• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    體外腸道細胞模型及其在評價花青素吸收轉(zhuǎn)運中的研究進展

    2024-04-08 02:28:24劉曉鳳關(guān)榮發(fā)
    食品科學(xué) 2024年5期
    關(guān)鍵詞:利用模型

    鐘 浩,徐 潔,陳 玲,劉曉鳳,關(guān)榮發(fā),*

    (1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.海南省食品藥品檢驗所三亞分所,海南 三亞 572011)

    花青素是一種膳食類黃酮,被廣泛應(yīng)用于食品藥品中?;ㄇ嗨卦谖改c道會被降解,同時受pH值、糖苷鍵結(jié)構(gòu)、消化酶、腸道微生物群等因素的影響[1-2]。花青素的生物利用度是其發(fā)揮功能活性的基礎(chǔ),即花青素通過消化道吸收轉(zhuǎn)運后進入血液的含量,但花青素不穩(wěn)定且易被降解,這使得花青素的生物可及性和生物利用度非常有限。數(shù)十年來已有諸多研究通過體內(nèi)體外模型探究功能活性成分在腸道的吸收利用,雖然動物模型可以模擬整個生物體的生理機能,但體內(nèi)模型往往由于物種之間的差異而導(dǎo)致反應(yīng)的變化不同,以及難以將結(jié)果外推到人類身上。近年來,細胞培養(yǎng)模型已廣泛應(yīng)用于食品和藥學(xué)領(lǐng)域的生物利用度和毒理學(xué)研究[3-4]。因此利用模擬體外胃腸道消化和腸道細胞模型能夠較好地模擬人體對花青素的吸收利用。目前,細胞模型廣泛應(yīng)用于不同食品生物活性物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運研究,基于此背景,本文綜述了二維和三維腸道細胞培養(yǎng)模型的研究進展,并探討了其在花青素吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)研究中的應(yīng)用。

    1 腸上皮的結(jié)構(gòu)與功能

    腸道微環(huán)境主要由腸道微生物群與其生活的微環(huán)境構(gòu)成,其中包括腸上皮細胞與覆蓋上皮細胞的若干黏膜屏障,如含有抗菌分子的黏液層。腸上皮主要由杯狀細胞、腸上皮細胞、腸內(nèi)分泌細胞、增殖細胞、腸干細胞和潘氏細胞等組成[5](圖1)。腸內(nèi)分泌細胞可以釋放肽激素,這與組織修復(fù)、血管生成、腸細胞分化和極化有關(guān)[6]。杯狀細胞可產(chǎn)生黏液,作為抵御有害物質(zhì)或微生物感染的保護層[7]。同樣地,位于隱窩基部的腸干細胞也可以分化為其他腸細胞,從而維持腸道的完整性[8]。腸上皮細胞可以產(chǎn)生黏膜屏障,以隔離腸道微生物群及腸道免疫細胞,維持腸道穩(wěn)態(tài)。黏膜屏障主要包括化學(xué)屏障和物理屏障?;瘜W(xué)屏障由AMP和Reg3系列蛋白組成,這些蛋白受到腸道內(nèi)部環(huán)境和免疫細胞細胞因子調(diào)節(jié);物理屏障則主要包括覆蓋腸黏膜的黏液層、腸吸收細胞微絨毛上的糖萼和腸上皮細胞的細胞間連接。

    圖1 腸上皮細胞圖Fig.1 Schematic of intestinal epithelial cells

    2 體外腸道細胞模型

    腸道是一個復(fù)雜的系統(tǒng),存在著許多細胞間相互作用和微生物群,腸道細胞模型應(yīng)盡可能考慮這些因素。常見的體外腸道模型包括二維細胞培養(yǎng)與三維模型。二維培養(yǎng)是指在平面或Transwell小室培養(yǎng)單細胞或多細胞的細胞模型(圖2,表1、2),常用的細胞系有Caco-2細胞、HT29細胞、T84細胞、IEC細胞等(表3)。常見的二維共培養(yǎng)是以Caco-2細胞為基礎(chǔ),并結(jié)合其他細胞系共培養(yǎng)以向細胞模型添加特定功能,如黏液分泌和免疫反應(yīng)。三維培養(yǎng)的細胞在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)中或特定的器材中培養(yǎng),它的目的是提供一種細胞微環(huán)境,從而使模型更加接近組織的生理和動態(tài)特性。

    表1 Transwell小室常見的滲透膜種類Table 1 Common types of permeable membranes used in Transwell chambers

    表2 腸道吸收模型常見的細胞種類Table 2 Common cell types used in intestinal absorption models

    表3 常見的腸道細胞及其特征Table 3 Common intestinal cells and their characteristics

    圖2 常見的腸道細胞模型Fig.2 Common intestinal cell models

    2.1 腸道吸收的單培養(yǎng)細胞模型

    2.1.1 Caco-2細胞

    Caco-2細胞系是Fogh等首次從人結(jié)腸腺癌中分離出來的細胞系,最初被運用于藥物的篩選及耐藥機制的研究[9],是目前應(yīng)用最為廣泛的體外藥物分子腸道吸收細胞模型[10],其結(jié)構(gòu)簡單、適應(yīng)性強、同源性和重現(xiàn)性較好[11]。Caco-2細胞在長達21 d的培養(yǎng)過程中能夠自發(fā)分化,因此盡管Caco-2細胞起于結(jié)腸,但它分化后表現(xiàn)出成熟腸上皮細胞的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)特征,具體表現(xiàn)為細胞單層的多種轉(zhuǎn)運體、受體和代謝酶,如細胞色素P4501A、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等。Shirai等[12]利用不同的轉(zhuǎn)運抑制劑鑒定瓊脂寡糖穿過Caco-2細胞單層的腸道轉(zhuǎn)運機制,結(jié)果表明瓊脂寡糖能以較為完整的形式以細胞旁途徑透過腸上皮。Caco-2細胞也被證明能夠通過產(chǎn)生炎癥標(biāo)志物(如細胞因子)響應(yīng)其他細胞因子(如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α和外源性刺激的反應(yīng)(如脂多糖)[13]。然而,Caco-2細胞系有一定的局限性,包括形成與培養(yǎng)時間和傳代數(shù)相關(guān)的異質(zhì)單層,這與培養(yǎng)條件、細胞系本身及傳代數(shù)是密切相關(guān)的[14]。目前,人們通過誘導(dǎo)方法獲得不同的Caco-2細胞系以降低其變異性,如Caco-2/TC7、Caco-2/15、Caco-2/AQ細胞等。TC7細胞來自Caco-2系的晚期傳代(198),通過保留其形態(tài)和功能特征使其分化速度快于親本系,它所形成的細胞單層也更均勻穩(wěn)定。

