半干態(tài)豆豉高效發(fā)酵菌株篩選及其發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

王澤亮，鄧維琴，劉書亮，李雄波，陳相杰，范智義，李 婷，李 恒,3,4，張其圣,4，李 龍

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625000；3.四川振興產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，四川 成都 611130；4.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山 620030）

豆豉是經(jīng)制曲和后發(fā)酵制得的一類發(fā)酵性豆制品，因其滋味鮮美、香氣醇厚而深受消費(fèi)者喜愛。制曲微生物作為豆豉釀造起始的關(guān)鍵微生物，其產(chǎn)生的生物酶系可將蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)分解為游離氨基酸、還原糖等小分子物質(zhì)，對(duì)豆豉后發(fā)酵生物代謝及風(fēng)味物質(zhì)形成有著直接影響[1-3]。但由于缺乏制曲專用菌株，現(xiàn)有豆豉生產(chǎn)企業(yè)大多采用滬釀3.042制曲發(fā)酵豆豉，存在著豆豉成品豉香香氣不足、風(fēng)味相對(duì)單一等弊端[4-6]，限制了豆豉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，研究人員就豆豉制曲菌株篩選已開展了部分研究，如吳梓仟等[7]通過優(yōu)勢(shì)米曲霉強(qiáng)化發(fā)酵增強(qiáng)了瀏陽(yáng)豆豉的豉香香氣強(qiáng)度，周婉婷[8]通過篩選應(yīng)用高蛋白酶活性菌株有效提升了發(fā)酵豆豉品質(zhì)，潘平平等[9]則通過多菌種制曲工藝優(yōu)化提升了成曲中性蛋白酶活，但上述研究大多集中于高酶活性菌株篩選應(yīng)用和多菌株混合制曲等方面，對(duì)具有產(chǎn)酶能力差異菌株的對(duì)比篩選研究還相對(duì)較少。研究表明，制曲菌株酶系組成對(duì)發(fā)酵食品品質(zhì)具有顯著影響[10-11]，如蛋白酶和α-淀粉酶可協(xié)同促進(jìn)發(fā)酵食品中多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成[12]，氨肽酶和羧肽酶可有效降低大豆蛋白水解產(chǎn)物的苦味并改善食品風(fēng)味[13]，通過制曲酶系篩選提高發(fā)酵原料利用率和發(fā)酵效率已成為提升發(fā)酵食品品質(zhì)的有效手段[14]。

對(duì)此，本研究在項(xiàng)目組前期高效發(fā)酵霉菌篩選的基礎(chǔ)上，以蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和α-淀粉酶等參與豆豉原料分解的主要生物酶為篩選條件，選取7 株產(chǎn)蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和α-淀粉酶能力具有明顯差異的菌株進(jìn)行制曲和發(fā)酵半干態(tài)豆豉評(píng)價(jià)，以期確定適用于半干態(tài)豆豉生產(chǎn)的高效制曲菌株及其酶系特征，進(jìn)而為豆豉生產(chǎn)菌株的篩選及應(yīng)用提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用菌株信息如表1所示。其中，米曲霉滬釀3.042為市售曲精，購(gòu)自石家莊鼎鑫釀造食品科學(xué)研究所。除滬釀3.042外，其余菌株均由四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司泡菜調(diào)味品與功能微生物研究中心篩選，并進(jìn)行菌種保藏。其中，郫釀M003為前期篩選出的高產(chǎn)蛋白酶和羧肽酶的米曲霉菌株，保藏于廣東微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為60927；24M-1和30M-1為實(shí)驗(yàn)室篩選出的高產(chǎn)蛋白酶和氨肽酶的米曲霉菌株，DM1、DM2為產(chǎn)α-淀粉酶的優(yōu)勢(shì)米曲霉菌株[15-16]；同時(shí)，考慮到毛霉型豆豉制曲工藝，本研究同時(shí)選取了一株實(shí)驗(yàn)室前期篩選的耐高溫傘狀毛霉QM3進(jìn)行對(duì)比分析。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株信息Table 1 Information about experimental strains

