體外腸道細(xì)胞模型及其在評(píng)價(jià)花青素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的研究進(jìn)展

鐘 浩，徐 潔，陳 玲，劉曉鳳，關(guān)榮發(fā),*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.海南省食品藥品檢驗(yàn)所三亞分所，海南 三亞 572011）

花青素是一種膳食類黃酮，被廣泛應(yīng)用于食品藥品中。花青素在胃腸道會(huì)被降解，同時(shí)受pH值、糖苷鍵結(jié)構(gòu)、消化酶、腸道微生物群等因素的影響[1-2]?；ㄇ嗨氐纳锢枚仁瞧浒l(fā)揮功能活性的基礎(chǔ)，即花青素通過消化道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)后進(jìn)入血液的含量，但花青素不穩(wěn)定且易被降解，這使得花青素的生物可及性和生物利用度非常有限。數(shù)十年來已有諸多研究通過體內(nèi)體外模型探究功能活性成分在腸道的吸收利用，雖然動(dòng)物模型可以模擬整個(gè)生物體的生理機(jī)能，但體內(nèi)模型往往由于物種之間的差異而導(dǎo)致反應(yīng)的變化不同，以及難以將結(jié)果外推到人類身上。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)模型已廣泛應(yīng)用于食品和藥學(xué)領(lǐng)域的生物利用度和毒理學(xué)研究[3-4]。因此利用模擬體外胃腸道消化和腸道細(xì)胞模型能夠較好地模擬人體對(duì)花青素的吸收利用。目前，細(xì)胞模型廣泛應(yīng)用于不同食品生物活性物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究，基于此背景，本文綜述了二維和三維腸道細(xì)胞培養(yǎng)模型的研究進(jìn)展，并探討了其在花青素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)研究中的應(yīng)用。

1 腸上皮的結(jié)構(gòu)與功能

腸道微環(huán)境主要由腸道微生物群與其生活的微環(huán)境構(gòu)成，其中包括腸上皮細(xì)胞與覆蓋上皮細(xì)胞的若干黏膜屏障，如含有抗菌分子的黏液層。腸上皮主要由杯狀細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、增殖細(xì)胞、腸干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞等組成[5]（圖1）。腸內(nèi)分泌細(xì)胞可以釋放肽激素，這與組織修復(fù)、血管生成、腸細(xì)胞分化和極化有關(guān)[6]。杯狀細(xì)胞可產(chǎn)生黏液，作為抵御有害物質(zhì)或微生物感染的保護(hù)層[7]。同樣地，位于隱窩基部的腸干細(xì)胞也可以分化為其他腸細(xì)胞，從而維持腸道的完整性[8]。腸上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生黏膜屏障，以隔離腸道微生物群及腸道免疫細(xì)胞，維持腸道穩(wěn)態(tài)。黏膜屏障主要包括化學(xué)屏障和物理屏障。化學(xué)屏障由AMP和Reg3系列蛋白組成，這些蛋白受到腸道內(nèi)部環(huán)境和免疫細(xì)胞細(xì)胞因子調(diào)節(jié)；物理屏障則主要包括覆蓋腸黏膜的黏液層、腸吸收細(xì)胞微絨毛上的糖萼和腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接。

圖1 腸上皮細(xì)胞圖Fig.1 Schematic of intestinal epithelial cells

2 體外腸道細(xì)胞模型

腸道是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，存在著許多細(xì)胞間相互作用和微生物群，腸道細(xì)胞模型應(yīng)盡可能考慮這些因素。常見的體外腸道模型包括二維細(xì)胞培養(yǎng)與三維模型。二維培養(yǎng)是指在平面或Transwell小室培養(yǎng)單細(xì)胞或多細(xì)胞的細(xì)胞模型（圖2，表1、2），常用的細(xì)胞系有Caco-2細(xì)胞、HT29細(xì)胞、T84細(xì)胞、IEC細(xì)胞等（表3）。常見的二維共培養(yǎng)是以Caco-2細(xì)胞為基礎(chǔ)，并結(jié)合其他細(xì)胞系共培養(yǎng)以向細(xì)胞模型添加特定功能，如黏液分泌和免疫反應(yīng)。三維培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中或特定的器材中培養(yǎng)，它的目的是提供一種細(xì)胞微環(huán)境，從而使模型更加接近組織的生理和動(dòng)態(tài)特性。

表1 Transwell小室常見的滲透膜種類Table 1 Common types of permeable membranes used in Transwell chambers

表2 腸道吸收模型常見的細(xì)胞種類Table 2 Common cell types used in intestinal absorption models