    2.1.2 HT29細胞

    HT29細胞是一種人結(jié)腸腺癌細胞[9],由于其成熟腸細胞的典型特征而越來越受到關(guān)注,其形態(tài)及黏附能力(可分泌黏液,主要由糖蛋白低聚物和相關(guān)單體組成[15])同腸上皮細胞類似,因此該細胞模型被廣泛用于研究生物利用度、腸道吸收機制或細胞毒理學(xué)[16]。Anna等[17]在HT29細胞系中探究不同濃度MgO納米顆粒的細胞毒性和遺傳毒性發(fā)現(xiàn),MgO納米顆粒在HT29細胞中無細胞毒性,不會誘導(dǎo)腸上皮細胞的凋亡。同Caco-2細胞不同,HT29細胞可以分化為杯狀細胞,這取決于細胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件,特別是葡萄糖[18-19],故而該細胞系也可用于研究腸上皮細胞分化的體外模型。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,這些細胞以非極化、未分化的單層形式生長。然而,改變培養(yǎng)條件或用不同的誘導(dǎo)劑處理會導(dǎo)致細胞分化和極化,主要表現(xiàn)為抗原的重新分配和頂端刷狀邊界膜的發(fā)展[16]。同樣地,HT29細胞可以在特定條件下被分化為不同的表型,如HT29-FU、HT29-18N2、HT29-MTX等,其中又以HT29-MTX更為穩(wěn)定,它是利用高濃度的甲氨蝶呤誘導(dǎo)分化HT29而形成的[20]。同其他表型相比,HT29-MTX可以更好地模擬腸道細胞黏液層,因此它們大部分與Caco-2吸收細胞共培養(yǎng),利用Caco-2細胞的緊密細胞結(jié)構(gòu)以創(chuàng)建一個更適合的體外腸道模型模擬腸上皮細胞。

    2.1.3 T84細胞

    T84細胞系是由Murakami等于1980年分離得到的人結(jié)腸癌細胞系,在結(jié)構(gòu)上與正常腸道細胞相似[21],其于滲透支架上培養(yǎng)時會形成微絨毛結(jié)構(gòu)和細胞緊密連接。同Caco-2細胞的自發(fā)分化不同,T84細胞只有在特定條件誘導(dǎo)下才可以分化,即在人重組轉(zhuǎn)化生長因子等誘導(dǎo)條件下[22]。目前,T84已被廣泛地用于研究細胞轉(zhuǎn)運過程及腸道炎癥的相關(guān)信號通路。Mehmood等[23]利用膽汁酸誘導(dǎo)的T84細胞研究益生菌對腸道健康的影響,通過流式細胞儀和乳酸脫氫酶活性檢測發(fā)現(xiàn),益生菌可以顯著抑制細胞凋亡和氧化應(yīng)激的效應(yīng),從而改善腸炎患者的不良性腹瀉。Cray等[24]在體外使用T84細胞模型和小鼠空腸評估阿霉素對緊密連接基因表達和蛋白質(zhì)定位的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿霉素通過改變細胞緊密連接基因的表達和其動態(tài)松弛,增加了小分子(包括細菌產(chǎn)物)通過上皮細胞的旁細胞轉(zhuǎn)運。

    2.1.4 IEC細胞

    IEC細胞系是由Quaroni等[25]首次從大鼠回腸隱窩細胞分離出來而建立的細胞株,這種細胞系具有隱窩細胞的高度分化特性,能夠分化為成熟的腸上皮細胞,形成偽單層,表現(xiàn)為微絨毛、緊密連接和類似于基底膜的無定形物質(zhì),很難在體外誘導(dǎo)其分化,但通過小鼠腸道間質(zhì)的處理可令其分化為吸收細胞、杯狀細胞、內(nèi)分泌細胞和潘氏細胞等[26]。該細胞系主要包括IEC-18、IEC-6、IEC-14細胞,其中IEC-18細胞系是最常見的腸屏障模型,主要用于研究營養(yǎng)素的吸收消化及其滲透性[27],IEC-6細胞系已被廣泛用于研究細胞中的分子和遺傳機制。López-Posadas等[28]探究了類黃酮化合物對IEC-18細胞環(huán)氧合酶2表達的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對環(huán)氧合酶2表達的影響取決于IkappaB-α磷酸化和其他信號靶點的平衡。在丙烯醛誘導(dǎo)的IEC-6細胞中,靈芝多糖可顯著降低細胞氧化應(yīng)激和細胞凋亡水平,并通過調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路降低細胞自噬水平,恢復(fù)丙烯醛抑制的TJ蛋白表達[29]。同Caco-2細胞相比,IEC細胞系能更好地揭示細胞旁途徑的轉(zhuǎn)運機制,特別是Caco-2細胞無法預(yù)測的親水性化合物,但是IEC細胞系具有極大的不穩(wěn)定性,因為其缺乏許多載體與酶類,如細胞間緊密連接發(fā)育不良和輕微極化,并呈現(xiàn)出刷狀邊界酶的低表達[30]。

    2.2 腸道吸收的共培養(yǎng)細胞模型

    通過建立不同類型細胞的共培養(yǎng)模型,使研究細胞-細胞相互作用和研究這些相互作用對生長、分化和免疫反應(yīng)的影響成為可能。目前,大多數(shù)涉及腸道細胞和免疫細胞的共培養(yǎng)模型主要是利用標(biāo)準(zhǔn)的Transwell小室,其中腸道細胞(接種于AP側(cè))與免疫細胞(接種于BL側(cè))并不直接接觸,而是使用倒置模型被接種在同一個隔間中,因此多用于研究免疫細胞向腸細胞的遷移。然而,共培養(yǎng)模型仍存在局限性,如缺乏細胞-細胞的相互作用、細胞-基質(zhì)的相互作用,但其仍然是研究腸道炎癥、食品成分與腸道相互作用的有效工具。目前應(yīng)用較多的主要是Caco-2細胞/HT29細胞和Caco-2細胞/靶細胞(肝細胞和免疫細胞)兩大類。