黃豆、面粉、麩皮 成都市購(gòu)；甲醛、氫氧化鈉、葡萄糖、正己烷、乙酸、濃硫酸、三乙胺、異硫氰酸苯酯、干酪素、福林-酚、對(duì)硝基苯胺、水合茚三酮、氯化鎘等（分析純）成都市科隆化學(xué)品有限公司；氨肽酶底物（L-亮氨酸-4-硝基苯胺）、羧肽酶底物（N-芐氧羰?；?L-苯丙氨酰-L-亮氨酸）上海源葉生物科技有限公司；乙腈、17 種游離氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity II 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；Ultimate Amino Acid色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）月旭科技（上海）股份有限公司；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津儀器公司；PHSJ-4F型pH計(jì) 梅特勒型-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；CR-10plus型色差儀 柯尼卡美能達(dá)辦公系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 麩皮曲制備

將80 g麩皮、20 g黃豆粉與80 mL水混勻，浸潤(rùn)30 min后分裝至錐形瓶，121 ℃滅菌30 min，自然冷卻至室溫，將7 株菌株分別接種至麩皮培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.2 不同菌株豆豉曲制備及豆豉發(fā)酵

黃豆預(yù)處理：挑選質(zhì)優(yōu)無雜質(zhì)的黃豆清洗，溫水浸泡2 h，放至滅菌鍋110 ℃高壓蒸煮5 min，取出自然冷卻至室溫。

制曲：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3‰（以黃豆質(zhì)量計(jì)，下同）的麩皮曲和1%面粉混勻后加至黃豆中拌勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

豆豉發(fā)酵：向豆豉曲中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的鹽，拌勻后于40 ℃恒溫培養(yǎng)60 d，取樣分析。

1.3.3 豆豉曲酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力測(cè)定：豆豉曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶測(cè)定參考GB 1886.174—2016 《食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》[17]方法進(jìn)行測(cè)定；α-淀粉酶活力測(cè)定：參考徐歡歡[18]方法進(jìn)行；氨肽酶活力測(cè)定：參考Bai Xuejuan等[19]的方法略作修改后測(cè)定；羧肽酶活力測(cè)定：參考Fu Jing等[20]粗酶液中羧肽酶活力的測(cè)定方法略作修改后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定

總酸、氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定參考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》[21]方法進(jìn)行；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定；pH值采用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.3.5 色澤值測(cè)定

將豆豉樣品粉碎放至培養(yǎng)皿鋪平后使用色差儀測(cè)定L*（亮度）、a*（紅綠度）、b*（藍(lán)黃度），選取不同位置測(cè)定5 次后取平均值。

1.3.6 游離氨基酸含量的測(cè)定

豆豉中游離氨基酸含量的測(cè)定使用實(shí)驗(yàn)室前期建立方法測(cè)定[22]，具體步驟：準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品于50 mL離心管中，加入9 mL蒸餾水，渦旋儀混勻，超聲提取30 min（40 ℃、功率100%），然后以8000 r/min離心5 min，取上清液為待測(cè)樣品。取100 μL待測(cè)樣品置于5 mL離心管中，加入200 μL衍生試劑，渦旋混合20 s后放置60 min。反應(yīng)完成后加入2 mL水和1 mL正己烷，渦旋混合1 min，靜置10 min，除去上層有機(jī)層，再次加入1 mL正己烷，渦旋混合1 min，靜置10 min，除去上層有機(jī)層，下層水層過0.22 μm水系過濾膜后進(jìn)高效液相色譜儀分析。

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

參考實(shí)驗(yàn)室前期[23]方法略作修改后進(jìn)行鹵汁樣品中揮發(fā)性成分測(cè)定，具體步驟如下：取2 g豆豉注入固相微萃取瓶中，密封后于60 ℃平衡20 min，然后置入固相微萃取纖維，60 ℃萃取30 min。萃取完成后，將固相微萃取纖維插入氣相色譜儀氣化室中進(jìn)行分析。

色譜條件：使用色譜柱DB-WAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）進(jìn)行分析，初始溫度40 ℃，保持1 min，10 ℃/min升溫至90 ℃，保持0.5 min，2 ℃/min升溫至120 ℃，保持0.5 min，10 ℃/min升溫至140 ℃，2 ℃/min升溫至202 ℃，7.6 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：載氣高純氦氣，質(zhì)譜離子源溫度230 ℃，定性采用Q3 Scan掃描模式，掃描范圍m/z30～500，電子電離能量70 eV，檢測(cè)電壓0.1 kV。揮發(fā)性化合物的鑒定利用NIST17、FFNSC1.3譜庫(kù)檢索結(jié)果（相似度＞80%）和人工圖譜解析共同確定，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量按下式計(jì)算：

