度氧化有利于增加DCL，使MP形成更致密、均勻的三維網(wǎng)絡(luò)凝膠結(jié)構(gòu)。這可能是因?yàn)檩p度氧化時(shí)，MP分子中有少量巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵使蛋白質(zhì)聚集，拉近了谷氨酰胺和賴氨酸殘基的距離而促進(jìn)TGase的催化反應(yīng)[26]。

1.2.3 反應(yīng)溫度

一方面，溫度的變化會(huì)導(dǎo)致MP結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，研究表明肌球蛋白頭部在30～50 ℃時(shí)開(kāi)始聚集，50～60 ℃時(shí)形成較大的球狀聚集體[27]；另一方面，溫度還會(huì)影響酶的活性，TGase作用的溫度范圍為4～65 ℃，最適溫度為45～55 ℃[28]。Shi Yafang等[29]研究了TGase在30～90 ℃條件下作用20 min對(duì)DCL及MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明，在40 ℃條件下，TGase的交聯(lián)能力最強(qiáng)并對(duì)MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性具有最明顯的提升效果。

1.2.4 反應(yīng)時(shí)間

根據(jù)溫度的不同，酶的作用時(shí)間也不相同，TGase催化常用的有4 ℃低溫長(zhǎng)時(shí)間交聯(lián)和40 ℃短時(shí)間孵育兩種方式，其中40 ℃孵育因?yàn)槎虝r(shí)高效而得到更廣泛的關(guān)注。郭秀瑾等[30]在酶添加量10 U/g、反應(yīng)溫度40 ℃條件下研究不同MP凝膠化時(shí)間對(duì)DCL的影響，發(fā)現(xiàn)前4 h內(nèi)MHC含量逐漸下降且MP凝膠的微觀結(jié)構(gòu)越來(lái)越規(guī)則和致密，證明隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DCL逐漸增加。Fang Mengxue等[31]也發(fā)現(xiàn)在酶添加量9 U/g、40 ℃的條件下反應(yīng)0 h時(shí)，DCL為18.52%，隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至2 h和12 h，DCL分別增加至34.76%和62.87%。不同TGase催化時(shí)間形成的不同DCL的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 不同DCL的MP凝膠微觀結(jié)構(gòu)[31]Fig.3 Microstructure of MP gels with different DCL[31]

1.2.5 離子強(qiáng)度

溶液離子強(qiáng)度的變化會(huì)改變環(huán)境的pH值，研究發(fā)現(xiàn)在25 ℃、100 U/g條件下，TGase催化的MP凝膠在酸性環(huán)境中強(qiáng)度較低，在弱堿性環(huán)境中強(qiáng)度相對(duì)較高，pH 8.5時(shí)凝膠強(qiáng)度最大[32]。同時(shí)，因MP具有鹽溶特性，高鹽離子濃度能夠促使MP結(jié)構(gòu)展開(kāi)，增加TGase對(duì)谷氨酰胺和賴氨酸殘基的可及性，提高DCL[26]。此外，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+具有激活TGase的作用，能夠增加DCL，使MP凝膠品質(zhì)增強(qiáng)，微觀結(jié)構(gòu)緊密、均勻，空洞孔洞少；但是過(guò)高的Ca2+含量則會(huì)導(dǎo)致過(guò)度交聯(lián)，導(dǎo)致MP凝膠強(qiáng)度、彈性下降[33]。

2 外源添加物與TGase協(xié)同對(duì)DCL和MP凝膠特性的影響

在過(guò)去的研究和實(shí)際生產(chǎn)中，許多外源添加物已被開(kāi)發(fā)并用于MP改性，包括多酚、堿性氨基酸、親水膠體、淀粉和非肉蛋白等。但由于大多數(shù)的外源添加物都是通過(guò)非共價(jià)相互作用修飾MP結(jié)構(gòu)以改善其凝膠特性，作用相對(duì)有限且不穩(wěn)定，因此近年來(lái)研究者們開(kāi)始關(guān)注外源添加物與TGase的協(xié)同作用。本節(jié)對(duì)這些不同外源添加物與TGase協(xié)同催化MP交聯(lián)的效果及其分子作用機(jī)制綜述如下。

