異種腎移植的亞臨床研究進(jìn)展

陳羽翔 李卓騁 李濤 馬曉杰 王毅 蔣鴻濤

腎移植是治療終末期腎病的最有效途徑，同種異體腎移植雖然取得了一定成功，但腎臟來(lái)源短缺仍是限制臨床腎移植的主要障礙[1]。目前，我國(guó)為擴(kuò)大移植器官來(lái)源，除腦死亡或心臟死亡器官捐獻(xiàn)的供者及親屬活體供者外，還納入邊緣供者、ABO血型不相容腎移植等[2]。盡管如此，仍然不能從根本上緩解腎源壓力。因此，增加腎源已成為一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。異種移植是解決器官來(lái)源短缺的根本途徑之一。隨著基因修飾工程和包括單克隆抗體在內(nèi)的免疫抑制方案的發(fā)展，異種腎移植研究取得了重大的進(jìn)展，豬-非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（non-human primate，NHP）的腎移植日趨成熟，受體猴最長(zhǎng)存活時(shí)間已達(dá)758 d[3]。然而NHP 與人類存在較大差異，在獲得臨床試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)之前，豬-人異種腎移植的收益和風(fēng)險(xiǎn)是不明確的，并且因?yàn)樯锇踩蜕鐣?huì)倫理等問(wèn)題，現(xiàn)有條件不允許進(jìn)行大規(guī)模豬-人異種腎移植。亞臨床研究是橋接基礎(chǔ)和臨床研究的過(guò)渡性階段，可以在更接近臨床的試驗(yàn)環(huán)境中驗(yàn)證既往結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)、明確新的問(wèn)題。自2021年起公開(kāi)報(bào)道的多例豬-腦死亡受者腎移植表明異種腎移植已經(jīng)進(jìn)入了亞臨床研究階段[4-5]，因此有必要就目前異種腎移植亞臨床研究的進(jìn)展以及所面臨的重點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行綜述，以期為異種腎移植發(fā)展提供方向。

1 異種腎移植供體

1.1 供體豬的基因修飾

開(kāi)展異種腎移植臨床研究前必須做好針對(duì)供體動(dòng)物的選擇與設(shè)計(jì)，并在異種移植模型中進(jìn)行研究，以評(píng)估其安全性和有效性。盡管NHP 與人的血緣關(guān)系最近，但通常攜帶人類易感的病毒，不適合作為異種腎移植的供體。豬腎的大小、重量、解剖結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)與人類接近，繁殖快，且易進(jìn)行基因修飾，是理想的供體來(lái)源[6]。但由于人和豬之間巨大的種間差異，直接進(jìn)行豬到人腎移植會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，造成移植失敗。因此，需要對(duì)供體豬進(jìn)行基因修飾，隨著CRISPR/Cas9 技術(shù)的發(fā)展，這一問(wèn)題得到了部分解決。例如，敲除豬α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）基因可消除主要異種抗原α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）引起的超急性排斥反應(yīng)[7]，敲除豬編碼聚多糖S Da的β-1,4-N-乙酰半乳糖轉(zhuǎn)移酶（β-1,4-N-acetylg alactosaminyltransferase，β4GalNT2）基因和編碼N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d，Neu5Gc）的單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）基因，可減少非αGal 抗原介導(dǎo)的急性血管性排斥反應(yīng)[8]，這種3 基因編輯豬在異種腎移植研究中使用廣泛。除此以外，還可轉(zhuǎn)入人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白hCD46、hCD55 等，抑制人的補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)移植物的殺傷作用[9]；轉(zhuǎn)入人血栓調(diào)節(jié)蛋白（human thrombomodulin，hTBM）及內(nèi)皮蛋白C 受體（human endothelial protein C receptor，hEPCR），抑制微血管血栓形成，改善凝血情況[10-11]；轉(zhuǎn)入人整合素相關(guān)蛋白hCD47 以避免巨噬細(xì)胞的吞噬作用[12]；轉(zhuǎn)入人血紅素加氧酶（human hemeoxygenase，hHO）-1 用于調(diào)節(jié)免疫和抵抗炎癥[13]。包含上述9 種基因編輯的供體豬曾被認(rèn)為臨床試驗(yàn)的最佳選擇。