式中：A1為目的物質(zhì)的峰面積；ρ為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/μL）；V為內(nèi)標(biāo)添加的體積/μL；A2為內(nèi)標(biāo)峰面積；m為稱取樣品的質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株制曲差異

2.1.1 不同菌株制曲不同酶活力差異比較

蛋白酶是一種作用于蛋白質(zhì)多肽鏈內(nèi)部的內(nèi)肽酶，可將蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈分解為能被微生物代謝利用的短肽片段和游離氨基酸，其酶活力差異將對(duì)后續(xù)微生物代謝造成顯著影響[24-25]。本研究中，7 株菌株蛋白酶均以中性蛋白酶為主（圖1A、B），其酶活力在0～703.78 U/g之間，不同菌株中性蛋白酶活存在較大差異。其中，24M-1和30M-1中性蛋白酶活力分別為（703.78±27.81）U/g和（475.36±15.35）U/g，顯著高于其余菌株（P＜0.05），說明上述兩株菌株在蛋白質(zhì)底物利用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。圖1C和圖1D分別為氨肽酶活力和羧肽酶活力測(cè)定結(jié)果，可看出，24M-1和30M-1氨肽酶活力顯著高于其余菌株，而郫釀M003羧肽酶活力顯著高于其余菌株（P＜0.05）。氨肽酶和羧肽酶可在中性蛋白酶作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步作用于多肽末端產(chǎn)生小分子肽和游離氨基酸，進(jìn)而增加發(fā)酵食品的鮮味和甜味，并有效降低苦味[26]，這將利于豆豉良好滋味品質(zhì)的形成。

圖1 不同菌株制曲酶活力Fig.1 Koji enzyme activity of different strains

DM1、DM2、滬釀3.042 中α-淀粉酶活力在473.43～537.32 U/g之間（圖1E），顯著高于其余樣品（P＜0.05），說明上述3 株菌株對(duì)豆豉原料中淀粉等碳水化合物類物質(zhì)利用程度更高。相比于米曲霉，傘狀毛霉（QM3）制得豆豉曲中各類酶活力均相對(duì)較低，這與李嘉宇等[27]研究結(jié)果較為一致。

2.1.2 不同菌株制曲理化指標(biāo)差異

不同菌株制曲理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如圖2所示。米曲霉菌株中，24M-1、30M-1、郫釀M0033 株菌株制得豆豉曲中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基酸態(tài)氮含量分別為（0.58±0.01）%、（0.64±0.03）%、（0.76±0.00）%和（0.39±0.05）、（0.43±0.02）、（0.41±0.03）g/100 g，均顯著高于其余菌株（P＜0.05），但24M-1、30M-1菌株制得豆豉曲中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低，分別為（0.47±0.03）%和（0.44±0.01）%，同酶活力測(cè)定結(jié)果較為一致。傘狀毛霉制得豆豉曲中總酸、氨基酸態(tài)氮及還原糖水平均顯著低于米曲霉菌株，分別為（0.18±0.02）%、（0.08±0.00）g/100 g和（0.15±0.00）%。不同菌株制得豆豉曲pH值在6.70～7.22之間。

圖2 不同菌株制曲理化指標(biāo)Fig.2 Physicochemical indexes of koji prepared with different strains

為進(jìn)一步探究菌株酶系對(duì)制曲理化指標(biāo)的具體影響，本研究對(duì)制曲酶活力和理化指標(biāo)進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析（圖3）。結(jié)果表明，豆豉曲中氨基酸態(tài)氮含量同中性蛋白酶活力和氨肽酶活力呈顯著正相關(guān)，還原糖含量與α-淀粉酶活力呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）?？梢?，制曲酶系對(duì)豆豉曲中氨基酸態(tài)氮、還原糖物質(zhì)含量具有直接影響。研究表明，還原糖、氨基酸態(tài)氮等物質(zhì)含量對(duì)發(fā)酵食品中微生物多樣性及微生物群落結(jié)構(gòu)[28-31]具有顯著影響，由制曲酶系差異所造成的成曲理化指標(biāo)差異將導(dǎo)致豆豉后發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)差異的出現(xiàn)，進(jìn)而對(duì)豆豉發(fā)酵品質(zhì)造成影響。

圖3 制曲酶活和理化指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果Fig.3 Correlation analysis between enzyme activities and physicochemical indicators of koji

