巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在腎纖維化中的調(diào)控機(jī)制

楊艷燕 陶濤 羅朋立

腎纖維化是所有慢性腎病發(fā)展至終末期腎病的最后共同通路，表現(xiàn)為大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積而導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化，最終造成腎功能喪失。腎移植是治療各種終末期腎病的有效手段，但術(shù)后多種原因可導(dǎo)致移植腎發(fā)生纖維化，嚴(yán)重影響受者生存質(zhì)量。肌成纖維細(xì)胞是導(dǎo)致膠原產(chǎn)生和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的主要細(xì)胞類型，是腎纖維化過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞[1]，但其來源一直備受爭議。既往研究認(rèn)為，肌成纖維細(xì)胞來源于固有成纖維細(xì)胞、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial- mesenchymal transition，EndMT）和周細(xì)胞等[2-8]。巨噬細(xì)胞是炎癥和纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)細(xì)胞[5-6]，活化的巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生和分泌多種炎癥因子和趨化因子，參與腎臟炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)代謝、腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。研究表明，在一定病理?xiàng)l件下，巨噬細(xì)胞也可直接向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致纖維化，這一過程稱為巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（macrophage-myofibroblast transition，MMT），由巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的肌成纖維細(xì)胞占組織中肌成纖維細(xì)胞總數(shù)的35%～65%[9]。本文就MMT 的特點(diǎn)及調(diào)控MMT 可能的分子機(jī)制做一綜述，旨在為腎纖維化的機(jī)制研究提供參考。

1 巨噬細(xì)胞概述

1.1 巨噬細(xì)胞來源及分類

巨噬細(xì)胞源自單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來源于骨髓中的前體細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞，具有維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和宿主防御功能[10-11]。巨噬細(xì)胞根據(jù)其來源可分為骨髓來源巨噬細(xì)胞和組織固有巨噬細(xì)胞；根據(jù)其功能、活化程度以及分泌因子的不同，可分為M1 型和M2 型；根據(jù)淋巴細(xì)胞抗原6C（lymphocyte antigen 6C，Ly6C）水平，又可分為CD11b+/Ly6Chigh、CD11b+/Ly6Cintermediate、CD11b+/Ly6Clow3 個(gè)亞型[12]。

1.2 巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性與可塑性

巨噬細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和多樣性，根據(jù)其局部微環(huán)境、疾病類型和疾病的不同階段，表現(xiàn)出不同的表型和明顯的功能差異。當(dāng)巨噬細(xì)胞在體外受到γ-干擾素、脂多糖等刺激時(shí)，可活化為M1 型，即經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（classically activated macrophage），啟動(dòng)輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1 型適應(yīng)性免疫反應(yīng)，分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6等促炎因子，以及C X C 趨化因子配體（C X C chemokine ligand，CXCL）1、CXCL9、CXCL10 等趨化因子，具有殺死微生物、清除感染等特性，促進(jìn)組織炎癥和損傷[13]。當(dāng)巨噬細(xì)胞在體外受到IL-4、I L-1 0 等刺激或真菌和蠕蟲感染時(shí)，可活化為M2 型，即替代活化型巨噬細(xì)胞（alternatively activated macrophage），誘導(dǎo)Th2 型免疫反應(yīng)[14]，分泌IL-10、IL-18、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白等抗炎因子以及CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL17、CCL22 等趨化因子，促進(jìn)傷口愈合、纖維化形成。隨著單細(xì)胞RNA 測序技術(shù)的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞存在連續(xù)的極化狀態(tài)，而M1 型和M2 型是適應(yīng)性反應(yīng)中連續(xù)激活狀態(tài)的兩個(gè)極端，這種異質(zhì)性表型的存在被解釋為巨噬細(xì)胞在不同刺激下的可塑性。