表3 常見的腸道細(xì)胞及其特征Table 3 Common intestinal cells and their characteristics

圖2 常見的腸道細(xì)胞模型Fig.2 Common intestinal cell models

2.1 腸道吸收的單培養(yǎng)細(xì)胞模型

2.1.1 Caco-2細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞系是Fogh等首次從人結(jié)腸腺癌中分離出來的細(xì)胞系，最初被運(yùn)用于藥物的篩選及耐藥機(jī)制的研究[9]，是目前應(yīng)用最為廣泛的體外藥物分子腸道吸收細(xì)胞模型[10]，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適應(yīng)性強(qiáng)、同源性和重現(xiàn)性較好[11]。Caco-2細(xì)胞在長(zhǎng)達(dá)21 d的培養(yǎng)過程中能夠自發(fā)分化，因此盡管Caco-2細(xì)胞起于結(jié)腸，但它分化后表現(xiàn)出成熟腸上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和功能學(xué)特征，具體表現(xiàn)為細(xì)胞單層的多種轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體和代謝酶，如細(xì)胞色素P4501A、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等。Shirai等[12]利用不同的轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑鑒定瓊脂寡糖穿過Caco-2細(xì)胞單層的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，結(jié)果表明瓊脂寡糖能以較為完整的形式以細(xì)胞旁途徑透過腸上皮。Caco-2細(xì)胞也被證明能夠通過產(chǎn)生炎癥標(biāo)志物（如細(xì)胞因子）響應(yīng)其他細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α和外源性刺激的反應(yīng)（如脂多糖）[13]。然而，Caco-2細(xì)胞系有一定的局限性，包括形成與培養(yǎng)時(shí)間和傳代數(shù)相關(guān)的異質(zhì)單層，這與培養(yǎng)條件、細(xì)胞系本身及傳代數(shù)是密切相關(guān)的[14]。目前，人們通過誘導(dǎo)方法獲得不同的Caco-2細(xì)胞系以降低其變異性，如Caco-2/TC7、Caco-2/15、Caco-2/AQ細(xì)胞等。TC7細(xì)胞來自Caco-2系的晚期傳代（198），通過保留其形態(tài)和功能特征使其分化速度快于親本系，它所形成的細(xì)胞單層也更均勻穩(wěn)定。

2.1.2 HT29細(xì)胞

HT29細(xì)胞是一種人結(jié)腸腺癌細(xì)胞[9]，由于其成熟腸細(xì)胞的典型特征而越來越受到關(guān)注，其形態(tài)及黏附能力（可分泌黏液，主要由糖蛋白低聚物和相關(guān)單體組成[15]）同腸上皮細(xì)胞類似，因此該細(xì)胞模型被廣泛用于研究生物利用度、腸道吸收機(jī)制或細(xì)胞毒理學(xué)[16]。Anna等[17]在HT29細(xì)胞系中探究不同濃度MgO納米顆粒的細(xì)胞毒性和遺傳毒性發(fā)現(xiàn)，MgO納米顆粒在HT29細(xì)胞中無細(xì)胞毒性，不會(huì)誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的凋亡。同Caco-2細(xì)胞不同，HT29細(xì)胞可以分化為杯狀細(xì)胞，這取決于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件，特別是葡萄糖[18-19]，故而該細(xì)胞系也可用于研究腸上皮細(xì)胞分化的體外模型。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞以非極化、未分化的單層形式生長(zhǎng)。然而，改變培養(yǎng)條件或用不同的誘導(dǎo)劑處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化和極化，主要表現(xiàn)為抗原的重新分配和頂端刷狀邊界膜的發(fā)展[16]。同樣地，HT29細(xì)胞可以在特定條件下被分化為不同的表型，如HT29-FU、HT29-18N2、HT29-MTX等，其中又以HT29-MTX更為穩(wěn)定，它是利用高濃度的甲氨蝶呤誘導(dǎo)分化HT29而形成的[20]。同其他表型相比，HT29-MTX可以更好地模擬腸道細(xì)胞黏液層，因此它們大部分與Caco-2吸收細(xì)胞共培養(yǎng)，利用Caco-2細(xì)胞的緊密細(xì)胞結(jié)構(gòu)以創(chuàng)建一個(gè)更適合的體外腸道模型模擬腸上皮細(xì)胞。

2.1.3 T84細(xì)胞

T84細(xì)胞系是由Murakami等于1980年分離得到的人結(jié)腸癌細(xì)胞系，在結(jié)構(gòu)上與正常腸道細(xì)胞相似[21]，其于滲透支架上培養(yǎng)時(shí)會(huì)形成微絨毛結(jié)構(gòu)和細(xì)胞緊密連接。同Caco-2細(xì)胞的自發(fā)分化不同，T84細(xì)胞只有在特定條件誘導(dǎo)下才可以分化，即在人重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)條件下[22]。目前，T84已被廣泛地用于研究細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程及腸道炎癥的相關(guān)信號(hào)通路。Mehmood等[23]利用膽汁酸誘導(dǎo)的T84細(xì)胞研究益生菌對(duì)腸道健康的影響，通過流式細(xì)胞儀和乳酸脫氫酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，益生菌可以顯著抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的效應(yīng)，從而改善腸炎患者的不良性腹瀉。Cray等[24]在體外使用T84細(xì)胞模型和小鼠空腸評(píng)估阿霉素對(duì)緊密連接基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿霉素通過改變細(xì)胞緊密連接基因的表達(dá)和其動(dòng)態(tài)松弛，增加了小分子（包括細(xì)菌產(chǎn)物）通過上皮細(xì)胞的旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.1.4 IEC細(xì)胞