    2.2.1 Caco-2細胞/HT29細胞

    在Caco-2細胞和HT29細胞共培養(yǎng)的細胞模型中,由于黏液在藥物轉(zhuǎn)運中的作用,使得實驗結(jié)果可預(yù)測性更高[31]。同Caco-2細胞單層相比,Caco-2細胞與HT-29細胞共培養(yǎng)顯示出具有緊密連接的刷狀邊界膜與不規(guī)則微絨毛,此外,被動擴散化合物的滲透性更加接近于機體;相反,共培養(yǎng)模型P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表達水平較低,并且P-gps的數(shù)量與HT29細胞的比例呈反比關(guān)系。為了探究三甲基殼聚糖衍生物納米顆粒在體外和體內(nèi)腸道吸收的特性和機制,Zhao Ying等[32]在Caco-2細胞和Caco-2細胞/HT29細胞共培養(yǎng)細胞模型中研究了該納米顆粒包封三七皂苷的攝取和轉(zhuǎn)運,發(fā)現(xiàn)其可以通過降低緊密連接增強藥物的細胞旁途徑轉(zhuǎn)運,并利用腸上皮細胞的滲透性增加藥物的腸道黏附。Cai Ye等[33]首次研究了自乳化藥物遞送系統(tǒng)在大鼠黏液、黏蛋白溶液、Caco-2細胞單層和Caco-2細胞/HT29細胞共培養(yǎng)單層系統(tǒng)中遞送親脂性醛肉桂醛的能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)模型有著更高的藥物滲透性,自乳化藥物遞送系統(tǒng)的生物利用度更高。也有研究報道Raji B細胞可以在Caco-2細胞中誘導(dǎo)M細胞表型(較少的微絨毛結(jié)構(gòu)和跨細胞活性的較大提升[34]),因而Antunes等開發(fā)了一種三重共培養(yǎng)模型[35],即將Caco-2細胞和HT29細胞共培養(yǎng)后接種至Transwell的AP側(cè),Raji B細胞接種至BL側(cè)建立正向模型,同時建立反向模型,即將Transwell小室倒置,然后將Caco-2細胞與HT29細胞接種至滲透膜上,再將Raji B細胞接種至AP側(cè)進行共培養(yǎng)。結(jié)果表明三重共培養(yǎng)可用于獲得更多與生理相關(guān)的腸道體外模型,以更好地評價和預(yù)測腸道吸收機制。

    2.2.2 Caco-2細胞/靶細胞

    除了同HT29細胞共培養(yǎng)形成腸屏障模型外(黏液分泌、緊密連接蛋白、刷狀邊緣),Caco-2細胞也可以同其他細胞共培養(yǎng)用以研究食品功能成分的吸收表達,如肝細胞、免疫細胞等。這種共培養(yǎng)模型通常利用Transwell小室,將Caco-2細胞接種于Transwell小室AP側(cè),靶細胞接種于BL側(cè)進行培養(yǎng),從而達到間隔培養(yǎng)的效果。腸道免疫細胞是腸道細胞中數(shù)量第二多的細胞類型,也是最常見的共培養(yǎng)細胞之一,用于與腸道細胞系建立共培養(yǎng)模型的主要免疫細胞包括人外周血單個核細胞(PBMC)、人巨噬細胞系(THP-1)或小鼠來源的巨噬細胞系(RAW 264.7)等。已有許多研究利用Caco-2細胞與免疫細胞共培養(yǎng)研究食品天然產(chǎn)物的抗炎活性,但吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)研究相對較少。由Caco-2細胞和RAW 264.7細胞構(gòu)成的共培養(yǎng)模型曾被用于驗證糖原的免疫調(diào)節(jié)活性和樟樹籽仁乙醇提取物的腸道抗炎活性[36]。Zhang Hua等[37]利用Caco-2細胞單層和Caco-2、THP-1細胞共培養(yǎng)細胞模型探究花青素的生物利用度及抗炎作用。Laar等[38]曾利用Caco-2細胞與HepG2細胞共培養(yǎng)研究不同糖類對肝臟脂肪積累及基因表達的影響。也有實驗利用Caco-2細胞與EA.hy926融合細胞共培養(yǎng)以研究部分植物提取物的抗炎活性[39]。

    2.3 腸道吸收的三維細胞模型

    近年來,三維細胞模型的建立技術(shù)日趨成熟,它可以更真實地模擬天然組織的生理活性,通常應(yīng)用于制藥領(lǐng)域,主要是藥物篩選的相關(guān)研究。隨著生物工程技術(shù)的進步,三維細胞模型可以使用不同的平臺進行設(shè)計,如三維支架、類器官、微流體模型等。最近,Richter等[40]曾使用Caco-2細胞和2D、3D鼠類器官研究英夫利昔單抗和與潑尼松龍對腸上皮屏障的影響。將細胞進行三維共培養(yǎng)能夠更好地模擬原生環(huán)境,從而使得藥物的滲透性更加接近于機體[36]。

    2.3.1 三維支架

    利用傳統(tǒng)的細胞單層模型和細胞共培養(yǎng)模型模擬機體腸道仍然是一個挑戰(zhàn),而三維支架作為細胞增殖、分化和遷移的支持物能更好地作用于細胞[41]。三維支架是以部分生物材料與細胞一起構(gòu)建基底細胞層,用于模擬組織的結(jié)構(gòu)。這些生物材料要能夠確保營養(yǎng)成分的充分?jǐn)U散,允許細胞黏附[42],通常包括一些合成材料(聚二甲基硅氧烷)和細胞外材料(基質(zhì)膠),其中聚二甲基硅氧烷和水凝膠應(yīng)用最為廣泛。