1.3 巨噬細(xì)胞在腎纖維化中的作用

腎纖維化是腎病進(jìn)展到終末期的主要驅(qū)動(dòng)因素[14-15]。巨噬細(xì)胞浸潤是腎缺血-再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）后的常見特征，近期研究表明，結(jié)節(jié)性硬化癥蛋白復(fù)合體1（tuberous sclerosis complex 1，TSC1）是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化來影響IRI[16]。在IRI 早期，巨噬細(xì)胞中TSC1 缺陷可能導(dǎo)致M1 型巨噬細(xì)胞極化，加重腎功能障礙，而在IRI 修復(fù)過程中，TSC1 缺陷則減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞極化，減輕腎纖維化。在單側(cè)輸尿管梗阻和IRI 模型中發(fā)現(xiàn)，造血細(xì)胞激酶（hematopoietic cell kinase，HCK）作為Src 家族激酶成員，通過抑制自噬誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化推動(dòng)腎纖維化[17]。在糖尿病腎病、IgA 腎病中也同樣發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞可能加速腎纖維化的發(fā)展[18-20]。

2 巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化

2.1 巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的定義及特點(diǎn)

2014年Nikolic-Paterson 等[21]首次描述了來自骨髓的巨噬細(xì)胞可以直接轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，這一過程被稱為MMT，發(fā)生轉(zhuǎn)分化的巨噬細(xì)胞被稱為MMT 細(xì)胞。MMT 細(xì)胞表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞（CD68+或F4/80+）和肌成纖維細(xì)胞（α-SMA+）標(biāo)記物共表達(dá)，并伴有細(xì)胞形態(tài)呈梭形改變。

一項(xiàng)研究活組織檢查（活檢）結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞（CD68+）和肌成纖維細(xì)胞（α-SMA+）標(biāo)志物的共表達(dá)，且MMT 細(xì)胞在活動(dòng)性纖維化病變中存在，但在無纖維化的急性炎癥或無纖維化病變的樣本中基本不存在，提示MMT 參與活動(dòng)性腎纖維化[22]。同時(shí)該研究還通過譜系追蹤證實(shí)在腎纖維化的單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型中有大量α-SMA 和Ⅰ型膠原的F4/80+髓系巨噬細(xì)胞表達(dá)，提示發(fā)生MMT 的巨噬細(xì)胞為骨髓源性，且多數(shù)共表達(dá)CD206，提示發(fā)生MMT 的細(xì)胞以M2 型為主[22]。另一項(xiàng)同種異體移植腎慢性排斥反應(yīng)損傷研究結(jié)果表明，在慢性排斥反應(yīng)患者移植腎活檢標(biāo)本中，MMT 細(xì)胞（CD68+/α-SMA+）約占肌成纖維細(xì)胞總數(shù)的50%，同樣，在接受Balb/c 腎移植的C57 BL/6J 小鼠中，MMT 細(xì)胞在慢性排斥反應(yīng)的同種異體移植腎間質(zhì)中構(gòu)成了重要的細(xì)胞群體，提示MMT 與移植腎功能和間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度相關(guān)，會(huì)加速慢性腎移植損傷的間質(zhì)纖維化[23]。阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征相關(guān)的腎病主要是由慢性間歇性缺氧引起的組織損傷。在慢性間歇性缺氧大鼠腎臟中觀察到鹽皮質(zhì)激素受體激活，可能引起巨噬細(xì)胞浸潤和MMT，從而導(dǎo)致缺氧條件下腎纖維化[24]。但是依賴于標(biāo)記物表達(dá)和譜系追蹤研究MMT 存在一定的局限性，研究專注于巨噬細(xì)胞的表型而不是功能。2018年一項(xiàng)研究解決了這個(gè)問題，該研究使用條件性敲除C D 4 5+白細(xì)胞中的Ⅰ型膠原（標(biāo)記物Col1α1）小鼠，在單側(cè)輸尿管梗阻和腺嘌呤誘導(dǎo)的腎纖維化模型中，腎臟中沉積的Ⅰ型膠原38%～50%來源于骨髓源性細(xì)胞[25]。而在另一項(xiàng)研究中，骨髓源性肌成纖維細(xì)胞僅占腎臟中總肌成纖維細(xì)胞的10%左右[26]。因此，纖維化腎臟中發(fā)生MMT 的巨噬細(xì)胞來源還需更深入的研究。