1.2 亞臨床研究的供體豬

上述這些基因的作用在大量異種移植實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)，并將在豬-腦死亡受者的異種腎移植研究中逐步明確。美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)使用了10 基因編輯豬，包括2 個(gè)人補(bǔ)體抑制基因（hCD55、hCD46）、2 個(gè)人抗凝血基因（hTBM、hEPCR）和2 個(gè)免疫調(diào)節(jié)基因（hCD47、hHO-1）靶向插入，以及3 個(gè)豬糖基抗原和1 個(gè)豬生長(zhǎng)激素受體基因敲除[5]。敲除生長(zhǎng)激素受體基因可能是因?yàn)樨i異種器官的內(nèi)在生長(zhǎng)潛力會(huì)損害其原位移植后的長(zhǎng)期功能[14]。除此以外目前仍然存在許多未知的異種抗原等待我們?nèi)ヌ綄ず妥R(shí)別。來(lái)自美國(guó)eGenesis 公司的Wenning Qin 和Michele E.Youd 團(tuán)隊(duì)對(duì)尤卡坦半島小型豬供體進(jìn)行69 次基因編輯，以實(shí)現(xiàn)3 種糖基抗原的消除、豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）失活和7 個(gè)人類轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)，將該供體豬的腎臟移植到NHP 體內(nèi)并與臨床相關(guān)免疫抑制方案結(jié)合，受體存活達(dá)758 d，這一研究成果使基因工程豬-人腎移植的臨床試驗(yàn)更近了一步[3,15-16]。

基因編輯并非越多越好，重要的是明確每種基因的具體作用。深入探究基因的功能和編輯后的影響，有助于更精確地調(diào)控供體豬的基因組，以實(shí)現(xiàn)更安全有效的異種腎移植。豬或許是異種腎臟最合適的來(lái)源，供體豬基因編輯取得了令人振奮的進(jìn)展，未來(lái)的研究應(yīng)從臨床需求入手，探究未知抗原的同時(shí)明確相關(guān)基因的作用機(jī)制，為異種腎移植的進(jìn)一步發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

2 異種腎移植受體

2.1 受體選擇

2.1.1 臨床前研究的受體 自1906年開(kāi)始，人們嘗試將不同動(dòng)物的器官移植到人身上，但均以失敗告終[17]。隨著外科技術(shù)發(fā)展，考慮到小型動(dòng)物之間更大的遺傳差異（小鼠-大鼠核苷酸差異33.4%，而獼猴-狒狒核苷酸差異2.6%）以及更低的實(shí)驗(yàn)花費(fèi)，研究者們逐步使用嚙齒類動(dòng)物揭示異種移植的機(jī)制，包括小鼠-大鼠、倉(cāng)鼠-大鼠等。盡管用嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)指導(dǎo)異種移植存在很大的局限性，但這些異種腎移植模型在闡明體液和細(xì)胞因子的機(jī)制方面作出了巨大貢獻(xiàn)。2012年以前約95%有關(guān)異種移植的研究都基于嚙齒類動(dòng)物模型。此后NHP 受到研究者青睞，因?yàn)樾碌幕蚓庉嫹桨甘筃HP 受體存活時(shí)間大大延長(zhǎng)[3]。但即使NHP 與人類相似，仍有一定局限性，豬-NHP 移植模型僅限于對(duì)免疫抑制方案、急性排斥反應(yīng)等問(wèn)題進(jìn)行初步探究，無(wú)法清楚地反映豬-人異種腎移植中的真實(shí)情況。