    三維結(jié)構(gòu)的細胞模型非常接近天然腸上皮,這增加了實驗?zāi)P皖A(yù)測通過被動擴散和主動運輸攝入藥物的可能性,這無關(guān)所使用的支架材料是何種類型[43]。有研究表明,同二維Caco-2細胞模型相比,三維Caco-2細胞模型藥物滲透系數(shù)更高,藥物細胞旁途徑也顯示出更高的滲透率,這表明三維細胞結(jié)構(gòu)有著與人體更為類似的腸道屏障功能,這可以增強對腸道動力學(xué)預(yù)測的準(zhǔn)確性[44-45]。有報道表明,通過比較在水凝膠上培養(yǎng)的Caco-2細胞與2D單層培養(yǎng)的Caco-2細胞的吸收和代謝特性發(fā)現(xiàn),3D模型中的細胞表現(xiàn)出更為類似機體的蛋白表達,代謝酶和堿性磷酸酶的比活性也得到了改善,證明了該3D模型更適用于藥物的吸收轉(zhuǎn)運研究[46]。部分三維支架使用純化的膠原蛋白為基礎(chǔ),從而可以嵌入不同的細胞系,如免疫細胞等,這可以加強細胞間的相互作用。這些模型還探索成功支持Caco-2細胞和HT29-MTX細胞與顯著的基質(zhì)細胞(即成纖維細胞和免疫活性巨噬細胞)共培養(yǎng)的能力。這一設(shè)置顯示了一個三維更大的吸收表面積,降低了跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)值并促進黏性黏液層的形成。為了評估藥物吸收,Li Na等[47]用Caco-2細胞和HT29-MTX細胞接種在膠原基質(zhì)上構(gòu)建三維支架,并將THP-1細胞接種到Transwell小室BL側(cè),其滲透性更低,但低吸收率藥物的攝取量也隨之增加??傊?,這些結(jié)果表明基于三維支架的細胞模型有更加類似于腸道的天然特征和功能,也可以根據(jù)不同的實驗需求組合不同的細胞系,這在藥物篩選方面具有很大潛力[48]。

    2.3.2 類器官模型

    雖然細胞支架在許多結(jié)構(gòu)和功能方面復(fù)制了原始組織,但它們具有一些局限性,如三維組織結(jié)構(gòu)不完整、多細胞復(fù)雜性較低以及缺乏天然組織所顯示的物理力。腸道類器官是指能夠在體外生長的微型腸道模型,其可以重現(xiàn)天然腸道組織中的特征,即由微絨毛結(jié)構(gòu)與隱窩組成的高度折疊的上皮結(jié)構(gòu)[49]。類器官來源于從胚胎或成熟隱窩中分離出來的腸道干細胞(intestinal stem cells,ISC)的增殖。在特定的細胞培養(yǎng)條件下,ISC增殖并形成球狀(100~700 μm),促進其分化為腸上皮、間充質(zhì)和管腔樣結(jié)構(gòu)[50],由于其來源稀少,且管腔形態(tài)封閉,導(dǎo)致成本高、操作難,目前用于食物成分吸收和利用的研究為數(shù)不多,主要用于研究腸道微生物群與臨床醫(yī)學(xué)等。Lee等[51]從小鼠小腸中分離出來ISC嵌入基質(zhì)膠中加入生長因子進行培養(yǎng),觀察到ISC特定標(biāo)志物的表達和類器官的連續(xù)生長。

    此外,由于類器官的形狀隨培養(yǎng)時間和環(huán)境的變化而變化,因此很難維持穩(wěn)定狀態(tài)[52],特定的結(jié)構(gòu)也限制了其用于研究許多關(guān)鍵腸道功能(如腸屏障模型的吸收轉(zhuǎn)運)。但目前已有研究提出了解決方法,如顯微注射技術(shù)用于檢測食品成分的吸收轉(zhuǎn)運[53],或通過機械作用破環(huán)其三維結(jié)構(gòu)[54]。

    2.3.3 微流體模型

    三維流體動力學(xué)體外模型是很有前景的工具,其克服了影響靜態(tài)培養(yǎng)的限制,對腸道復(fù)雜的生理學(xué)重現(xiàn)性較好,再現(xiàn)了類似體內(nèi)的動態(tài)微環(huán)境,同時具有較高的模擬速率和均一性[55],但由于其體積的限制和模型標(biāo)準(zhǔn)不同其數(shù)據(jù)仍無法共享。微流體模型被定義為微型細胞培養(yǎng)平臺,旨在模擬人體組織/器官[56]。這項先進技術(shù)通過按需控制生物物理和生化因素,概括了復(fù)雜的宿主微環(huán)境的許多特征,從而實現(xiàn)關(guān)鍵生物過程和疾病狀態(tài)的重現(xiàn)。為了探究納米藥物對胃腸黏膜的黏附和滲透性,Elberskirch等[57]開發(fā)了一種基于HT29-MTX-E12細胞的新型方法產(chǎn)生具有微絨毛和表面黏液層的腫瘤球狀體,其將3D腫瘤球體與微流控芯片系統(tǒng)相結(jié)合以模擬腸道內(nèi)的動態(tài)環(huán)境。

    生物芯片是一種微流體裝置,其目的是在有限的區(qū)域內(nèi)盡可能地使模型接近目標(biāo)模擬組織。Volpe等[45]在微流控裝置中集成了一個模擬人類腸絨毛的膠原蛋白支架培養(yǎng)Caco-2細胞,這促進了腸上皮屏障的形成及細胞色素P4503A4活性的高表達[58]。器官芯片技術(shù)也已被用于開發(fā)人類結(jié)腸的體外模型[59]。Tsamandouras等[60]通過在由原代肝細胞和Kupffer細胞組成的肝臟微陣列上共培養(yǎng)分化的Caco-2細胞和HT29-MTX細胞單層,建立了一個腸-肝微流控模型系統(tǒng)。

    2.3.4 三維共培養(yǎng)模型

    隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,細胞的培養(yǎng)模式已經(jīng)從傳統(tǒng)的單一培養(yǎng)和Transwell小室上的二維共培養(yǎng)轉(zhuǎn)變到細胞外基質(zhì)支持的三維共培養(yǎng)。三維支架的靜態(tài)培養(yǎng)和微流體結(jié)構(gòu)的動態(tài)培養(yǎng)模型已被廣泛應(yīng)用于研究功能食品成分的吸收轉(zhuǎn)運、抗氧化、抗炎及其免疫調(diào)節(jié)的影響[45]。Susewind等[61]利用膠原蛋白支架將THP-1細胞和人類樹突狀細胞(MUTZ-3)及Caco-2細胞共培養(yǎng)形成一種三維腸道模型用于測定炎癥環(huán)境中納米材料的安全性。Darling等[62]構(gòu)建成纖維細胞和Caco-2細胞的三維共培養(yǎng)細胞模型,發(fā)現(xiàn)成纖維細胞可以產(chǎn)生細胞外源性基質(zhì)為Caco-2細胞提供上皮支持,使得側(cè)膜及TEER值更接近于人體腸道以更好地研究藥物的滲透性。