IEC細(xì)胞系是由Quaroni等[25]首次從大鼠回腸隱窩細(xì)胞分離出來而建立的細(xì)胞株，這種細(xì)胞系具有隱窩細(xì)胞的高度分化特性，能夠分化為成熟的腸上皮細(xì)胞，形成偽單層，表現(xiàn)為微絨毛、緊密連接和類似于基底膜的無定形物質(zhì)，很難在體外誘導(dǎo)其分化，但通過小鼠腸道間質(zhì)的處理可令其分化為吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和潘氏細(xì)胞等[26]。該細(xì)胞系主要包括IEC-18、IEC-6、IEC-14細(xì)胞，其中IEC-18細(xì)胞系是最常見的腸屏障模型，主要用于研究營養(yǎng)素的吸收消化及其滲透性[27]，IEC-6細(xì)胞系已被廣泛用于研究細(xì)胞中的分子和遺傳機(jī)制。López-Posadas等[28]探究了類黃酮化合物對(duì)IEC-18細(xì)胞環(huán)氧合酶2表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物對(duì)環(huán)氧合酶2表達(dá)的影響取決于IkappaB-α磷酸化和其他信號(hào)靶點(diǎn)的平衡。在丙烯醛誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中，靈芝多糖可顯著降低細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡水平，并通過調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路降低細(xì)胞自噬水平，恢復(fù)丙烯醛抑制的TJ蛋白表達(dá)[29]。同Caco-2細(xì)胞相比，IEC細(xì)胞系能更好地揭示細(xì)胞旁途徑的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，特別是Caco-2細(xì)胞無法預(yù)測(cè)的親水性化合物，但是IEC細(xì)胞系具有極大的不穩(wěn)定性，因?yàn)槠淙狈υS多載體與酶類，如細(xì)胞間緊密連接發(fā)育不良和輕微極化，并呈現(xiàn)出刷狀邊界酶的低表達(dá)[30]。

2.2 腸道吸收的共培養(yǎng)細(xì)胞模型

通過建立不同類型細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，使研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和研究這些相互作用對(duì)生長(zhǎng)、分化和免疫反應(yīng)的影響成為可能。目前，大多數(shù)涉及腸道細(xì)胞和免疫細(xì)胞的共培養(yǎng)模型主要是利用標(biāo)準(zhǔn)的Transwell小室，其中腸道細(xì)胞（接種于AP側(cè)）與免疫細(xì)胞（接種于BL側(cè)）并不直接接觸，而是使用倒置模型被接種在同一個(gè)隔間中，因此多用于研究免疫細(xì)胞向腸細(xì)胞的遷移。然而，共培養(yǎng)模型仍存在局限性，如缺乏細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用、細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用，但其仍然是研究腸道炎癥、食品成分與腸道相互作用的有效工具。目前應(yīng)用較多的主要是Caco-2細(xì)胞/HT29細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞/靶細(xì)胞（肝細(xì)胞和免疫細(xì)胞）兩大類。

2.2.1 Caco-2細(xì)胞/HT29細(xì)胞

在Caco-2細(xì)胞和HT29細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞模型中，由于黏液在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果可預(yù)測(cè)性更高[31]。同Caco-2細(xì)胞單層相比，Caco-2細(xì)胞與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)顯示出具有緊密連接的刷狀邊界膜與不規(guī)則微絨毛，此外，被動(dòng)擴(kuò)散化合物的滲透性更加接近于機(jī)體；相反，共培養(yǎng)模型P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表達(dá)水平較低，并且P-gps的數(shù)量與HT29細(xì)胞的比例呈反比關(guān)系。為了探究三甲基殼聚糖衍生物納米顆粒在體外和體內(nèi)腸道吸收的特性和機(jī)制，Zhao Ying等[32]在Caco-2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞/HT29細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型中研究了該納米顆粒包封三七皂苷的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)其可以通過降低緊密連接增強(qiáng)藥物的細(xì)胞旁途徑轉(zhuǎn)運(yùn)，并利用腸上皮細(xì)胞的滲透性增加藥物的腸道黏附。Cai Ye等[33]首次研究了自乳化藥物遞送系統(tǒng)在大鼠黏液、黏蛋白溶液、Caco-2細(xì)胞單層和Caco-2細(xì)胞/HT29細(xì)胞共培養(yǎng)單層系統(tǒng)中遞送親脂性醛肉桂醛的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)模型有著更高的藥物滲透性，自乳化藥物遞送系統(tǒng)的生物利用度更高。也有研究報(bào)道Raji B細(xì)胞可以在Caco-2細(xì)胞中誘導(dǎo)M細(xì)胞表型（較少的微絨毛結(jié)構(gòu)和跨細(xì)胞活性的較大提升[34]），因而Antunes等開發(fā)了一種三重共培養(yǎng)模型[35]，即將Caco-2細(xì)胞和HT29細(xì)胞共培養(yǎng)后接種至Transwell的AP側(cè)，Raji B細(xì)胞接種至BL側(cè)建立正向模型，同時(shí)建立反向模型，即將Transwell小室倒置，然后將Caco-2細(xì)胞與HT29細(xì)胞接種至滲透膜上，再將Raji B細(xì)胞接種至AP側(cè)進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果表明三重共培養(yǎng)可用于獲得更多與生理相關(guān)的腸道體外模型，以更好地評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)腸道吸收機(jī)制。