2.2 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉品質(zhì)差異

2.2.1 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉理化指標(biāo)差異

如圖4 所示，豆豉樣品中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.28%～1.80%之間，樣品間存在一定差異。其中，傘狀毛霉QM3 菌株制得豆豉中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（1.28±0.02）%，顯著低于其余菌株制得豆豉（P＜0.05）。微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸是發(fā)酵食品總酸的重要來源[32]，毛霉豆豉中總酸含量較低表明其后發(fā)酵過程中微生物代謝程度低于曲霉型豆豉，這可能是由于QM3制曲成曲中酶系活性較低，分解產(chǎn)生還原糖、氨基酸態(tài)氮等物質(zhì)能力相對(duì)較差（圖2），造成后期微生物增長(zhǎng)相對(duì)緩慢所導(dǎo)致的。

圖4 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉理化指標(biāo)Fig.4 Physicochemical indexes of douchi fermented with different strains

氨基酸態(tài)氮是評(píng)判豆豉品質(zhì)的重要指標(biāo)，根據(jù)GB/T 42464—2023《豆豉質(zhì)量通則》[33]對(duì)豆豉中氨基酸態(tài)氮含量的要求（≥0.3 g/100 g），本研究所制得的豆豉樣品中氨基酸態(tài)氮含量在0.45～1.06 g/100 g之間，均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。其中，24M-1、30M-1、DM2和郫釀M003中氨基酸態(tài)氮含量相比于商業(yè)曲精滬釀3.042分別提高了16.7%、15.1%、10.3%和12.2%，品質(zhì)相對(duì)較好。

淀粉等大分子糖類物質(zhì)水解所產(chǎn)生的還原糖是微生物代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，可通過乳酸菌代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等滋味物質(zhì)和醇類、醛類、酚類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，是豆豉滋味、風(fēng)味的重要來源[34]。不同菌株制得豆豉中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.03%～2.21%之間，同周旭等[1]研究結(jié)果基本一致。其中，滬釀3.042、24M-1、30 M-1 和DM1 制得豆豉中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.21±0.01）%、（1.76±0.00）%、（1.68±0.01）%和（1.85±0.01）%，顯著高于DM2、QM3和郫釀M003（P＜0.05）。還原糖除作為微生物代謝底物參與代謝外，還可和含游離氨基（游離氨基酸和蛋白質(zhì)）的化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成誘人的香味并增加食物的適口性[35]。豆豉樣品中還原糖含量的差異說明不同豆豉樣品后發(fā)酵過程中還原糖的生成及消耗存在一定差異，這將促使豆豉品質(zhì)差異的出現(xiàn)。不同菌株發(fā)酵豆豉中pH值在5.37～5.41之間。

2.2.2 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉色澤值差異

L*、a*、b*值分別代表樣品的亮度、紅綠度、黃藍(lán)度，可有效反映豆豉的色澤品質(zhì)情況。由圖5可看出，DM1、DM2、滬釀3.042和30M-1制得豆豉中L*值相對(duì)較低，說明這上述菌株制得豆豉顏色相對(duì)較深，而24M-1和QM3制得豆豉中L*相對(duì)較高，分別為34.53±0.67和34.51±2.59，顏色偏亮。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的黑色素是豆豉深黑色澤的主要來源[36]，其形成同豆豉中氨基酸態(tài)氮、還原糖含量有著直接關(guān)聯(lián)[37]，30M-1中氨基酸氮含量和滬釀3.042中還原糖含量較高可能是導(dǎo)致其L*值較低的主要原因。

圖5 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉L*、a*、b*值Fig.5 L* ,a* and b* values of douchi fermented with different strains

2.2.3 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉游離氨基酸差異

游離氨基酸是豆豉中滋味的重要來源，其含量及構(gòu)成對(duì)豆豉品質(zhì)有著重要影響。對(duì)此，本研究通過高效液相色譜法測(cè)定不同菌株制曲發(fā)酵豆豉游離氨基酸含量并分析其具體差異，結(jié)果如圖6所示。可看出，谷氨酸、門冬氨酸、精氨酸及亮氨酸是豆豉中主要的游離氨基酸，不同樣品中游離氨基酸含量及組成存在一定差異。相比于滬釀3.042（（40.65±1.63）g/kg），24M-1、30M-1、DM1、DM2和郫釀M003發(fā)酵豆豉中游離氨基酸含量均有所增加，分別為（43.73±1.38）、（42.99±2.72）、（51.22±5.37）、（51.08±1.52）g/k g和（50.21±2.51）g/kg。