    3 腸道吸收模型在花青素中的應(yīng)用

    3.1 花青素的結(jié)構(gòu)與功能

    花青素是一類廣泛存在于彩色植物中的藍紅色水溶性黃酮類化合物,是一種天然色素,自然狀態(tài)下的花青素以糖苷形式存在,稱為花色苷。自然條件下花青素很少游離存在,而是常與糖類通過糖苷鍵形成花色苷?;ㄇ嗨胤肿又杏懈叨确肿庸曹楏w系,含酸性與堿性基團,花青素易溶于水、乙醇、甲醇、稀堿與稀酸等極性溶劑[63]?;ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗衰老、抗炎、抗菌、保護視力等生理功能,還可以緩解心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、胃腸道疾病等。隨著pH值的變化,花青素的顏色會從紅色變?yōu)椴煌念伾?,如紫色、橙色、無色和藍色[64]。自然界已知的花青素有20多種,以天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?;ㄉ睾湾\葵色素最為常見(圖3),其中矢車菊色素是自然界中分布最廣泛的花青素?;ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性取決于其結(jié)構(gòu)中b環(huán)、羥基或甲氧基的存在,它被認(rèn)為是有用的功能性食品成分,并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),自然界中常見的花青素結(jié)構(gòu)如表4所示。然而,花青素在機體的生物利用度較低。絕大多數(shù)實驗表明,以花青素作為膳食補充劑,在機體中僅有很少的代謝產(chǎn)物在血漿和尿液中以微量水平被檢測到[65]。

    表4 圖3結(jié)構(gòu)的花青素種類Table 4 Types of anthocyanins with structure shown in Fig.3

    圖3 6 種常見花青素的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of six common anthocyanins

    3.2 花青素在腸道的代謝與吸收轉(zhuǎn)運

    腸道是花青素主要的吸收代謝部位,其生物利用度受到許多因素的影響,如花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、花青素與食物基質(zhì)的相互作用、其他膳食化合物的存在以及個體的遺傳學(xué)和生理學(xué)特性。

    3.2.1 花青素在腸道中的代謝

    在腸上皮細胞、肝臟和腎臟中,被機體吸收的花青素被單獨的代謝酶代謝為葡萄糖醛酸酯、硫酸鹽和甲基化代謝產(chǎn)物[66]。腸道微生物參與花青素代謝、維生素合成和碳水化合物分解代謝,同時伴隨著酶的作用,如α-L-鼠李糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶?;ㄇ嗨卦谀c道降解主要經(jīng)過兩個階段的反應(yīng),第一階段包括花青素的氧化、還原和水解。擬桿菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌等腸道菌群可以產(chǎn)生多種酶,特別是β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶和α-鼠李糖苷酶等微生物酶類能夠使糖苷鍵裂解和花青素雜環(huán)分解并釋放花青素苷元。然而這些糖苷元在結(jié)腸中不穩(wěn)定,并被快速降解為酚類化合物等,其中主要包括分別由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、硫轉(zhuǎn)移酶和鄰苯二酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化的葡萄糖醛酸化、硫酸化和甲基化,此即花青素降解的第二階段[67]。在花青素的降解過程中,通常伴隨著腸道微生物群的作用,如擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬等,天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素、錦葵色素的主要降解產(chǎn)物分別為沒食子酸、香草酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸[68]?;ㄇ嗨亟到猱a(chǎn)生的其他代謝物包括鄰苯二酚、鄰苯三酚、間苯二酚、酪醇、3-(3′-羥基苯基)丙酸、二氫咖啡酸和3-(4′-羥基苯基)乳酸等[69]。

    3.2.2 花青素在腸道的吸收轉(zhuǎn)運

    花青素在人體內(nèi)的生物利用度是指其通過血液進入機體的含量,也就是通常所說的花青素在機體內(nèi)的吸收、代謝、生物轉(zhuǎn)化和排泄,但花青素的生物利用度較低,只有5%~10%的攝入量被機體吸收[70]。普遍認(rèn)為腸道菌群不僅可以提高膳食酚類物質(zhì)的生物利用度,也可以增強其抗氧化等生物活性[71]?;ㄇ嗨厥芤嬗诮Y(jié)腸微生物群的降解,這有助于提高花青素的生物利用度,并可能直接提高其抗氧化活性[72]、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶以降低血壓水平、促進糖脂代謝、降低血脂水平和抑制炎癥反應(yīng)[73]。

    在評估花青素在人體的生物利用度時,花青素的吸收轉(zhuǎn)運是一個很重要的部分。過去的研究表明花青素在腸道的轉(zhuǎn)運方式主要是被動擴散和主動外排,其中鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(sodium-glucose cotransporter 1,SGLT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucose transporter type 2,GLUT2)是主要的轉(zhuǎn)運載體。Herrera-Balandrano等[74]通過模擬體外消化和Caco-2細胞單層模型探究兔眼藍莓花青素提取物的吸收率和穩(wěn)定性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔眼藍莓花青素的吸收以主動運輸為主,而且較低濃度的錦葵色素有著更高的吸收轉(zhuǎn)運效率,這可能是因為錦葵色素有更強的疏水性,且較高濃度的花青素會使轉(zhuǎn)運蛋白飽和并降低其轉(zhuǎn)運效率。Zou Tangbin等[75]利用根皮苷(SGLT1的抑制劑)、根皮素(GLUT2的抑制劑)和Caco-2細胞探究SGLT1和GLUT2在矢車菊素吸收中的作用,結(jié)果表明,根皮苷和根皮素顯著抑制了矢車菊素的吸收,這說明SGLT1和GLUT2可能是矢車菊素生物利用度的限制步驟。此外,通過納米載體對花青素進行包封,可以提高其生物利用度和吸收轉(zhuǎn)運率。Xu Xiankang等[76]通過制備遞送二十二碳六烯酸和花青素的新型脂質(zhì)體,并結(jié)合Caco-2細胞模型與體外消化法評估了這些脂質(zhì)體的消化和吸收情況,發(fā)現(xiàn)磷脂和膽鹽的存在使花青素和二十二碳六烯酸相互作用形成膠束。因此,它們的轉(zhuǎn)運途徑從依賴轉(zhuǎn)運蛋白的被動擴散轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,這說明經(jīng)脂質(zhì)體包封顯著改善了花青素的滲透性和吸收率。

    花青素在腸道中的吸收和代謝總結(jié)見圖4。

    圖4 花青素在腸道中的吸收和代謝Fig.4 Absorption and metabolism of anthocyanins in the intestine

    3.3 腸道吸收細胞模型在花青素中的應(yīng)用

    目前已應(yīng)用于花青素腸道吸收研究的體外細胞模型主要包括Caco-2單層細胞模型和Caco-2/靶細胞共培養(yǎng)模型兩種,見表5。

    表5 體外腸道吸收細胞模型在花青素中的應(yīng)用Table 5 Application of in vitro intestinal absorption cell models to anthocyanins