2.2.2 Caco-2細(xì)胞/靶細(xì)胞

除了同HT29細(xì)胞共培養(yǎng)形成腸屏障模型外（黏液分泌、緊密連接蛋白、刷狀邊緣），Caco-2細(xì)胞也可以同其他細(xì)胞共培養(yǎng)用以研究食品功能成分的吸收表達(dá)，如肝細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。這種共培養(yǎng)模型通常利用Transwell小室，將Caco-2細(xì)胞接種于Transwell小室AP側(cè)，靶細(xì)胞接種于BL側(cè)進(jìn)行培養(yǎng)，從而達(dá)到間隔培養(yǎng)的效果。腸道免疫細(xì)胞是腸道細(xì)胞中數(shù)量第二多的細(xì)胞類型，也是最常見的共培養(yǎng)細(xì)胞之一，用于與腸道細(xì)胞系建立共培養(yǎng)模型的主要免疫細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、人巨噬細(xì)胞系（THP-1）或小鼠來源的巨噬細(xì)胞系（RAW 264.7）等。已有許多研究利用Caco-2細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)研究食品天然產(chǎn)物的抗炎活性，但吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)研究相對(duì)較少。由Caco-2細(xì)胞和RAW 264.7細(xì)胞構(gòu)成的共培養(yǎng)模型曾被用于驗(yàn)證糖原的免疫調(diào)節(jié)活性和樟樹籽仁乙醇提取物的腸道抗炎活性[36]。Zhang Hua等[37]利用Caco-2細(xì)胞單層和Caco-2、THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)細(xì)胞模型探究花青素的生物利用度及抗炎作用。Laar等[38]曾利用Caco-2細(xì)胞與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)研究不同糖類對(duì)肝臟脂肪積累及基因表達(dá)的影響。也有實(shí)驗(yàn)利用Caco-2細(xì)胞與EA.hy926融合細(xì)胞共培養(yǎng)以研究部分植物提取物的抗炎活性[39]。

2.3 腸道吸收的三維細(xì)胞模型

近年來，三維細(xì)胞模型的建立技術(shù)日趨成熟，它可以更真實(shí)地模擬天然組織的生理活性，通常應(yīng)用于制藥領(lǐng)域，主要是藥物篩選的相關(guān)研究。隨著生物工程技術(shù)的進(jìn)步，三維細(xì)胞模型可以使用不同的平臺(tái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，如三維支架、類器官、微流體模型等。最近，Richter等[40]曾使用Caco-2細(xì)胞和2D、3D鼠類器官研究英夫利昔單抗和與潑尼松龍對(duì)腸上皮屏障的影響。將細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)能夠更好地模擬原生環(huán)境，從而使得藥物的滲透性更加接近于機(jī)體[36]。

2.3.1 三維支架

利用傳統(tǒng)的細(xì)胞單層模型和細(xì)胞共培養(yǎng)模型模擬機(jī)體腸道仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，而三維支架作為細(xì)胞增殖、分化和遷移的支持物能更好地作用于細(xì)胞[41]。三維支架是以部分生物材料與細(xì)胞一起構(gòu)建基底細(xì)胞層，用于模擬組織的結(jié)構(gòu)。這些生物材料要能夠確保營養(yǎng)成分的充分?jǐn)U散，允許細(xì)胞黏附[42]，通常包括一些合成材料（聚二甲基硅氧烷）和細(xì)胞外材料（基質(zhì)膠），其中聚二甲基硅氧烷和水凝膠應(yīng)用最為廣泛。