2.1 多酚

多酚是一類從植物中提取的天然小分子化合物，具有很強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化活性，因此通常作為功能性食品添加劑應(yīng)用到肉制品中。多酚具有特殊的結(jié)構(gòu)和特性，能夠與MP發(fā)生可逆或不可逆的相互作用，并以劑量依賴的方式誘導(dǎo)MP聚集，從而改變MP的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)、功能和形態(tài)性質(zhì)[34]。較低濃度的多酚能有效提高M(jìn)P的交聯(lián)程度，而高濃度的多酚會(huì)由于“氨基-醌”“巰基-醌”等相互作用發(fā)生過(guò)度交聯(lián)，破壞MP的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MP聚集不均勻，形成較差的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)，凝膠強(qiáng)度降低[35]。TGase催化MP發(fā)生共價(jià)交聯(lián)的特性可以很好地彌補(bǔ)多酚的劣勢(shì)，因此有研究者將二者復(fù)配應(yīng)用于MP體系中，研究其協(xié)同作用對(duì)DCL和MP凝膠特性的影響。

Zhang Daojiu等[36]研究了TGase協(xié)同原花青素B2（proanthocyanidin B2，PCB2）對(duì)MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明PCB2通過(guò)與MP中的巰基結(jié)合而轉(zhuǎn)化為醌-巰基配合物，能夠在一定程度上提升DCL，進(jìn)而促進(jìn)更加致密的MP凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，提高了MP凝膠特性。但值得注意的是，PCB2和TGase協(xié)同作用所產(chǎn)生的大分子聚集物會(huì)導(dǎo)致MP溶解度的降低。Chang Jinyang等[37]研究了TGase與綠原酸（chlorogenic acid，CA）協(xié)同改善氧化MP凝膠特性的效果，其結(jié)果表明高濃度CA會(huì)導(dǎo)致MP凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散、孔徑大且不規(guī)則，而在TGase與CA協(xié)同作用下MP凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)緊湊、孔隙均勻，這說(shuō)明TGase能夠克服高劑量CA引起的凝膠結(jié)構(gòu)劣變，增加DCL。同時(shí)，二者的協(xié)同作用使更多的水分子被截留在凝膠內(nèi)部，并使水分分布趨于均勻，顯著提高氧化損傷MP凝膠的持水能力。同時(shí)，有研究者通過(guò)分子對(duì)接說(shuō)明了表沒(méi)食子茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）與MHC的共價(jià)和非共價(jià)相互作用，確認(rèn)了以MHC為底物的TGase催化機(jī)制（圖4）。

圖4 通過(guò)分子對(duì)接分析MHC與EGCG的相互作用及TGase的催化機(jī)制[38]Fig.4 Interaction analysis between MHC and EGCG and catalytic mechanism of TGase via molecular docking[38]

2.2 堿性氨基酸

堿性氨基酸是人體的必需或半必需氨基酸，包括精氨酸（arginine，Arg）、賴氨酸（lysine，Lys）和組氨酸（histidine，His），作為一種安全無(wú)毒、來(lái)源廣泛、營(yíng)養(yǎng)健康且價(jià)格低廉的小分子物質(zhì)，將其添加到食品體系中不會(huì)引入有害物質(zhì)，是一種綠色的食品添加劑。大量研究表明，在MP溶液中添加堿性氨基酸能夠提高體系pH值，并通過(guò)電荷作用擾亂MP分子結(jié)構(gòu)，使肌球蛋白絲狀體解離，進(jìn)而使MP溶解度增加[39]。另外也有研究者發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸可以通過(guò)與MP中酸性氨基酸殘基發(fā)生相互作用抑制MP聚集，起到增加MP溶解度的效果[40]。溶解度的增加會(huì)使得MP結(jié)構(gòu)展開(kāi)，不僅有利于形成良好的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，還可以增加TGase對(duì)賴氨酸和谷氨酰胺殘基的可及性，增加DCL并改善MP凝膠特性[41]。