    3.3.1 Caco-2單層細胞模型在花青素中的應(yīng)用

    Caco-2單層細胞模型是研究花青素吸收最常用的細胞模型。Xu Yang等[77]利用SD大鼠和Caco-2單層細胞模型探究花青素的生物利用度和吸收轉(zhuǎn)運,結(jié)果表明天竺葵素-3-O-蕓香糖苷的生物利用度是天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的3 倍,這說明花青素的生物利用度與花青素分子間糖苷鍵的種類有關(guān),被動擴散和主動外排參與了花青素的吸收。Cahyana等[78]通過Caco-2細胞模型探究影響花青素在細胞內(nèi)攝取的因素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)花青素的攝取呈濃度依賴性,并受其結(jié)構(gòu)、環(huán)境pH值及葡萄糖的影響,而且隨著pH值的降低,花青素的攝取率反而升高,其中有葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的參與。此外,由于花青素存在不穩(wěn)定性,其在加工儲存中發(fā)生的氧化、聚合等反應(yīng)可能會對花青素在細胞中的吸收轉(zhuǎn)運存在一定的影響。通過Caco-2單層細胞模型運輸不同結(jié)構(gòu)的花青素的吸收轉(zhuǎn)運,Liu Yang等[79]發(fā)現(xiàn)單一的糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的攝取率高于多種混合糖苷標(biāo)準(zhǔn)品,同時花青素的攝取呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性,而且SGLT1和GLUT2在其中起著關(guān)鍵作用且SGLT1的影響更顯著。同樣地,Pacheco-Palencia等[80]通過對巴西莓果實中的單體花青素和聚合花青素進行細胞轉(zhuǎn)運發(fā)現(xiàn),聚合花青素的存在反而使得單體花青素在細胞中的轉(zhuǎn)運量降低了40%左右。

    3.3.2 共培養(yǎng)細胞模型在花青素中的應(yīng)用

    基于Caco-2細胞的共培養(yǎng)模型能更為準(zhǔn)確地重建腸道結(jié)構(gòu)和微環(huán)境,已被應(yīng)用于研究花青素等功能活性物質(zhì)的吸收利用。Zhang Hua等[37]通過構(gòu)建Caco-2細胞單層模型和Caco-2、THP-1共培養(yǎng)細胞模型探究紫胡蘿卜和馬鈴薯中的花青素的生物利用度和抗炎作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)花青素在Caco-2細胞單層的吸收主要是通過主動轉(zhuǎn)運機制進行的,而紫薯花青素比胡蘿卜花青素有著更高的轉(zhuǎn)運效率。Yang Mengyu等[81]通過構(gòu)建Caco-2細胞和RAW246.7細胞共培養(yǎng)炎癥細胞模型探究矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-O-glucoside,C3G)及C3G納米脂質(zhì)體的吸收轉(zhuǎn)運及抗炎機制,發(fā)現(xiàn)C3G和C3G納米脂質(zhì)體的攝取主要是基于載體蛋白(網(wǎng)格蛋白)介導(dǎo)的巨胞飲作用和內(nèi)吞作用,而且通過脂質(zhì)體包埋C3G可以提高其在細胞中的攝取率,這說明脂質(zhì)體可以在一定程度提高C3G的生物利用度。

    3.3.3 三維模型在花青素中的應(yīng)用

    目前腸道三維細胞模型在花青素上的應(yīng)用較少,特別是有關(guān)花青素吸收轉(zhuǎn)運的研究。有個別研究利用其他三維細胞模型探究花青素的生物活性。Osvaldt等[82]評估了花青素納米粒子在2D和3D成纖維細胞中的吸收活性和吸收狀況,結(jié)果表明兩種細胞模型均顯示花青素的吸收與時間呈正相關(guān),此外納米藥物也降低了三維細胞中花青素的細胞毒性,這說明藥物的納米化是提高其穩(wěn)定性的一個有益選擇。Wang Junkang等[83]利用3D Caco-2球體探究了花青素與TiO2納米顆粒的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者作用后攝入率同Caco-2球體中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的表達呈反比。此外,也有部分研究利用三維細胞模型探究類黃酮的生物活性。Hu Die等[84]分別利用二維和三維的Colon26細胞和HepG2細胞研究槲皮素納米藥物的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素在三維細胞中顯示出最高的轉(zhuǎn)染效率,其細胞活性增加。相似地,有研究通過比較分析槲皮素在HT29細胞和3D人腸組織及健康志愿者腸II期的代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),HT29細胞是產(chǎn)生II期代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵細胞,但利用3D腸組織更能預(yù)測黃酮類化合物在機體的腸道II期代謝狀況[85]。

    4 結(jié)語

    腸道細胞模型在評估食品功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著重要的作用。盡管體外模型已日趨成熟,但模擬復(fù)雜的腸道微生態(tài)仍存在著許多局限。從簡單的細胞單層模型到細胞共培養(yǎng)模型再到三維模型,這都說明在體外的腸道模型作為一種模擬機體腸道的工具極為重要。同二維細胞模型相比,三維模型能更為準(zhǔn)確地表達細胞形態(tài)與細胞生物學(xué)功能之間的關(guān)系,同時對內(nèi)源性和外源性刺激(如溫度、pH值、營養(yǎng)吸收、遷移、分化等變化)的反應(yīng)更接近于體內(nèi)反應(yīng)。此外,腸道菌群也參與食品功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運,因此構(gòu)建腸道菌群與腸道上皮相互作用的功能性腸道模型亦是研究功能活性成分吸收轉(zhuǎn)運的新趨勢。

    作為一種膳食類黃酮,花青素在維持機體功能和疾病預(yù)防等方面都起著重要的作用。然而,目前應(yīng)用于研究花青素吸收轉(zhuǎn)運的體外腸道模型較少,主要是Caco-2單層細胞模型,但以Caco-2細胞單層研究腸道和功能活性成分或藥物之間的相互作用,這存在著一定的局限性。體外腸道細胞模型應(yīng)更加接近于腸道結(jié)構(gòu)及腸道微生態(tài)環(huán)境,這將對研究功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運及其機制更有參考意義。