圖6 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉游離氨基酸含量Fig.6 Contents of free amino acids in douchi fermented by different strains

參考魏光強(qiáng)等[38]方法，根據(jù)呈味特性將游離氨基酸分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸及無味氨基酸4 類，結(jié)果如表2所示。可看出，甜鮮味氨基酸在豆豉游離氨基酸中所占比重最大，同李浩等[39]研究結(jié)果一致。相比于滬釀3.042，菌株24M-1、30M-1、DM1、DM2和郫釀M003中鮮味氨基酸、甜味氨基酸含量均具有一定優(yōu)勢(shì)，尤其是DM1、DM2和郫釀M003中鮮味氨基酸、甜味氨基酸含量分別達(dá)到了（10.55±0.00）、（10.62±1.92）、（9.29±1.80）g/kg和（18.57±2.12）、（18.05±2.42）、（17.25±1.12）g/k g，均顯著高于商業(yè)曲精滬釀3.042（P＜0.05），說明使用DM1、DM2和郫釀M003菌株制曲發(fā)酵對(duì)豆豉甜鮮滋味具有明顯的提升作用。不過值得注意的是，除鮮味氨基酸和甜味氨基酸外，24M-1、30M-1、DM1、DM2和郫釀M003發(fā)酵豆豉中苦味氨基酸含量同樣顯著高于滬釀3.042（P＜0.05），這可能是上述菌株中性蛋白酶和羧肽酶等酶活相對(duì)較高，對(duì)黃豆中蛋白質(zhì)水解作用更徹底所導(dǎo)致的。李娜娜[40]研究表明，蛋白質(zhì)酶解底物的苦味強(qiáng)度是由苦味肽、游離氨基酸組成及多肽水解程度等多種因素所決定的，僅通過考量游離氨基酸構(gòu)成往往不能準(zhǔn)確反映酶系差異對(duì)發(fā)酵食品苦味的真實(shí)影響，后續(xù)可考慮從酶解底物、水解程度、感官等多個(gè)維度綜合評(píng)判酶系差異對(duì)豆豉苦味的影響。

表2 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉中呈味氨基酸含量Table 2 Contents of taste-active amino acids in douchi fermented by different strains

2.2.4 不同菌株豆豉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異

圖7為豆豉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定結(jié)果，此次共檢測(cè)出7 個(gè)豆豉樣品中揮發(fā)性化合物86 種（圖7A），包括醇類9 種、酯類14 種、酸類4 種、醛類12 種、酮類13 種、烷烴類5 種、酚類4 種、吡嗪類9 種、其他種類化合物15 種。其中，24M-1、30M-1、郫釀M003豆豉樣品中測(cè)得揮發(fā)性化合物種類數(shù)相對(duì)較多，分別為66、68 種和61 種，其余豆豉樣品中揮發(fā)性化合物種類數(shù)在46～53 種之間。

圖7 不同菌株制曲發(fā)酵豆豉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)（A）及含量（B）Fig.7 Types (A) and contents (B) of volatile flavor substances in douchi fermented by different strains

圖7B為豆豉樣品中不同種類揮發(fā)性化合物含量，可看出，酸類、醛類、醇類是豆豉中主要的揮發(fā)性化合物，同現(xiàn)有研究結(jié)果較為一致[41]。乳酸菌代謝葡萄糖、五碳糖等糖類物質(zhì)生成是發(fā)酵食品中酸類物質(zhì)的主要來源，葡萄萄等糖源的增加可顯著提升發(fā)酵食品中酸類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量[42]。本研究中，DM1、DM2和滬釀3.042對(duì)淀粉類物質(zhì)利用程度較高可能是導(dǎo)致其酸類物質(zhì)含量明顯高于其余樣品的主要原因。

為進(jìn)一步明確豆豉樣品中具有風(fēng)味貢獻(xiàn)作用物質(zhì)的構(gòu)成情況，本研究以氣味活性值（odor activity value，OAV）＞1為條件進(jìn)行豆豉中重要香氣化合物篩選，并對(duì)其在各豆豉樣品中的分布情況進(jìn)行具體分析，結(jié)果如圖8所示。

圖8 重要香氣化合物UpSet分析（A）及其相對(duì)含量聚類熱圖（B）Fig.8 UpSet plot of important aroma compounds (A) and cluster heatmap of their relative contents (B)