2.1.2 亞臨床研究的受體 豬-腦死亡受者是一種橋接動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的較好選擇，雖然目前接受豬腎的腦死亡受者生存時(shí)間較短，無(wú)法進(jìn)一步暴露更多諸如病毒感染、豬腎快速生長(zhǎng)等問(wèn)題[18]，但在豬-人異種移植的科學(xué)技術(shù)、社會(huì)倫理問(wèn)題沒(méi)有解決時(shí)，豬-腦死亡受者模型仍是目前最直觀反映臨床問(wèn)題的研究模型。對(duì)于基因修飾豬-人異種腎移植受者的選擇，目前仍未達(dá)成共識(shí)，有觀點(diǎn)認(rèn)為，受者至少要發(fā)生某一器官衰竭，且現(xiàn)有的手段無(wú)法有效干預(yù)[19]。此外，受者對(duì)同種異體抗原的敏感性是腎移植中的難題，例如群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）水平較高的患者，接受腎移植的機(jī)會(huì)小，且移植的預(yù)后較差，這類患者經(jīng)過(guò)嚴(yán)格配型、評(píng)估后可以作為異種腎移植的潛在受者[20]。但對(duì)于早期臨床研究，在異種腎移植技術(shù)成熟以前選擇這種高致敏患者接受豬腎移植是不合適的，可能達(dá)不到預(yù)期的研究目的，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)豬白細(xì)胞抗原（swine leukocyte antigen，SLA）和人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）存在交叉位點(diǎn)[21]，因此，高PRA 的受體中存在的抗HLA 抗體可能會(huì)與SLA 結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，對(duì)移植腎造成損傷。在安全性和有效性方面，異種腎移植臨床研究應(yīng)該更多地與長(zhǎng)期透析治療相比，而非與同種異體腎移植相比，因此因血型、地域等原因，接受同種異體移植希望不大或等待時(shí)間較長(zhǎng)的患者，可以考慮異種移植。除上述患者外，自愿參與研究的終末期腎病患者是否可以作為受者？將異種腎移植作為過(guò)渡治療是否合適？這些問(wèn)題有待更多亞臨床研究來(lái)明確。

受研究條件、供受體選擇、社會(huì)倫理等問(wèn)題的限制，現(xiàn)階段異種腎移植的亞臨床研究數(shù)量還很少，筆者未發(fā)現(xiàn)關(guān)于腦死亡受者術(shù)前準(zhǔn)備的研究報(bào)道。回顧已經(jīng)報(bào)道的異種腎移植，術(shù)前詳細(xì)的評(píng)估、合適的免疫誘導(dǎo)方案有助于維持移植腎功能和受體存活。從同種異體移植中取得的成果來(lái)看，圍手術(shù)期進(jìn)行康復(fù)干預(yù)等措施在將來(lái)豬-人異種腎移植中或許是有效的，但目前沒(méi)有關(guān)于異種移植康復(fù)方面的文獻(xiàn)，因此這一猜想還需要更多研究來(lái)證明。迄今為止，已報(bào)道進(jìn)行了2 例異種心臟移植。相較于異種腎移植，嚴(yán)重心臟衰竭患者缺乏有效的替代治療、供心數(shù)量少，迫使臨床不得不嘗試異種心臟移植，或許是異種心臟移植更早進(jìn)入臨床的原因。而終末期腎病患者基礎(chǔ)條件比心臟、肺臟、肝臟衰竭的患者更好，且當(dāng)移植腎發(fā)生感染、排斥反應(yīng)、功能障礙時(shí)可以通過(guò)透析等方法維持直至移植腎功能完全喪失，在移植腎切除后也有可用的替代治療方案——已有研究表明在配型合適、免疫抑制方案合理時(shí)，異種腎移植對(duì)后續(xù)的同種異體腎移植可能沒(méi)有明確的危害[22]，這可能為將來(lái)臨床研究提供更多機(jī)會(huì)。腎臟功能復(fù)雜，豬腎生理功能能否滿足人的需求尚無(wú)定論，因此還需要在亞臨床研究中進(jìn)行明確。