    猜你喜歡
    利用模型
    一半模型
    利用min{a,b}的積分表示解決一類絕對值不等式
    利用倒推破難點
    重要模型『一線三等角』
    利用一半進行移多補少
    重尾非線性自回歸模型自加權(quán)M-估計的漸近分布
    利用數(shù)的分解來思考
    Roommate is necessary when far away from home
    利用
    3D打印中的模型分割與打包
    少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲图色成人| 国产成人av激情在线播放 | 国产精品无大码| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产在视频线精品| 91久久精品国产一区二区三区| 只有这里有精品99| 97超碰精品成人国产| 最近的中文字幕免费完整| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品一区二区免费观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中国三级夫妇交换| 极品人妻少妇av视频| 777米奇影视久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 各种免费的搞黄视频| 日韩一本色道免费dvd| 欧美变态另类bdsm刘玥| 九九在线视频观看精品| 日韩成人伦理影院| 免费大片黄手机在线观看| 精品酒店卫生间| 国产一区有黄有色的免费视频| 有码 亚洲区| 亚洲国产色片| 欧美97在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 97在线人人人人妻| 亚洲精品一区蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花| av不卡在线播放| 五月玫瑰六月丁香| 成人亚洲精品一区在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 日韩三级伦理在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 青春草视频在线免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩大片免费观看网站| 91国产中文字幕| 男女啪啪激烈高潮av片| 交换朋友夫妻互换小说| 国产免费福利视频在线观看| 成人漫画全彩无遮挡| av.在线天堂| 国产成人freesex在线| 国产不卡av网站在线观看| 国产成人aa在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 各种免费的搞黄视频| 一区在线观看完整版| 久久99蜜桃精品久久| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 一级a做视频免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 日韩成人伦理影院| 亚洲av不卡在线观看| 美女内射精品一级片tv| 一边亲一边摸免费视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产免费视频播放在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 熟女电影av网| 在线观看免费视频网站a站| 婷婷色综合www| 久久久久视频综合| 免费高清在线观看视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 黄色一级大片看看| .国产精品久久| 亚洲人成77777在线视频| www.av在线官网国产| 亚洲无线观看免费| 国产成人精品福利久久| 伦理电影大哥的女人| 国产精品人妻久久久久久| 嘟嘟电影网在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜激情久久久久久久| 免费观看a级毛片全部| 永久免费av网站大全| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 日韩 亚洲 欧美在线| 久久97久久精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 午夜福利视频精品| 热re99久久国产66热| 最近中文字幕高清免费大全6| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲av福利一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 最近最新中文字幕免费大全7| 色婷婷av一区二区三区视频| 丝袜喷水一区| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 欧美人与善性xxx| 51国产日韩欧美| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久久久网色| 女人精品久久久久毛片| 女人久久www免费人成看片| 免费大片黄手机在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 男女啪啪激烈高潮av片| 少妇丰满av| 亚洲精品色激情综合| 久久 成人 亚洲| 丝袜脚勾引网站| 亚洲图色成人| 高清视频免费观看一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 欧美日韩视频精品一区| 国产免费福利视频在线观看| 最近手机中文字幕大全| 美女内射精品一级片tv| 大片免费播放器 马上看| 青青草视频在线视频观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 搡老乐熟女国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲欧洲国产日韩| 日本wwww免费看| 日韩中字成人| 99热国产这里只有精品6| 国产成人91sexporn| 日韩精品有码人妻一区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久国产一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 免费大片18禁| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久精品久久精品一区二区三区| av天堂久久9| 国产成人91sexporn| 色吧在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片 | 22中文网久久字幕| 久久99一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美丝袜亚洲另类| 久久人人爽人人片av| 亚洲国产精品成人久久小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 有码 亚洲区| 777米奇影视久久| 99热网站在线观看| 少妇人妻 视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人精品在线电影| 成人免费观看视频高清| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 青春草视频在线免费观看| 国产乱人偷精品视频| 飞空精品影院首页| 亚洲成人一二三区av| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品久久久久久精品古装| 久久久久久人妻| 免费黄频网站在线观看国产| 青春草视频在线免费观看| 久热这里只有精品99| 亚洲无线观看免费| av有码第一页| 国产免费福利视频在线观看| 超色免费av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 高清黄色对白视频在线免费看| 老司机影院毛片| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲性久久影院| 日本免费在线观看一区| 国产精品99久久久久久久久| 日韩强制内射视频| av天堂久久9| 男男h啪啪无遮挡| 春色校园在线视频观看| 欧美丝袜亚洲另类| 一区二区三区精品91| 亚洲av欧美aⅴ国产| av播播在线观看一区| 亚洲国产日韩一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 三级国产精品欧美在线观看| 日本av免费视频播放| 高清av免费在线| 国产精品一区二区在线不卡| 久久影院123| 亚洲,一卡二卡三卡| 国内精品宾馆在线| 99热全是精品| 亚洲不卡免费看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 妹子高潮喷水视频| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕久久专区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 免费观看的影片在线观看| 99久久综合免费| 国产免费一级a男人的天堂| 欧美日韩综合久久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 久久99精品国语久久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黑人高潮一二区| 日本vs欧美在线观看视频| 在线天堂最新版资源| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲精品乱久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产在线免费精品| 国产一区二区在线观看日韩| 国产av国产精品国产| 欧美3d第一页| 亚洲精品一二三| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产精品久久久久成人av| 中文字幕免费在线视频6| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产成人一精品久久久| 精品视频人人做人人爽| 91精品伊人久久大香线蕉| 水蜜桃什么品种好| 久热这里只有精品99| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品午夜福利在线看| 久久午夜福利片| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美精品国产亚洲| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩伦理黄色片| 97在线视频观看| 欧美精品亚洲一区二区| 在线观看一区二区三区激情| 国产av精品麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| av线在线观看网站| 九九在线视频观看精品| 亚洲精品乱久久久久久| 色婷婷av一区二区三区视频| 黑人高潮一二区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 在线观看国产h片| 国产精品免费大片| 一级片'在线观看视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲综合色惰| 黑人高潮一二区| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美精品国产亚洲| 午夜久久久在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久久精品性色| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩中字成人| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 午夜福利影视在线免费观看| 一区二区三区四区激情视频| 老司机亚洲免费影院| 国产老妇伦熟女老妇高清| 乱人伦中国视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 男的添女的下面高潮视频| 视频区图区小说| 亚洲情色 制服丝袜| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品久久久久久久久免| 秋霞伦理黄片| av.