在梗阻性腎病、移植腎慢性排斥反應(yīng)、IgA 腎病、糖尿病腎病等多種腎臟病活檢組織中都發(fā)現(xiàn)有MMT 現(xiàn)象存在，提示MMT 是造成腎纖維化非常重要、普遍的因素[27-30]。MMT 是促進(jìn)腎纖維化的一種機(jī)制，深入研究這一機(jī)制可能會(huì)發(fā)現(xiàn)腎纖維化的新的藥物治療靶點(diǎn)。

2.2 巨噬細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控機(jī)制

目前，MMT 的調(diào)控機(jī)制并未明確，研究最多的是TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路[31-33]。TGF-β 包含TGFβ1、TGF-β2和TGF-β33 種亞型，絕大多數(shù)的實(shí)質(zhì)細(xì)胞都可以產(chǎn)生和分泌TGF-β，而一些浸潤細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板等也可釋放TGF-β。TGFβ 的釋放和激活導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)生成增多和降解減少，適量的激活可促進(jìn)正常結(jié)構(gòu)重塑和損傷修復(fù)，而過度的釋放則將導(dǎo)致器官和組織的纖維化。TGF-β 被認(rèn)為是導(dǎo)致人類腎病中纖維化的關(guān)鍵因素。TGFβ1也是誘導(dǎo)M2 型巨噬細(xì)胞極化的主要因子，并促進(jìn)纖維化腎臟中肌成纖維細(xì)胞的分化和積累，這在LeBleu 等[34]的研究中得到證實(shí)，該研究發(fā)現(xiàn)在α-SMA+細(xì)胞中條件性敲除Tgfbr2 基因（編碼TGF-β 受體Ⅱ）后，巨噬細(xì)胞浸潤減少，肌成纖維細(xì)胞的數(shù)量減少。值得注意的是，TGF-β1暴露的時(shí)間是決定體外細(xì)胞表型的一個(gè)重要因素。骨髓源性巨噬細(xì)胞短期（2 d）暴露于TGF-β1可誘導(dǎo)M2 型極化[35]，但持續(xù)的TGF-β1（5～7 d）激活，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[21-23]。

TGF-β 受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子是具有轉(zhuǎn)錄因子功能的Smad 蛋白，因而此通路稱為Smad通路。TGF-β/Smad被認(rèn)為是調(diào)控MMT 促進(jìn)腎組織纖維化的主要調(diào)節(jié)因子[36]。TGFβ 首先與細(xì)胞膜表面的TGF-β 受體Ⅱ結(jié)合，形成異二聚體復(fù)合物，然后再與TGF-β 受體Ⅰ結(jié)合形成四聚體，磷酸化TGF-β 受體Ⅱ近膜GS 區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸殘基，使其活化?；罨腡GF-β 受體Ⅰ使受體相關(guān)性Smad2 和Smad3 磷酸化，后者與Smad4 形成三聚體復(fù)合物，復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)激活MMT 所需的基因。研究表明，將GFP+Smad3-/-或GFP+Smad3+/+骨髓源性巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)輸注到經(jīng)輻射照射后的野生型單側(cè)輸尿管梗阻小鼠體內(nèi)，受損腎臟內(nèi)產(chǎn)生相同數(shù)量的GFP+巨噬細(xì)胞，但只有GFP+Smad3+/+巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為GFP+α-SMA+肌成纖維細(xì)胞，由巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的肌成纖維細(xì)胞占肌成纖維細(xì)胞總數(shù)的60%以上，出現(xiàn)腎纖維化，且發(fā)生MMT 的巨噬細(xì)胞主要為M2 型；體外給予TGF-β1刺激骨髓源性巨噬細(xì)胞也可誘導(dǎo)MMT 反應(yīng)，細(xì)胞變成長梭形并表達(dá)CD206、α-SMA 和Ⅰ型膠原，當(dāng)Smad3 缺失，可以阻止M2 型巨噬細(xì)胞向MMT 細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化和進(jìn)行性腎纖維化，由此證明Smad3 是TGF-β1誘導(dǎo)MMT 和膠原生成所必需的[37]。在同種異體移植腎小鼠模型中，骨髓來源的M2 型巨噬細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化也依賴Smad3 調(diào)節(jié)，敲除Smad3 后MMT細(xì)胞數(shù)量顯著減少，移植腎慢性纖維化程度減輕[23]。