Cao Yungang等[42]研究發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)添加TGase或Lys的實(shí)驗(yàn)組相比，二者協(xié)同作用的MP凝膠呈現(xiàn)出更為精細(xì)、光滑、致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明TGase與Lys在提升DCL和改善凝膠結(jié)構(gòu)方面具有協(xié)同作用。此外，Lys的ε-氨基作為TGase的反應(yīng)底物，使得Lys可以在TGase的作用下被連接到MP分子內(nèi)部，因其本身具有咸味，可以有效地提升產(chǎn)品的風(fēng)味特征和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[43]。Cao Yungang等[44]的另一項(xiàng)研究表明，TGase與Arg的組合也能夠協(xié)同增加DCL，并顯著提高M(jìn)P的凝膠強(qiáng)度和持水性，使其呈現(xiàn)出細(xì)膩、致密的微觀結(jié)構(gòu)。Shi Tong等[45]進(jìn)一步研究在微波輻射條件下，Arg與TGase協(xié)同改善低鹽MP凝膠特性的分子作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Arg能夠結(jié)合在MP表面，并通過(guò)靜電作用和陽(yáng)離子相互作用增加MP的水分散性，使其在TGase作用下發(fā)生更大程度的交聯(lián)，其交聯(lián)機(jī)制如圖5所示。同時(shí)，在TGase作用下相互靠近的MHC能與Arg的羧基產(chǎn)生相互作用破壞掉原有的氫鍵，產(chǎn)生新的氫鍵，使MP分子出現(xiàn)更多的展開(kāi)和聚集行為，顯著提高熱誘導(dǎo)凝膠的DCL，進(jìn)而提升凝膠強(qiáng)度和保水性。

圖5 Arg與TGase協(xié)同改善低鹽MP凝膠特性的機(jī)制[45]Fig.5 Synergic mechanism of action of Arg combined with TGase in improving the gel properties of low-salt MP[45]

2.3 親水膠體

親水膠體是以單糖為單位形成的大分子多糖，在自然界中來(lái)源豐富，因具有良好的增稠、膠凝、穩(wěn)定、保水以及乳化能力，在食品行業(yè)中迅速發(fā)展并得到廣泛應(yīng)用[46]。肉制品加工過(guò)程中常用的親水膠體包括魔芋膠、卡拉膠、可得然膠、黃原膠、海藻酸鈉和納米纖維素等，溶于水后能夠與水分子相互作用形成水凝膠，在MP體系中形成較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-多糖-水復(fù)合體系，對(duì)于致密穩(wěn)定的MP凝膠形成有促進(jìn)作用[47]?；谶^(guò)去幾年的突出成果和快速進(jìn)展，目前關(guān)于親水膠體的研究正轉(zhuǎn)向與其他成分相互作用的調(diào)控。

孫樂(lè)常等[48]研究在熱誘導(dǎo)凝膠形成過(guò)程中添加TGase和魔芋膠（konjac gum，KGM）對(duì)MP凝膠品質(zhì)的影響，結(jié)果表明KGM的加入引起了MP周圍水分子的重排，改變了MP的分子間作用力，從而導(dǎo)致MP中親水性氨基酸暴露，為TGase催化ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的形成提供了有利條件，增加了DCL。同時(shí)，有研究者在魚明膠與TGase和κ-卡拉膠的雙交聯(lián)實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果[49]。但是，Zhang Xiaowei等[50]研究發(fā)現(xiàn)羧化納米纖維素（carboxylated nanofiber cellulose，cNFC）和TGase能夠協(xié)同提升MP凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，但并未增加DCL。其作用機(jī)制如圖6所示，TGase催化MP交聯(lián)，抑制cNFC的運(yùn)動(dòng)，形成MP-cNFC半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中兩種物質(zhì)幾乎不發(fā)生相互作用而是保持各自的結(jié)構(gòu)，相互糾纏、相互支撐，從而提高M(jìn)P的凝膠強(qiáng)度。