2.2 免疫抑制藥的使用

除對(duì)供體豬進(jìn)行基因編輯外，免疫抑制藥的使用也是異種移植腎存活所必須的。但異種移植中哪種免疫方案效果更好、對(duì)受體負(fù)擔(dān)更小，未來(lái)的免疫抑制藥還需要關(guān)注哪些方面，仍有待在亞臨床研究中進(jìn)一步探究。目前異種腎移植中常用的免疫抑制藥包括他克莫司、環(huán)孢素、霉酚酸酯（mycophenolic acid，MPA）、西羅莫司和糖皮質(zhì)激素等。為了獲得更好的療效，一些新型的免疫抑制藥逐漸問(wèn)世。

2.2.1 阻斷共刺激通路 CD40/CD154 是促進(jìn)T 細(xì)胞活化的一種重要的共刺激通路。2016年Mohiuddin 等[23]報(bào)道了使用抗CD40 抗體的方案，基因編輯豬的心臟在狒狒體內(nèi)最長(zhǎng)存活了945 d。后續(xù)研究證明阻斷CD40/CD154 軸可促進(jìn)豬心臟、腎臟和胰島的長(zhǎng)期生存，且抗CD154 效果可能比抗CD40 效果更好[24]。

2.2.2 抑制補(bǔ)體系統(tǒng) 補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)經(jīng)典途徑、替代途徑、凝集素途徑以及缺血-再灌注損傷參與先天免疫和適應(yīng)性免疫，可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞破壞、誘發(fā)凝血，進(jìn)一步導(dǎo)致超急性排斥反應(yīng)和血栓形成，引起移植腎廣泛缺血壞死，是異種移植中重要的識(shí)別和效應(yīng)機(jī)制。雖然供體豬轉(zhuǎn)入了人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白如hCD46、hCD55 等，但在異種移植過(guò)程中仍然有補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，因此需要針對(duì)性的抑制方案[25]。

C1 抑制劑對(duì)抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibodymediated rejection，AMR）的治療作用在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均有探究，包括降低AMR 發(fā)生和減輕慢性AMR 損傷，且有一定安全性[26]，但因?yàn)檠芯拷Y(jié)果不一致、藥物方案和樣本量不同等原因尚未真正進(jìn)入臨床。蘇替利單抗（sutimlimab）是一種抗C1 單抗，通過(guò)抑制補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑用于治療冷凝集素病[27]。一項(xiàng)關(guān)于sutimlimab 的Ⅰ期臨床試驗(yàn)，觀察到AMR 和補(bǔ)體經(jīng)典通路仍有激活，但10 例腎移植受者C4d 沉積水平均有不同程度降低，腎功能和供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）未見(jiàn)明顯變化[28]，表明sutimlimab 有一定應(yīng)用前景。

抗C5 抗體特度魯單抗（tesidolumab）也可以減輕AMR。Adams 等[29]在豬-恒河猴腎移植研究中發(fā)現(xiàn)，抗CD154、T 細(xì)胞耗竭、使用MPA 和糖皮質(zhì)激素的免疫抑制基礎(chǔ)上，每周使用tesidolumab 減少了早期IgM 介導(dǎo)的AMR，且實(shí)驗(yàn)中的恒河猴大多存活300 d 以上。