三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞模型非常接近天然腸上皮，這增加了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)通過被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸攝入藥物的可能性，這無關(guān)所使用的支架材料是何種類型[43]。有研究表明，同二維Caco-2細(xì)胞模型相比，三維Caco-2細(xì)胞模型藥物滲透系數(shù)更高，藥物細(xì)胞旁途徑也顯示出更高的滲透率，這表明三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)有著與人體更為類似的腸道屏障功能，這可以增強(qiáng)對(duì)腸道動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[44-45]。有報(bào)道表明，通過比較在水凝膠上培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞與2D單層培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞的吸收和代謝特性發(fā)現(xiàn)，3D模型中的細(xì)胞表現(xiàn)出更為類似機(jī)體的蛋白表達(dá)，代謝酶和堿性磷酸酶的比活性也得到了改善，證明了該3D模型更適用于藥物的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究[46]。部分三維支架使用純化的膠原蛋白為基礎(chǔ)，從而可以嵌入不同的細(xì)胞系，如免疫細(xì)胞等，這可以加強(qiáng)細(xì)胞間的相互作用。這些模型還探索成功支持Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞與顯著的基質(zhì)細(xì)胞（即成纖維細(xì)胞和免疫活性巨噬細(xì)胞）共培養(yǎng)的能力。這一設(shè)置顯示了一個(gè)三維更大的吸收表面積，降低了跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）值并促進(jìn)黏性黏液層的形成。為了評(píng)估藥物吸收，Li Na等[47]用Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞接種在膠原基質(zhì)上構(gòu)建三維支架，并將THP-1細(xì)胞接種到Transwell小室BL側(cè)，其滲透性更低，但低吸收率藥物的攝取量也隨之增加。總之，這些結(jié)果表明基于三維支架的細(xì)胞模型有更加類似于腸道的天然特征和功能，也可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求組合不同的細(xì)胞系，這在藥物篩選方面具有很大潛力[48]。

2.3.2 類器官模型

雖然細(xì)胞支架在許多結(jié)構(gòu)和功能方面復(fù)制了原始組織，但它們具有一些局限性，如三維組織結(jié)構(gòu)不完整、多細(xì)胞復(fù)雜性較低以及缺乏天然組織所顯示的物理力。腸道類器官是指能夠在體外生長(zhǎng)的微型腸道模型，其可以重現(xiàn)天然腸道組織中的特征，即由微絨毛結(jié)構(gòu)與隱窩組成的高度折疊的上皮結(jié)構(gòu)[49]。類器官來源于從胚胎或成熟隱窩中分離出來的腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISC）的增殖。在特定的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，ISC增殖并形成球狀（100～700 μm），促進(jìn)其分化為腸上皮、間充質(zhì)和管腔樣結(jié)構(gòu)[50]，由于其來源稀少，且管腔形態(tài)封閉，導(dǎo)致成本高、操作難，目前用于食物成分吸收和利用的研究為數(shù)不多，主要用于研究腸道微生物群與臨床醫(yī)學(xué)等。Lee等[51]從小鼠小腸中分離出來ISC嵌入基質(zhì)膠中加入生長(zhǎng)因子進(jìn)行培養(yǎng)，觀察到ISC特定標(biāo)志物的表達(dá)和類器官的連續(xù)生長(zhǎng)。

此外，由于類器官的形狀隨培養(yǎng)時(shí)間和環(huán)境的變化而變化，因此很難維持穩(wěn)定狀態(tài)[52]，特定的結(jié)構(gòu)也限制了其用于研究許多關(guān)鍵腸道功能（如腸屏障模型的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)）。但目前已有研究提出了解決方法，如顯微注射技術(shù)用于檢測(cè)食品成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[53]，或通過機(jī)械作用破環(huán)其三維結(jié)構(gòu)[54]。

2.3.3 微流體模型

三維流體動(dòng)力學(xué)體外模型是很有前景的工具，其克服了影響靜態(tài)培養(yǎng)的限制，對(duì)腸道復(fù)雜的生理學(xué)重現(xiàn)性較好，再現(xiàn)了類似體內(nèi)的動(dòng)態(tài)微環(huán)境，同時(shí)具有較高的模擬速率和均一性[55]，但由于其體積的限制和模型標(biāo)準(zhǔn)不同其數(shù)據(jù)仍無法共享。微流體模型被定義為微型細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，旨在模擬人體組織/器官[56]。這項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)通過按需控制生物物理和生化因素，概括了復(fù)雜的宿主微環(huán)境的許多特征，從而實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵生物過程和疾病狀態(tài)的重現(xiàn)。為了探究納米藥物對(duì)胃腸黏膜的黏附和滲透性，Elberskirch等[57]開發(fā)了一種基于HT29-MTX-E12細(xì)胞的新型方法產(chǎn)生具有微絨毛和表面黏液層的腫瘤球狀體，其將3D腫瘤球體與微流控芯片系統(tǒng)相結(jié)合以模擬腸道內(nèi)的動(dòng)態(tài)環(huán)境。