圖6 TGase催化MP-cNFC半互穿網(wǎng)絡(luò)形成機(jī)制[50]Fig.6 Formation mechanism of MP-cNFC semi-interpenetrating polymer network catalyzed by TGase[50]

2.4 淀粉

淀粉作為一種水固結(jié)劑，在許多肉制品生產(chǎn)過(guò)程中起到了降低成本、提高保水性、改善質(zhì)構(gòu)特性的重要作用。雖然MP和淀粉在加熱過(guò)程中的熱轉(zhuǎn)變是相互獨(dú)立的，但淀粉在加熱溫度達(dá)到70 ℃時(shí)發(fā)生糊化，淀粉顆粒吸收大量的水，體積膨脹到初始大小的數(shù)倍，能夠?qū)P凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)起到支撐作用，使其具有更好的持水力和更高的凝膠強(qiáng)度[51]。

夏秀芳[52]、鄧思楊[53]等研究不同的馬鈴薯淀粉和TGase添加量對(duì)MP熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉與TGase的添加能夠促使MP在分子內(nèi)和分子間產(chǎn)生交聯(lián)，形成大分子物質(zhì)。但二者作用機(jī)制不同且沒(méi)有觀察到協(xié)同作用。淀粉糊化吸水后與MP相互作用形成淀粉-蛋白-水的復(fù)合型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提升了MP凝膠的持水性和凝膠強(qiáng)度，主要涉及氫鍵等非共價(jià)作用[54]；而TGase是通過(guò)催化作用形成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，使MP凝膠網(wǎng)絡(luò)更為致密，共價(jià)作用是此過(guò)程中的主要因素。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)添加過(guò)量的淀粉會(huì)導(dǎo)致DCL降低，其原因可能是在加熱升溫的過(guò)程中，淀粉糊化的發(fā)生先于MP凝膠的形成，過(guò)量的淀粉顆粒遮蔽了賴氨酸和谷氨酰胺殘基，降低了TGase對(duì)底物的可及性，進(jìn)而導(dǎo)致DCL降低[55]。

2.5 植物蛋白

在肉制品加工中，添加植物蛋白能夠在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。這是因?yàn)橹参锏鞍妆旧砜梢酝ㄟ^(guò)填補(bǔ)凝膠空隙或者改變凝膠結(jié)構(gòu)而影響MP熱誘導(dǎo)凝膠特性[56]。然而，由于缺乏結(jié)構(gòu)變化，植物蛋白和MP分子之間的相互作用通常有限，甚至可能由于干擾MP凝膠行為而對(duì)凝膠品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[57]。

Jiang Jiang等[58]研究改性的大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）與TGase協(xié)同作用對(duì)DCL和MP凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)酸改性的SPI能夠明顯提升MP的最終G′值，且TGase的加入進(jìn)一步強(qiáng)化了上述現(xiàn)象，說(shuō)明TGase與酸改性的SPI在增加DCL方面有明顯的協(xié)同作用。推測(cè)其原因，一方面是SPI增大了MP的溶解度，增強(qiáng)了TGase對(duì)底物氨基酸殘基的可及性；另一方面是TGase能催化SPI中的β-伴大豆球蛋白（7S）和球蛋白（11S）與MP中活性基團(tuán)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)。同時(shí)，有研究者發(fā)現(xiàn)超聲改性的豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）和TGase對(duì)于改善低磷環(huán)境下MP的凝膠特性具有相似的協(xié)同效應(yīng)，能使焦磷酸鈉（sodium pyrophosphate，SPP）的添加量減少50%，其作用機(jī)制如圖7所示[59]。此外，Lee等[60]用紅豆分離蛋白和TGase聯(lián)合作用于低鹽MP體系，發(fā)現(xiàn)二者的協(xié)同效應(yīng)能夠克服低鹽造成的凝膠結(jié)構(gòu)劣變，獲得的MP凝膠仍具有良好的持水力和堅(jiān)固、致密的凝膠結(jié)構(gòu)。