在线天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 狂野欧美激情性bbbbbb| av线在线观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 中文天堂在线官网| 精品久久蜜臀av无| videossex国产| 妹子高潮喷水视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 色网站视频免费| 国产精品国产三级专区第一集| 99久久中文字幕三级久久日本| av在线播放精品| 亚洲av免费高清在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲久久久国产精品| 大话2 男鬼变身卡| 少妇丰满av| 欧美另类一区| 午夜91福利影院| 超碰97精品在线观看| 日韩视频在线欧美| 九草在线视频观看| 伊人亚洲综合成人网| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲av综合色区一区| 尾随美女入室| 夫妻性生交免费视频一级片| 午夜福利,免费看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 免费观看的影片在线观看| 久久这里有精品视频免费| 久久99一区二区三区| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 99热6这里只有精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久ye,这里只有精品| 久久久久久久精品精品| 欧美性感艳星| 成年av动漫网址| 久久久久国产网址| 一区在线观看完整版| 免费av中文字幕在线| 一级,二级,三级黄色视频| 国产成人91sexporn| 校园人妻丝袜中文字幕| 人妻系列 视频| 国产免费又黄又爽又色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| freevideosex欧美| 久久97久久精品| 99热全是精品| 精品少妇黑人巨大在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| av黄色大香蕉| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美bdsm另类| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 老司机亚洲免费影院| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲精品456在线播放app| 麻豆成人av视频| 欧美日韩在线观看h| 校园人妻丝袜中文字幕| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲国产精品999| 精品人妻偷拍中文字幕| 青青草视频在线视频观看| 三上悠亚av全集在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 22中文网久久字幕| 男女高潮啪啪啪动态图| 妹子高潮喷水视频| 亚洲,欧美,日韩| 日日撸夜夜添| 在线免费观看不下载黄p国产| 一本一本综合久久| 亚洲国产精品999| 99热网站在线观看| 99热全是精品| av有码第一页| 亚洲精品乱久久久久久| 成人无遮挡网站| 嘟嘟电影网在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| av.在线天堂| 日韩制服骚丝袜av| 女性被躁到高潮视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人aa在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 国产有黄有色有爽视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲四区av| 中文字幕亚洲精品专区| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久久久久久久久大奶| 考比视频在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 精品亚洲成国产av| 老司机影院毛片| 人人妻人人澡人人看| 天美传媒精品一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 秋霞伦理黄片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久久久视频综合| 插阴视频在线观看视频| 欧美成人午夜免费资源| 免费看光身美女| 国产 一区精品| 免费观看性生交大片5| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜免费观看性视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久av不卡| 飞空精品影院首页| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 国国产精品蜜臀av免费| a级毛片黄视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 在线天堂最新版资源| 国产精品欧美亚洲77777| 黄色怎么调成土黄色| 最近的中文字幕免费完整| 另类亚洲欧美激情| 国产黄色免费在线视频| av天堂久久9| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久午夜欧美精品| 国产片内射在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久影院123| 青春草国产在线视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲欧美日韩卡通动漫| av线在线观看网站| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品色激情综合| 久久久久网色| 午夜免费观看性视频| 国产黄色免费在线视频| 18禁在线播放成人免费| 嘟嘟电影网在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 全区人妻精品视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 9色porny在线观看| 久久久久国产精品人妻一区二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 极品人妻少妇av视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产精品久久久久久精品古装| 久久鲁丝午夜福利片| 精品久久久久久电影网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久亚洲国产成人精品v| 日本色播在线视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 男女免费视频国产| 国产黄片视频在线免费观看| 精品视频人人做人人爽| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久国内精品自在自线图片| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 一区在线观看完整版| 曰老女人黄片| 日本免费在线观看一区| 欧美国产精品一级二级三级| 成年人午夜在线观看视频| 国产淫语在线视频| 街头女战士在线观看网站| 丰满少妇做爰视频| 国产在视频线精品| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 欧美日韩在线观看h| 国产免费视频播放在线视频| av黄色大香蕉| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本av手机在线免费观看| 国产深夜福利视频在线观看| 91久久精品电影网| 天堂8中文在线网| av在线老鸭窝| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩欧美一区视频在线观看| 成人手机av| 91精品伊人久久大香线蕉| 久久狼人影院| 街头女战士在线观看网站| 国模一区二区三区四区视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 人妻少妇偷人精品九色| 色94色欧美一区二区| 青青草视频在线视频观看| 精品久久久噜噜| 亚洲天堂av无毛| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人精品福利久久| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久久久av不卡| 国产日韩欧美在线精品| 制服诱惑二区| 曰老女人黄片| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲国产精品一区三区| 精品人妻在线不人妻| 我的女老师完整版在线观看| 久热久热在线精品观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲国产最新在线播放| 欧美激情国产日韩精品一区| 777米奇影视久久| 18禁观看日本| 日韩一本色道免费dvd| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产精品999| 国产男人的电影天堂91| 久久精品国产a三级三级三级| 国产一区二区三区av在线| 在现免费观看毛片| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 精品人妻在线不人妻| 草草在线视频免费看| 晚上一个人看的免费电影| 男女啪啪激烈高潮av片| 丰满少妇做爰视频| 女人久久www免费人成看片| 国产精品一区二区在线不卡| 一个人免费看片子| 精品久久久久久电影网| 欧美3d第一页| 国产黄色免费在线视频| av女优亚洲男人天堂| 男女免费视频国产| 女性被躁到高潮视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费av不卡在线播放| 精品久久国产蜜桃| 午夜影院在线不卡| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品99久久99久久久不卡 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 中文天堂在线官网| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久久久成人| 2018国产大陆天天弄谢| 精品亚洲成a人片在线观看| 观看av在线不卡| a级毛色黄片| 日韩一本色道免费dvd| 最近的中文字幕免费完整| 22中文网久久字幕| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品 国内视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲久久久国产精品| 校园人妻丝袜中文字幕| 日本黄色日本黄色录像| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费高清在线观看日韩| 成人无遮挡网站| 波野结衣二区三区在线| 久久婷婷青草| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文字幕免费在线视频6| 久久人妻熟女aⅴ| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | av在线播放精品| 午夜福利视频在线观看免费| 国产极品天堂在线| 国产免费视频播放在线视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 老司机影院成人| 亚洲人成网站在线播| 久久久精品免费免费高清| 看非洲黑人一级黄片| 老司机影院成人| videosex国产| 国精品久久久久久国模美| 色5月婷婷丁香| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 18禁观看日本| 欧美精品一区二区大全| 青春草国产在线视频| 成人黄色视频免费在线看| a级毛片黄视频| 久久国产精品大桥未久av| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲在久久综合|