生物芯片是一種微流體裝置，其目的是在有限的區(qū)域內(nèi)盡可能地使模型接近目標(biāo)模擬組織。Volpe等[45]在微流控裝置中集成了一個(gè)模擬人類腸絨毛的膠原蛋白支架培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞，這促進(jìn)了腸上皮屏障的形成及細(xì)胞色素P4503A4活性的高表達(dá)[58]。器官芯片技術(shù)也已被用于開發(fā)人類結(jié)腸的體外模型[59]。Tsamandouras等[60]通過在由原代肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞組成的肝臟微陣列上共培養(yǎng)分化的Caco-2細(xì)胞和HT29-MTX細(xì)胞單層，建立了一個(gè)腸-肝微流控模型系統(tǒng)。

2.3.4 三維共培養(yǎng)模型

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞的培養(yǎng)模式已經(jīng)從傳統(tǒng)的單一培養(yǎng)和Transwell小室上的二維共培養(yǎng)轉(zhuǎn)變到細(xì)胞外基質(zhì)支持的三維共培養(yǎng)。三維支架的靜態(tài)培養(yǎng)和微流體結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)模型已被廣泛應(yīng)用于研究功能食品成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、抗炎及其免疫調(diào)節(jié)的影響[45]。Susewind等[61]利用膠原蛋白支架將THP-1細(xì)胞和人類樹突狀細(xì)胞（MUTZ-3）及Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)形成一種三維腸道模型用于測(cè)定炎癥環(huán)境中納米材料的安全性。Darling等[62]構(gòu)建成纖維細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞的三維共培養(yǎng)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞外源性基質(zhì)為Caco-2細(xì)胞提供上皮支持，使得側(cè)膜及TEER值更接近于人體腸道以更好地研究藥物的滲透性。

3 腸道吸收模型在花青素中的應(yīng)用

3.1 花青素的結(jié)構(gòu)與功能

花青素是一類廣泛存在于彩色植物中的藍(lán)紅色水溶性黃酮類化合物，是一種天然色素，自然狀態(tài)下的花青素以糖苷形式存在，稱為花色苷。自然條件下花青素很少游離存在，而是常與糖類通過糖苷鍵形成花色苷?；ㄇ嗨胤肿又杏懈叨确肿庸曹楏w系，含酸性與堿性基團(tuán)，花青素易溶于水、乙醇、甲醇、稀堿與稀酸等極性溶劑[63]?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗衰老、抗炎、抗菌、保護(hù)視力等生理功能，還可以緩解心腦血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、胃腸道疾病等。隨著pH值的變化，花青素的顏色會(huì)從紅色變?yōu)椴煌念伾?，如紫色、橙色、無色和藍(lán)色[64]。自然界已知的花青素有20多種，以天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素最為常見（圖3），其中矢車菊色素是自然界中分布最廣泛的花青素?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性取決于其結(jié)構(gòu)中b環(huán)、羥基或甲氧基的存在，它被認(rèn)為是有用的功能性食品成分，并被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，自然界中常見的花青素結(jié)構(gòu)如表4所示。然而，花青素在機(jī)體的生物利用度較低。絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，以花青素作為膳食補(bǔ)充劑，在機(jī)體中僅有很少的代謝產(chǎn)物在血漿和尿液中以微量水平被檢測(cè)到[65]。

表4 圖3結(jié)構(gòu)的花青素種類Table 4 Types of anthocyanins with structure shown in Fig.3

圖3 6 種常見花青素的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of six common anthocyanins

3.2 花青素在腸道的代謝與吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

腸道是花青素主要的吸收代謝部位，其生物利用度受到許多因素的影響，如花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)、花青素與食物基質(zhì)的相互作用、其他膳食化合物的存在以及個(gè)體的遺傳學(xué)和生理學(xué)特性。

3.2.1 花青素在腸道中的代謝

在腸上皮細(xì)胞、肝臟和腎臟中，被機(jī)體吸收的花青素被單獨(dú)的代謝酶代謝為葡萄糖醛酸酯、硫酸鹽和甲基化代謝產(chǎn)物[66]。腸道微生物參與花青素代謝、維生素合成和碳水化合物分解代謝，同時(shí)伴隨著酶的作用，如α-L-鼠李糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸酶。花青素在腸道降解主要經(jīng)過兩個(gè)階段的反應(yīng)，第一階段包括花青素的氧化、還原和水解。擬桿菌、腸球菌、梭狀芽孢桿菌等腸道菌群可以產(chǎn)生多種酶，特別是β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶和α-鼠李糖苷酶等微生物酶類能夠使糖苷鍵裂解和花青素雜環(huán)分解并釋放花青素苷元。然而這些糖苷元在結(jié)腸中不穩(wěn)定，并被快速降解為酚類化合物等，其中主要包括分別由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、硫轉(zhuǎn)移酶和鄰苯二酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化的葡萄糖醛酸化、硫酸化和甲基化，此即花青素降解的第二階段[67]。在花青素的降解過程中，通常伴隨著腸道微生物群的作用，如擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬等，天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ?、錦葵色素的主要降解產(chǎn)物分別為沒食子酸、香草酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸[68]?；ㄇ嗨亟到猱a(chǎn)生的其他代謝物包括鄰苯二酚、鄰苯三酚、間苯二酚、酪醇、3-(3′-羥基苯基)丙酸、二氫咖啡酸和3-(4′-羥基苯基)乳酸等[69]。