2.2.3 其他免疫抑制藥 其他正在進(jìn)行異種移植研究的藥物包括抗CD38 抗體達(dá)雷木單抗（daratumumab）和貝利木單抗（belimumab）[30]。另一種新藥imlifidase能迅速清除循環(huán)IgG[31]，有一定的應(yīng)用前景。初步研究表明，在高致敏NHP 中，使用imlifidase 后預(yù)存抗豬抗體水平降低[32]，但具體的結(jié)論仍需要更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 亞臨床研究的方案 美國(guó)阿拉巴馬大學(xué)的豬-腦死亡受者的異種腎移植使用糖皮質(zhì)激素、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、利妥昔單抗用于免疫誘導(dǎo)，后續(xù)使用MPA 類藥物、甲潑尼龍以及他克莫司用于免疫維持，直到試驗(yàn)終止未觀察到超急性排斥反應(yīng)，也沒(méi)有細(xì)胞排斥反應(yīng)、抗體或補(bǔ)體蛋白沉積的表現(xiàn)[5]。美國(guó)紐約大學(xué)的2 例豬-腦死亡受者腎移植使用糖皮質(zhì)激素和MPA 進(jìn)行免疫維持，并且在6、24、48、54 h進(jìn)行活組織檢查，未發(fā)現(xiàn)超急性排斥反應(yīng)或AMR 跡象[4]。3 例異種腎移植均未使用抗CD40 單抗，表明豬-腦死亡受者移植后并非需要很復(fù)雜的免疫抑制方案，也可能因?yàn)槭苷呱鏁r(shí)間太短，部分排斥反應(yīng)還沒(méi)有發(fā)生。因此今后亞臨床研究中，在條件允許的情況下可以適當(dāng)延長(zhǎng)受者觀察期，使之暴露更多潛在的問(wèn)題。

2.3 術(shù)后監(jiān)測(cè)和管理

與同種異體腎移植不同，異種移植腎來(lái)源是基因修飾豬，這可能需要一些新的檢測(cè)方案來(lái)明確異種移植圍手術(shù)期的各種問(wèn)題?；蛐揎椮i作為供腎來(lái)源意味著許多指標(biāo)的檢測(cè)可以在移植開(kāi)始前進(jìn)行，包括移植相關(guān)抗原和抗體的檢測(cè)以及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。除此以外，移植腎功能也需要更全面的監(jiān)測(cè)方式，除同種異體移植術(shù)后常規(guī)監(jiān)測(cè)的血液生化指標(biāo)外，與排斥反應(yīng)相關(guān)的DSA、非HLA 抗體、補(bǔ)體水平等都需要檢測(cè)。另外，根據(jù)豬-NHP 腎移植研究，巨噬細(xì)胞在異種移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此移植術(shù)后病理活組織檢查也需要注意巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、吞噬、極化以及細(xì)胞因子表達(dá)的情況。豬腎的生理功能也值得關(guān)注，促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）、酸堿平衡等指標(biāo)同樣需要納入術(shù)后監(jiān)測(cè)范圍[33]。已有研究顯示豬腎素可以用人酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)[34]，但豬EPO 還沒(méi)有明確的檢測(cè)方法。豬來(lái)源的病毒感染是影響移植物存活的原因之一，因此除上述指標(biāo)以外，還需要對(duì)PERV、豬巨細(xì)胞病毒/豬玫瑰狀病毒（porcine cytomegalovirus/porcine roseolovirus，PCMV/PRV）進(jìn)行檢測(cè)，以保證移植物和受體的安全。總的說(shuō)來(lái)，探究未來(lái)異種腎移植需要更新哪些技術(shù)手段、納入哪些新的指標(biāo)、如何評(píng)價(jià)受體狀態(tài)等問(wèn)題，對(duì)異種腎移植的成功有重大意義，而這些問(wèn)題有望通過(guò)亞臨床研究初步明確。

3 異種腎移植面臨的問(wèn)題

盡管異種腎移植取得了一些進(jìn)展，但仍面臨眾多挑戰(zhàn)，如排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凝血功能障礙、移植腎生理功能維持、病毒感染以及異種腎移植相關(guān)的社會(huì)和倫理問(wèn)題等。