UpSet圖是一種復(fù)雜的Venn圖（圖8A），通常在組別較多時(shí)用來展示不同組之間共有和特有的元素個(gè)數(shù)[43]。圖形由3 部分組成：左側(cè)展示每個(gè)組別元素去重后總數(shù)的柱狀圖，上方展示組別獨(dú)有或共有元素個(gè)數(shù)的柱狀圖，該柱狀圖下方通過紅點(diǎn)展示組別交集情況的點(diǎn)圖?？梢钥闯?，7 種豆豉樣品中共有重要香氣化合物化合種類數(shù)為14 種，其中曲霉型豆豉特有重要香氣化合物為二甲基三硫，毛霉型豆豉（QM3）特有重要香氣化合物為乙酸辛酯、苯酚。相比于滬釀3.042（21），菌株郫釀M003、30M-1及24M-1發(fā)酵豆豉中重要香氣化合物種類數(shù)分別增加至24、23 種和24 種，并新增了4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（煙熏味、丁香味）、E-2-辛烯醛（草藥味）、3-辛酮（甜香）、異佛爾酮（木頭味）等重要香氣化合物，說明上述3 株菌株對(duì)發(fā)酵豆豉風(fēng)味豐富度具有明顯的提升作用。

通過聚類熱圖（圖8B）可將豆豉樣品分為3 類，QM3為第一類，郫釀M003、30M-1及24M-1為第二類，DM1、DM2、滬釀3.042為第三類。其中，第一類毛霉豆豉主要表現(xiàn)為苯甲酸甲酯、異戊醇、苯乙醇、乙酸辛酯、2,3,5-三甲基吡嗪、苯酚含量相對(duì)較高，其分別具有相對(duì)突出的花香、果香、玫瑰香氣、蘑菇味及橡膠味，這表明毛霉豆豉具有相對(duì)突出的花果香氣和霉味、蘑菇味。以滬釀3.042為代表的第三類豆豉主要表現(xiàn)為1-辛烯-3-醇、異戊酸、4-甲基戊酸等霉味、哈喇味、干酪味等物質(zhì)含量相對(duì)較高，其中，1-辛烯3-醇在豆豉中常有檢出，是豆豉霉味的主要來源[44]。相比于第三類樣品，第二類樣品中1-辛烯-3-醇、異戊酸、4-甲基戊酸等物質(zhì)含量明顯下降，而反式-2-壬烯醛（甜香）、3-辛酮（薰衣草味）、異佛爾酮（木質(zhì)味）等物質(zhì)含量明顯增加，這可能是郫釀M003、30M-1及24M-1對(duì)蛋白質(zhì)水解能力較強(qiáng)，促進(jìn)了豆豉中醛酮類的生成所導(dǎo)致的[45]。郫釀M003、30M-1及24M-1發(fā)酵豆豉可顯著提升豆豉風(fēng)味豐富度，并有效降低霉味等不良風(fēng)味香氣強(qiáng)度。

3 結(jié)論

豆豉發(fā)酵品質(zhì)同制曲菌株產(chǎn)酶能力相關(guān)，以α-淀粉酶為優(yōu)勢(shì)的制曲酶系利于發(fā)酵豆豉色澤和酸類風(fēng)味物質(zhì)的形成，以蛋白水解酶類為優(yōu)勢(shì)的制曲酶系則利于發(fā)酵豆豉鮮味和良好風(fēng)味品質(zhì)的形成。不同菌株中，傘狀毛霉QM3相比于米曲霉各酶活力均較低，發(fā)酵豆豉中理化指標(biāo)、游離氨基酸及風(fēng)味物質(zhì)含量均較低，品質(zhì)較差；米曲霉DM1、DM2和滬釀3.042代謝α-淀粉酶能力較強(qiáng)，發(fā)酵豆豉色澤相對(duì)較深且酸類物質(zhì)含量較高；米曲霉24M-1、30M-1和郫釀M003制曲產(chǎn)中性蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶能力較強(qiáng)，對(duì)蛋白類物質(zhì)利用程度較高，可有效提升發(fā)酵豆豉總酸、氨基酸態(tài)氮含量和風(fēng)味豐富度并降低霉味等不良風(fēng)味香氣強(qiáng)度，制得曲霉型豆豉風(fēng)味品質(zhì)相對(duì)較好。