腎纖維化中Smad3 途徑另一個(gè)確定的靶點(diǎn)是原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src。Src 是一種廣泛表達(dá)的非受體蛋白酪氨酸激酶，可被多種細(xì)胞表面受體觸發(fā)激活，包括免疫球蛋白受體、部分病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)的分子模式受體、受體蛋白酪氨酸激酶、G 蛋白偶聯(lián)受體和細(xì)胞因子受體[38-39]。Src 的激活是腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化和腎纖維化形成的關(guān)鍵因素[40]。最近Tang 等[41]通過單細(xì)胞RNA 測序共鑒定了501 個(gè)與MMT 相關(guān)的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)Src 位于TGF-β1誘導(dǎo)MMT 的差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)的中心，體外研究中TGF-β1在骨髓源性巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)MMT 需要Src，而染色質(zhì)免疫沉淀表明TGF-β1觸發(fā)Smad3 結(jié)合到Src 的3'非翻譯區(qū)域以增加其轉(zhuǎn)錄，抑制Src 可以有效阻斷體內(nèi)外MMT 的發(fā)生，從而抑制腎纖維化。Src 作為TGF-β1/Smad3 介導(dǎo)的MMT 的關(guān)鍵調(diào)控因子，揭示了MMT 可能的潛在機(jī)制。

近來另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Pou4f1 在腎臟纖維化中也是Smad3 的直接靶點(diǎn)，是MMT 的關(guān)鍵下游調(diào)控因子[42]。在人類和實(shí)驗(yàn)性腎病模型中，Pou4f1 的表達(dá)在體內(nèi)腎纖維化早期和體外骨髓源性巨噬細(xì)胞發(fā)生MMT 期間達(dá)到峰值。依賴于Pou4f1的纖維化基因網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)TGF-β1/Smad3 驅(qū)動(dòng)的MMT。當(dāng)巨噬細(xì)胞特異性沉默Pou4f1，可以有效阻止小鼠腎纖維化的進(jìn)展。氯吡格雷是一種P2Y12 抑制劑，是一種新型的慢性腎病抗纖維化藥物，通過單細(xì)胞RNA 測序證明，P2Y12 在纖維化腎臟中由巨噬細(xì)胞高度表達(dá)，通過TGF-β1/Smad3 依賴性機(jī)制促進(jìn)MMT 介導(dǎo)腎纖維化[43]。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，以往的研究主要集中在巨噬細(xì)胞是如何通過間接機(jī)制推動(dòng)腎纖維化的。近來通過譜系追蹤、單細(xì)胞測序、已知細(xì)胞類型標(biāo)記物的共同表達(dá)和抑制MMT 的關(guān)鍵機(jī)制表明，在腎臟損傷修復(fù)過程中，巨噬細(xì)胞很可能通過MMT 直接參與腎纖維化形成。值得強(qiáng)調(diào)的是，支持MMT 存在的結(jié)論與細(xì)胞和組織中巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞屬性的共存以及研究模型中疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。為了更好地了解MMT的作用，還需要更好的分子表型來描述這些MMT 細(xì)胞的特征，以進(jìn)一步研究調(diào)控MMT 的其他可能分子機(jī)制，為新的抗纖維化治療提供思路。