3.1 排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)與凝血功能紊亂

由于供體豬和受體存在分子差異，異種腎移植往往面臨嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，且目前雖然通過(guò)基因編輯、免疫抑制等手段克服了超急性排斥反應(yīng)，但急性排斥反應(yīng)仍無(wú)法避免。一方面，由于已報(bào)道的豬-腦死亡受者異種腎移植觀察時(shí)間短，未觀察到明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[4-5]；但另一方面，根據(jù)1 051 例NHP 同種和異種腎移植的結(jié)果來(lái)看，異種腎移植中急性排斥反應(yīng)很難避免（48.6%），且以AMR 為主（45.5%）[35]。慢性排斥反應(yīng)也影響異種移植腎的存活，Kim 等[36]通過(guò)耗竭CD4+T 細(xì)胞將豬-恒河猴移植腎存活時(shí)間延長(zhǎng)至499 d，證明CD4+T 細(xì)胞是慢性排斥反應(yīng)的原因之一，但具體機(jī)制仍然所知甚少。另外，在異種移植中，轉(zhuǎn)入hCD55 或hCD46 后依然觀察到補(bǔ)體激活，如何克服也有待進(jìn)一步研究[25]。因此，開(kāi)發(fā)更有針對(duì)性的免疫抑制藥以及具有免疫耐受特征的基因修飾豬仍是未來(lái)異種移植中排斥反應(yīng)研究的目標(biāo)。當(dāng)移植腎功能障礙時(shí)，血小板數(shù)量往往降低，移植腎表現(xiàn)出微血栓形成和腎間質(zhì)出血。且部分凝血異常與急性排斥反應(yīng)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)[37]，因此減少排斥反應(yīng)造成的損傷，或許能夠抑制受體凝血功能紊亂。持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)是移植失敗的重要原因之一，炎癥反應(yīng)與上述的凝血功能紊亂、排斥反應(yīng)有一定關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞外組蛋白在異種腎移植中的作用及其機(jī)制也需要關(guān)注。細(xì)胞外組蛋白是一種由損傷和活化的細(xì)胞釋放到胞外的正電荷蛋白質(zhì)，介導(dǎo)組織、細(xì)胞損傷，并作為損傷相關(guān)分子模式介導(dǎo)炎癥、凝血障礙、免疫反應(yīng)和細(xì)胞毒性。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究也發(fā)現(xiàn)豬-NHP 腎移植后血清中細(xì)胞外組蛋白水平升高，用白細(xì)胞介素-6 受體阻斷劑治療后可降低細(xì)胞外組蛋白和C-反應(yīng)蛋白水平[38]。

采取針對(duì)炎癥發(fā)生發(fā)展的措施、使用相應(yīng)炎癥介質(zhì)的阻斷劑、阻斷共刺激通路可以抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)應(yīng)當(dāng)關(guān)注細(xì)胞外組蛋白在異種移植中的作用，這些措施有助于延長(zhǎng)異種移植腎存活時(shí)間[39]。

3.2 腎臟生理功能

在異種腎移植研究中，研究者們普遍認(rèn)為豬腎的生理功能將對(duì)受者長(zhǎng)期預(yù)后產(chǎn)生重要影響，但具體的生理功能，例如EPO 生成、RAAS 調(diào)節(jié)以及鈣磷代謝平衡等對(duì)移植腎存活及患者預(yù)后的影響還不清楚[40]。從目前研究結(jié)果來(lái)看，豬腎生成的EPO 能否對(duì)NHP起效仍未明確[41]；豬來(lái)源的腎素雖然通過(guò)受體的RAAS 發(fā)揮生理功能，但效果明顯受損——血管生成素（angiopoietin，Ang）Ⅱ和醛固酮水平降低，血鉀升高，尿液滲透性和鈉離子濃度也有不同程度降低，說(shuō)明豬腎對(duì)尿液的濃縮能力下降[34]。