圖7 TGase催化MP和改性PPI復(fù)合凝膠形成機(jī)制[59]Fig.7 Mechanism of composite gel formation from MP and modified PPI catalyzed by TGase[59]

3 新型加工技術(shù)對(duì)TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)程度的影響

隨著人們對(duì)高品質(zhì)食品需求的增長(zhǎng)，超聲處理（ultrasound treatment，UT）、高壓處理（high-pressure processing，HPP）、微波和脈沖電場(chǎng)等一系列新型加工技術(shù)正在食品工業(yè)中推廣應(yīng)用，由于其具有獨(dú)特的能量傳輸機(jī)制，生產(chǎn)效率更高、產(chǎn)品品質(zhì)更好、對(duì)環(huán)境的影響更小，因此近年來(lái)研究者針對(duì)上述新型加工技術(shù)開(kāi)展了大量研究。本節(jié)綜述了UT、HPP、微波協(xié)同TGase對(duì)DCL和MP凝膠品質(zhì)的影響及其分子作用機(jī)制。

3.1 超聲波技術(shù)

UT是一項(xiàng)新興的非熱加工技術(shù)，因其無(wú)污染、安全、易操作等優(yōu)點(diǎn)在食品加工領(lǐng)域得到了廣泛的研究，具有很大的應(yīng)用潛力。超聲波能夠產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，其中空化效應(yīng)對(duì)MP結(jié)構(gòu)的影響最為顯著?？栈?yīng)即超聲產(chǎn)生的氣泡在爆破時(shí)引起微射流對(duì)物體表面造成物理?yè)p傷的現(xiàn)象，能夠破壞肌纖維的Z線和M線，增大肌纖維間的間隙，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)-水相互作用，同時(shí)使蛋白質(zhì)的活性基團(tuán)暴露，有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，有助于形成均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[61]。近年來(lái)，超聲輔助酶技術(shù)被廣泛應(yīng)用于改變食物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)[62-63]。

Feng Jiaqi等[64]研究TGase和UT及其組合對(duì)MP凝膠特性的影響，其動(dòng)態(tài)流變學(xué)結(jié)果表明UT-TG處理組樣品的G′值最高，其次為TGase處理組和UT處理組樣品，未經(jīng)處理樣品的G′值最低，說(shuō)明TGase與UT的聯(lián)合作用提升了MP-DCL，得到了具有較高強(qiáng)度和彈性的凝膠。其SEM結(jié)果表明，UT-TG處理組樣品的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密，孔隙更小，且比TGase處理組和UT處理組樣品的凝膠網(wǎng)絡(luò)連通性更高，結(jié)構(gòu)更有序。這是因?yàn)閁T能夠促進(jìn)TGase運(yùn)動(dòng)，使其擴(kuò)散到MP分子的各個(gè)位點(diǎn)，從而在加熱過(guò)程中形成更均勻有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)[65]。Gao Xia等[66]研究發(fā)現(xiàn)，超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)會(huì)釋放大量的能量并產(chǎn)生強(qiáng)烈的剪切力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，肌動(dòng)球蛋白解離，使肌球蛋白在鹽溶液中的溶解度升高，并隨著反應(yīng)進(jìn)行均勻分散，充分暴露出供TGase作用的活性基團(tuán)，在其熱誘導(dǎo)凝膠中形成更多的ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，其作用機(jī)制如圖8a所示。此外，還有研究者推測(cè)UT改變了TGase的構(gòu)象，提高了TGase活性，并誘導(dǎo)了更適合TGase作用的MP構(gòu)象，使DCL進(jìn)一步增加[67]。但也有研究表明，過(guò)強(qiáng)的超聲強(qiáng)度可能會(huì)導(dǎo)致TGase結(jié)構(gòu)大幅改變，喪失其原有活性[68]。

圖8 新型加工技術(shù)影響TGase催化MP凝膠形成的作用機(jī)制Fig.8 Mechanism of the effect of novel processing technologies on MP gel formation catalyzed by TGase