3.2.2 花青素在腸道的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

花青素在人體內(nèi)的生物利用度是指其通過血液進(jìn)入機(jī)體的含量，也就是通常所說的花青素在機(jī)體內(nèi)的吸收、代謝、生物轉(zhuǎn)化和排泄，但花青素的生物利用度較低，只有5%～10%的攝入量被機(jī)體吸收[70]。普遍認(rèn)為腸道菌群不僅可以提高膳食酚類物質(zhì)的生物利用度，也可以增強(qiáng)其抗氧化等生物活性[71]。花青素受益于結(jié)腸微生物群的降解，這有助于提高花青素的生物利用度，并可能直接提高其抗氧化活性[72]、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶以降低血壓水平、促進(jìn)糖脂代謝、降低血脂水平和抑制炎癥反應(yīng)[73]。

在評(píng)估花青素在人體的生物利用度時(shí)，花青素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)很重要的部分。過去的研究表明花青素在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)方式主要是被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)外排，其中鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（sodium-glucose cotransporter 1，SGLT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（glucose transporter type 2，GLUT2）是主要的轉(zhuǎn)運(yùn)載體。Herrera-Balandrano等[74]通過模擬體外消化和Caco-2細(xì)胞單層模型探究兔眼藍(lán)莓花青素提取物的吸收率和穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔眼藍(lán)莓花青素的吸收以主動(dòng)運(yùn)輸為主，而且較低濃度的錦葵色素有著更高的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)效率，這可能是因?yàn)殄\葵色素有更強(qiáng)的疏水性，且較高濃度的花青素會(huì)使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白飽和并降低其轉(zhuǎn)運(yùn)效率。Zou Tangbin等[75]利用根皮苷（SGLT1的抑制劑）、根皮素（GLUT2的抑制劑）和Caco-2細(xì)胞探究SGLT1和GLUT2在矢車菊素吸收中的作用，結(jié)果表明，根皮苷和根皮素顯著抑制了矢車菊素的吸收，這說明SGLT1和GLUT2可能是矢車菊素生物利用度的限制步驟。此外，通過納米載體對(duì)花青素進(jìn)行包封，可以提高其生物利用度和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)率。Xu Xiankang等[76]通過制備遞送二十二碳六烯酸和花青素的新型脂質(zhì)體，并結(jié)合Caco-2細(xì)胞模型與體外消化法評(píng)估了這些脂質(zhì)體的消化和吸收情況，發(fā)現(xiàn)磷脂和膽鹽的存在使花青素和二十二碳六烯酸相互作用形成膠束。因此，它們的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑從依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的被動(dòng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)變?yōu)榫W(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，這說明經(jīng)脂質(zhì)體包封顯著改善了花青素的滲透性和吸收率。

花青素在腸道中的吸收和代謝總結(jié)見圖4。

圖4 花青素在腸道中的吸收和代謝Fig.4 Absorption and metabolism of anthocyanins in the intestine

3.3 腸道吸收細(xì)胞模型在花青素中的應(yīng)用

目前已應(yīng)用于花青素腸道吸收研究的體外細(xì)胞模型主要包括Caco-2單層細(xì)胞模型和Caco-2/靶細(xì)胞共培養(yǎng)模型兩種，見表5。

表5 體外腸道吸收細(xì)胞模型在花青素中的應(yīng)用Table 5 Application of in vitro intestinal absorption cell models to anthocyanins

3.3.1 Caco-2單層細(xì)胞模型在花青素中的應(yīng)用

Caco-2單層細(xì)胞模型是研究花青素吸收最常用的細(xì)胞模型。Xu Yang等[77]利用SD大鼠和Caco-2單層細(xì)胞模型探究花青素的生物利用度和吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明天竺葵素-3-O-蕓香糖苷的生物利用度是天竺葵素-3-O-葡萄糖苷的3 倍，這說明花青素的生物利用度與花青素分子間糖苷鍵的種類有關(guān)，被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)外排參與了花青素的吸收。Cahyana等[78]通過Caco-2細(xì)胞模型探究影響花青素在細(xì)胞內(nèi)攝取的因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花青素的攝取呈濃度依賴性，并受其結(jié)構(gòu)、環(huán)境pH值及葡萄糖的影響，而且隨著pH值的降低，花青素的攝取率反而升高，其中有葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的參與。此外，由于花青素存在不穩(wěn)定性，其在加工儲(chǔ)存中發(fā)生的氧化、聚合等反應(yīng)可能會(huì)對(duì)花青素在細(xì)胞中的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)存在一定的影響。通過Caco-2單層細(xì)胞模型運(yùn)輸不同結(jié)構(gòu)的花青素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，Liu Yang等[79]發(fā)現(xiàn)單一的糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的攝取率高于多種混合糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)花青素的攝取呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性，而且SGLT1和GLUT2在其中起著關(guān)鍵作用且SGLT1的影響更顯著。同樣地，Pacheco-Palencia等[80]通過對(duì)巴西莓果實(shí)中的單體花青素和聚合花青素進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)現(xiàn)，聚合花青素的存在反而使得單體花青素在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)量降低了40%左右。