盡管異種移植后大多數(shù)電解質(zhì)都維持在正常范圍內(nèi)，但仍然面臨高血鈣、低血磷的問(wèn)題[33,37]，目前還沒(méi)有研究探索豬與人或NHP 之間鈣磷調(diào)節(jié)機(jī)制的差異。除此以外，筆者團(tuán)隊(duì)前期研究觀察到接受豬腎移植的獼猴出現(xiàn)血液碳酸氫根升高，但因?yàn)槭荏w獼猴存活時(shí)間短，高碳酸氫根是否影響移植物存活、受體長(zhǎng)時(shí)間存活時(shí)碳酸氫根的濃度能否恢復(fù)正常等問(wèn)題暫時(shí)無(wú)法回答[42]。上述結(jié)果提示，豬腎移植到NHP 后，其生理功能或許沒(méi)有達(dá)到預(yù)期。近期報(bào)道的多例豬-人異種腎移植也因?yàn)橛^察期太短，無(wú)法明確腦死亡受者是否存在上述內(nèi)分泌和代謝問(wèn)題。但即使這些問(wèn)題可用人源化基因修飾豬、調(diào)控受體飲食或者外源性導(dǎo)入人EPO 等方法解決，在亞臨床研究中還是不能忽視對(duì)異種腎移植生理學(xué)的探究，包括具體機(jī)制、早期識(shí)別以及針對(duì)性的管理方案等。

3.3 病毒感染

PERV 整合在基因組中，是異種跨物種傳播的逆轉(zhuǎn)錄病毒，基因修飾豬有傳播PERV 的可能性。根據(jù)目前研究，隔離傳染源、使用抗病毒藥物治療、接種疫苗等常規(guī)手段很難減少PERV 傳播，甚至在已感染的受體細(xì)胞中，PERV 傳播能力會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)[43]。在免疫抑制不可避免、PERV 無(wú)法根除的情況下，PERV 感染風(fēng)險(xiǎn)意味著移植前后應(yīng)該對(duì)供體和受體進(jìn)行更加嚴(yán)格的安全檢測(cè)，包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)、Southern 印跡、熒光原位雜交、基因測(cè)序等手段[44-45]。通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除已知的PERV 相關(guān)基因是否真正可行，面對(duì)未知的PERV 相關(guān)基因能否利用PERV 的共性使用特定手段進(jìn)行沉默，亞臨床研究有望發(fā)現(xiàn)并明確PERV 新的解決辦法。

PCMV/PRV 與人皰疹病毒6A、6B、77 密切相關(guān)，在世界各地的豬群中廣泛分布[46]。美國(guó)馬里蘭大學(xué)進(jìn)行的豬-人心臟移植中，觀察到這種病毒可由豬傳播給患者[47]。感染PCMV/PRV 會(huì)導(dǎo)致受體血小板減少、纖維蛋白原水平下降和無(wú)法控制的出血，大大影響移植物存活和受體預(yù)后[48]，因此如何檢測(cè)、清除這類病毒是異種移植需要克服的困難之一。Halecker 等[49]報(bào)道，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及免疫學(xué)方法可以檢測(cè)并清除PCMV/PRV，雖然效率很低，但這也為后續(xù)PCMV/PRV 的研究提供了一種思路。

因此，在未來(lái)豬-腦死亡受者腎移植中，需要格外注意PERV 和PCMV/PRV 感染的問(wèn)題，這種亞臨床研究相較于過(guò)去的各種動(dòng)物模型，更接近于真實(shí)的臨床情境，因此有助于揭示PERV 和PCMV/PRV 感染與傳播的關(guān)鍵。在亞臨床研究中深入挖掘PERV和PCMV/PRV 感染機(jī)制，并試驗(yàn)相應(yīng)的預(yù)防措施，有助于提高異種腎移植的臨床安全性，推動(dòng)其早日走入臨床。