3.2 HPP技術(shù)

HPP是一項(xiàng)高效率、低能耗、無(wú)毒無(wú)害的非熱處理技術(shù)，因其對(duì)菌落致死率高達(dá)97%，能夠有效延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期，已作為一種冷殺菌手段在食品行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用[69]。近年來(lái)，研究者又發(fā)現(xiàn)HPP能夠改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，暴露出巰基和疏水基團(tuán)，減少蛋白與水分子的接觸，有利于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[70]。同時(shí)，HPP還會(huì)影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈的相互作用，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)變性、聚集或凝膠化，但其形成的凝膠結(jié)構(gòu)類似于一種“海綿狀”，主要由疏水作用力維持，無(wú)法形成均勻穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[71]。因此，近年來(lái)研究者嘗試?yán)肨Gase彌補(bǔ)HPP誘導(dǎo)凝膠的不足。

Herranz等[71]研究TGase、HPP和這兩種處理的組合在MP凝膠形成過(guò)程中的作用，其結(jié)果表明，僅添加TGase的處理組形成的凝膠共價(jià)鍵比例較大，凝膠結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的剛性特征，而HPP處理產(chǎn)生的壓縮-膨脹效應(yīng)會(huì)使得非共價(jià)鍵重新組合，產(chǎn)生更富有彈性的凝膠網(wǎng)絡(luò)，二者的聯(lián)合作用沒(méi)有觀察到明顯的協(xié)同效果。但Kunnath等[72]研究發(fā)現(xiàn)TGase對(duì)HPP誘導(dǎo)的MP凝膠特性具有明顯的提升效果，具體表現(xiàn)為TGase的加入使HPP誘導(dǎo)的MP凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出更為連續(xù)、均勻的狀態(tài)，在后續(xù)加熱過(guò)程中，相互靠近的巰基形成二硫鍵進(jìn)一步加強(qiáng)了MP聚集，形成表面連續(xù)均勻、孔洞小的凝膠，具有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度。

上述研究結(jié)果并不一致，這可能與HPP作用的強(qiáng)度、時(shí)間等因素有關(guān)，但更重要的似乎是HPP與TGase的作用順序。如圖8b所示，先加入TGase反應(yīng)一段時(shí)間后再進(jìn)行HPP，則HPP作用效果不顯著，這是因?yàn)門Gase催化產(chǎn)生的共價(jià)鍵強(qiáng)于HPP建立的非共價(jià)相互作用[73]。先進(jìn)行HPP可以促進(jìn)MP的展開(kāi)，使更多活性基團(tuán)暴露，更容易被TGase催化形成共價(jià)鍵[41]。

3.3 微波處理技術(shù)

與傳統(tǒng)加熱相比，微波處理是一種綠色、環(huán)保、清潔的技術(shù)，它通過(guò)產(chǎn)生電磁場(chǎng)進(jìn)行加熱，直接引起材料分子內(nèi)的振動(dòng)，由于其穿透能力強(qiáng)、加熱速度快、加工時(shí)間短、能源效率高、操作簡(jiǎn)單，在食品工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，包括烹飪、殺菌、干燥、解凍、生物活性成分提取和誘導(dǎo)MP凝膠化等[74]。微波因其特殊的交變電場(chǎng)，可以改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的電荷環(huán)境和內(nèi)電場(chǎng)分布，從而破壞蛋白質(zhì)肽鏈之間的靜電作用，和傳統(tǒng)的水浴加熱相比更容易形成肌球蛋白聚集體從而形成更好的凝膠結(jié)構(gòu)[75-76]。

然而，Cao Hongwei等[77]研究相同的TGase反應(yīng)條件下，微波加熱與傳統(tǒng)水浴加熱對(duì)MP凝膠特性的影響，結(jié)果表明兩種加熱方式誘導(dǎo)的MP凝膠的DCL差異不大。這是因?yàn)槲⒉ㄋa(chǎn)生的交變電場(chǎng)對(duì)MP分子有“撕扯”的作用，有利于MP結(jié)構(gòu)展開(kāi)，原本包埋在其內(nèi)部的活性殘基暴露，使得二硫鍵廣泛形成，但二硫鍵所產(chǎn)生的空間位阻會(huì)阻礙ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵的形成，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，二硫鍵作用形成的大分子聚集體又會(huì)將原本暴露出來(lái)的活性殘基重新包埋起來(lái)，降低TGase對(duì)底物的可及性，進(jìn)一步阻止TGase催化MP交聯(lián)[78]。其潛在的機(jī)制如圖8c所示。