3.3.2 共培養(yǎng)細(xì)胞模型在花青素中的應(yīng)用

基于Caco-2細(xì)胞的共培養(yǎng)模型能更為準(zhǔn)確地重建腸道結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，已被應(yīng)用于研究花青素等功能活性物質(zhì)的吸收利用。Zhang Hua等[37]通過構(gòu)建Caco-2細(xì)胞單層模型和Caco-2、THP-1共培養(yǎng)細(xì)胞模型探究紫胡蘿卜和馬鈴薯中的花青素的生物利用度和抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花青素在Caco-2細(xì)胞單層的吸收主要是通過主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行的，而紫薯花青素比胡蘿卜花青素有著更高的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。Yang Mengyu等[81]通過構(gòu)建Caco-2細(xì)胞和RAW246.7細(xì)胞共培養(yǎng)炎癥細(xì)胞模型探究矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，C3G）及C3G納米脂質(zhì)體的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及抗炎機(jī)制，發(fā)現(xiàn)C3G和C3G納米脂質(zhì)體的攝取主要是基于載體蛋白（網(wǎng)格蛋白）介導(dǎo)的巨胞飲作用和內(nèi)吞作用，而且通過脂質(zhì)體包埋C3G可以提高其在細(xì)胞中的攝取率，這說明脂質(zhì)體可以在一定程度提高C3G的生物利用度。

3.3.3 三維模型在花青素中的應(yīng)用

目前腸道三維細(xì)胞模型在花青素上的應(yīng)用較少，特別是有關(guān)花青素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。有個(gè)別研究利用其他三維細(xì)胞模型探究花青素的生物活性。Osvaldt等[82]評(píng)估了花青素納米粒子在2D和3D成纖維細(xì)胞中的吸收活性和吸收狀況，結(jié)果表明兩種細(xì)胞模型均顯示花青素的吸收與時(shí)間呈正相關(guān)，此外納米藥物也降低了三維細(xì)胞中花青素的細(xì)胞毒性，這說明藥物的納米化是提高其穩(wěn)定性的一個(gè)有益選擇。Wang Junkang等[83]利用3D Caco-2球體探究了花青素與TiO2納米顆粒的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者作用后攝入率同Caco-2球體中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)呈反比。此外，也有部分研究利用三維細(xì)胞模型探究類黃酮的生物活性。Hu Die等[84]分別利用二維和三維的Colon26細(xì)胞和HepG2細(xì)胞研究槲皮素納米藥物的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素在三維細(xì)胞中顯示出最高的轉(zhuǎn)染效率，其細(xì)胞活性增加。相似地，有研究通過比較分析槲皮素在HT29細(xì)胞和3D人腸組織及健康志愿者腸II期的代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，HT29細(xì)胞是產(chǎn)生II期代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵細(xì)胞，但利用3D腸組織更能預(yù)測(cè)黃酮類化合物在機(jī)體的腸道II期代謝狀況[85]。

4 結(jié)語

腸道細(xì)胞模型在評(píng)估食品功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮著重要的作用。盡管體外模型已日趨成熟，但模擬復(fù)雜的腸道微生態(tài)仍存在著許多局限。從簡(jiǎn)單的細(xì)胞單層模型到細(xì)胞共培養(yǎng)模型再到三維模型，這都說明在體外的腸道模型作為一種模擬機(jī)體腸道的工具極為重要。同二維細(xì)胞模型相比，三維模型能更為準(zhǔn)確地表達(dá)細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞生物學(xué)功能之間的關(guān)系，同時(shí)對(duì)內(nèi)源性和外源性刺激（如溫度、pH值、營養(yǎng)吸收、遷移、分化等變化）的反應(yīng)更接近于體內(nèi)反應(yīng)。此外，腸道菌群也參與食品功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，因此構(gòu)建腸道菌群與腸道上皮相互作用的功能性腸道模型亦是研究功能活性成分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的新趨勢(shì)。

作為一種膳食類黃酮，花青素在維持機(jī)體功能和疾病預(yù)防等方面都起著重要的作用。然而，目前應(yīng)用于研究花青素吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的體外腸道模型較少，主要是Caco-2單層細(xì)胞模型，但以Caco-2細(xì)胞單層研究腸道和功能活性成分或藥物之間的相互作用，這存在著一定的局限性。體外腸道細(xì)胞模型應(yīng)更加接近于腸道結(jié)構(gòu)及腸道微生態(tài)環(huán)境，這將對(duì)研究功能活性成分的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制更有參考意義。