3.4 社會(huì)和倫理問(wèn)題

只有在社會(huì)和倫理問(wèn)題得到有效解決，異種移植才能真正應(yīng)用于臨床。異種腎移植中，不光受者需要重點(diǎn)關(guān)注，參與其中的動(dòng)物權(quán)利、福祉以及社會(huì)公眾的態(tài)度也需要關(guān)注。美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局2022年批準(zhǔn)了1 例豬-人的異種心臟移植[50]，這是異種移植倫理、法規(guī)的一項(xiàng)突破。近日國(guó)際移植協(xié)會(huì)發(fā)表的一篇特刊文章總結(jié)了30 條移植相關(guān)的基本倫理原則[51]，表明異種移植相關(guān)的法律、倫理原則正在不斷完善和適應(yīng)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。這也表明在正確的監(jiān)管和決策評(píng)估下進(jìn)行異種移植是符合倫理要求的。國(guó)外一些研究顯示，公眾對(duì)于異種器官移植的接受度為10%～90%，考慮到地區(qū)、宗教、被調(diào)查者身體狀況等問(wèn)題，一些數(shù)據(jù)或許無(wú)法反映異種移植所面臨的真實(shí)社會(huì)態(tài)度。筆者團(tuán)隊(duì)也進(jìn)行了一項(xiàng)研究，納入終末期腎病等待移植的患者、腎移植術(shù)后患者、患者家屬以及醫(yī)學(xué)生4 個(gè)群體進(jìn)行調(diào)查，約53.2%的受訪者明確表示“在異種腎移植與同種異體腎移植有著相同結(jié)果及風(fēng)險(xiǎn)時(shí)”能接受異種腎移植；而46.8%的受訪者態(tài)度不確定，主要原因是目前異種移植的風(fēng)險(xiǎn)尚不明確、擔(dān)心受到歧視；態(tài)度不確定的受訪者中，21%～35%在面臨無(wú)法進(jìn)行同種異體腎移植或接受異種腎移植更有優(yōu)勢(shì)時(shí)，態(tài)度發(fā)生了轉(zhuǎn)變[52]。提示當(dāng)前面臨的社會(huì)問(wèn)題有望通過(guò)推進(jìn)研究、科普宣傳逐漸解決。

4 小結(jié)

異種腎移植在基礎(chǔ)研究中展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力，但這些成果難以直接應(yīng)用于臨床。因此，亞臨床研究作為一個(gè)過(guò)渡性階段就顯得尤為重要，不僅可以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究成果，確保其在更接近真實(shí)世界的環(huán)境中的有效性，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)成果向臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程中也會(huì)暴露一些實(shí)驗(yàn)室難以發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題，這些問(wèn)題既反映了臨床的需求，同時(shí)給實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究提供方向。目前看來(lái)，亞臨床研究中使用“9 基因豬”或“10 基因豬”可能是比較合適的，但還要進(jìn)一步明確具體的作用機(jī)制，同時(shí)也需要積極探究新的異種抗原?，F(xiàn)階段基因修飾豬的培育周期還很長(zhǎng)，未來(lái)如何提高產(chǎn)量也是值得考慮的問(wèn)題。雖然將終末期腎病的志愿者或不能接受同種異體腎移植的患者作為臨床研究受者還存在爭(zhēng)議，但在當(dāng)前亞臨床研究中腦死亡患者可能是一種較好的選擇。現(xiàn)有的免疫抑制方案還不完善，未來(lái)還需要更多有效的免疫抑制藥。盡管取得了突破性的進(jìn)展，但是異種腎移植供腎基因型和受體選擇尚未統(tǒng)一，圍手術(shù)期監(jiān)測(cè)、管理方案還不明確，同時(shí)仍然面臨排斥反應(yīng)、持續(xù)的炎癥反應(yīng)、凝血功能紊亂、腎臟生理功能的維持以及病毒感染等問(wèn)題，未來(lái)的亞臨床研究應(yīng)該積極尋找可能的解決辦法，推動(dòng)異種腎移植從實(shí)驗(yàn)室走入臨床。