但值得注意的是，微波除了簡(jiǎn)單的熱效應(yīng)外，還可以通過(guò)非熱效應(yīng)對(duì)酶本身直接產(chǎn)生作用，如酶分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，引起酶活性的變化，最終影響其作用結(jié)果[79]。研究發(fā)現(xiàn)TGase的活性受微波功率和加熱時(shí)間的影響。在相同的升溫速率下，微波加熱的TGase活性在40 ℃時(shí)達(dá)到最高值，且高于常規(guī)水浴加熱，這是因?yàn)門Gase分子自身的介電特性使其在微波交變電場(chǎng)的作用下發(fā)生偶極-偶極相互作用，活性位點(diǎn)發(fā)生改變而使酶活性提高[80]。因此，將微波改性的TGase加入到MP體系中或許是提高DCL的一種有效手段。

4 結(jié)語(yǔ)

如今消費(fèi)者的健康意識(shí)逐漸增強(qiáng)，清潔標(biāo)簽食品的發(fā)展成為必然趨勢(shì)，低鹽低磷等肉制品的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)已經(jīng)成為肉品行業(yè)的熱點(diǎn)研究問(wèn)題。TGase能夠催化生成ε-(γ-谷氨酰胺)賴氨酸鍵，提高DCL，賦予MP良好的凝膠特性，進(jìn)而改善肉制品品質(zhì)，這對(duì)于清潔標(biāo)簽肉制品的生產(chǎn)具有重要意義。由于TGase單獨(dú)作用對(duì)MP凝膠特性的提升效果有限，因此研究者將其他外源添加物和新型加工技術(shù)引入到TGase催化MP共價(jià)交聯(lián)的過(guò)程中，旨在彌補(bǔ)TGase作用缺陷的同時(shí)進(jìn)一步提升MP凝膠特性，以獲得品質(zhì)更優(yōu)的產(chǎn)品。

近幾年，關(guān)于TGase與外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同改善MP凝膠特性的研究已經(jīng)取得了一定成果，然而不可忽視的是這些方案還存在著一些問(wèn)題。第一，雖然目前國(guó)內(nèi)外已有大量研究表明外源添加物如多酚、堿性氨基酸、淀粉、親水膠體和非肉蛋白等能夠與TGase協(xié)同提高M(jìn)P交聯(lián)程度，但對(duì)二者協(xié)同作用機(jī)制研究的深度和廣度還有不足，未來(lái)可深入探究其分子互作行為和凝膠過(guò)程中MP結(jié)構(gòu)的演化規(guī)律。第二，各種新型加工技術(shù)與TGase聯(lián)合作用時(shí)的參數(shù)選擇還不明確，強(qiáng)度過(guò)低作用效果不明顯，強(qiáng)度過(guò)高可能破壞TGase的結(jié)構(gòu)使其失活或?qū)P結(jié)構(gòu)造成損傷，此外新型加工技術(shù)與TGase的作用順序也是未來(lái)研究的一項(xiàng)重點(diǎn)。第三，現(xiàn)有研究大多集中在MP體系中，但對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)中面臨的多組分共混體系的研究還不夠豐富，因此在未來(lái)的研究中，應(yīng)當(dāng)考慮TGase的共價(jià)交聯(lián)作用對(duì)多組分體系凝膠結(jié)構(gòu)的影響，擴(kuò)大TGase在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。第四，研究TGase與外源添加物或新型加工技術(shù)協(xié)同作用改善凝膠結(jié)構(gòu)對(duì)肉制品口感、風(fēng)味釋放和消化吸收等特性的影響，以便合理控制TGase催化的MP-DCL，為實(shí)際生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。