作物中葉酸合成及生物強(qiáng)化研究進(jìn)展

馬云 王虹

摘要 葉酸是四氫葉酸及其一碳單位取代衍生物的統(tǒng)稱，對植物生長發(fā)育和人類健康發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。人體本身不具備合成葉酸的能力，因此必須從膳食中獲取。利用生物強(qiáng)化提高作物中葉酸含量是一種有效解決全球性葉酸缺乏的方法。介紹了葉酸的結(jié)構(gòu)與功能、生物合成途徑、葉酸的提取與檢測方法，并重點(diǎn)闡述了不同作物中葉酸生物強(qiáng)化的現(xiàn)狀，對全球葉酸強(qiáng)化做出展望。

關(guān)鍵詞 作物；葉酸；生物合成；生物強(qiáng)化

中圖分類號 Q 945? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）06-0010-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.06.003

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Research Progress on Folate Biosynthesis and Biofortification in Crops

MA Yun，WANG Hong

（State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Hebei Sub-center of National Maize Improvement Center of China/College of Agronomy， Hebei Agricultural University， Baoding， Hebei 071000）

Abstract Folate is a collective term for tetrahydrofolate （THF） and its derivatives substituted with one carbon unit， playing a crucial role in plant growth and human health. The human body cannot synthesize folate itself， so it must be obtained from the diet. Improving folate content in plants through biofortification is an effective method to address the global folate deficiency problem. This review introduced the structure， functions， the biosynthesis pathways， and the extraction and detection methods of folate. Moreover， it focused on the current status of folate biofortification in different crops， and prospected for global folate biofortfication.

Key words Crops;Folate;Biosynthesis;Biofortification

葉酸（folates）化學(xué)名為蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA），又名維生素B9，是一種水溶性B族維生素，為四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF）及其一碳衍生物的統(tǒng)稱。葉酸作為一碳單位的供體和受體，參與著許多重要的生物化學(xué)反應(yīng)，如甲基化循環(huán)、核苷酸與氨基酸的合成等，是人體生命活動所必需的微量營養(yǎng)物質(zhì)［1］。植物和微生物自身可以從頭合成葉酸，然而人類和其他高等哺乳動物因缺乏完整的葉酸合成系統(tǒng)，故需要通過膳食攝取葉酸。醫(yī)學(xué)研究表明，成年人每天的葉酸建議攝入量為400 μg，孕婦則建議每天攝入600 μg葉酸才能有效防止胎兒先天性畸形［2］。但目前大部分地區(qū)人口的葉酸攝入量達(dá)不到這一標(biāo)準(zhǔn)，葉酸缺乏成為影響發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家的全球性健康問題之一［3］。藥劑補(bǔ)充和作物葉酸強(qiáng)化是目前解決葉酸缺乏問題的兩種有效途徑，前者對于偏遠(yuǎn)和貧窮地區(qū)的發(fā)展中國家來說難以實(shí)現(xiàn)。因此，通過對作物葉酸合成代謝途徑的調(diào)控來提高作物中葉酸含量，成為解決葉酸攝入不足的新興選擇［4］。該研究綜述了葉酸的結(jié)構(gòu)與功能、葉酸的生物合成途徑、葉酸的提取與檢測技術(shù)及不同作物葉酸生物強(qiáng)化研究進(jìn)展，并對解決葉酸缺乏問題進(jìn)行展望。

1 葉酸的功能

1.1 葉酸缺乏與人類疾病

維持體內(nèi)一定的葉酸水平對人類健康非常重要。人體葉酸缺乏可能誘發(fā)神經(jīng)管缺陷、心血管疾病、癌癥和其他出生缺陷等重要疾?。?］，但產(chǎn)生疾病的生化原理和發(fā)育機(jī)制還尚不清楚。

神經(jīng)管缺陷（neural tube defects，NTDs）是全球常見的胎兒畸形之一，其中脊柱裂和無腦畸形最為嚴(yán)重［6］。NTDs在全球孕婦中的發(fā)病率為0.5%～2.0%，我國是神經(jīng)管畸形的高發(fā)區(qū)。我國2001—2004年NTDs發(fā)病率達(dá)0.11%［7］，在一些不發(fā)達(dá)國家的農(nóng)村地區(qū)，新生兒NTDs比例可達(dá)到4.80%［8］。據(jù)一項(xiàng)全球性新生兒出生缺陷報(bào)告顯示，世界上每年有30萬名新生兒患NTDs［9］。若孕婦孕前每天服用400 μg葉酸，可降低70%的NTDs發(fā)生率［10］。另外，葉酸的缺乏還會引起一系列神經(jīng)認(rèn)知退行性疾病，如阿爾茨海默病和其他形式的智能障礙綜合征。Ramos等［11］指出紅細(xì)胞的葉酸水平與人的認(rèn)知能力直接相關(guān)且與老年癡呆的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)，而葉酸可以通過改善甲硫氨酸代謝產(chǎn)物、外周血炎癥因子水平及DNA甲基化途徑來改善認(rèn)知功能。

研究發(fā)現(xiàn)，血漿的同型半胱氨酸是導(dǎo)致心梗和心血管疾病的危險(xiǎn)因素［12］，人體葉酸缺乏可能導(dǎo)致甲硫氨酸的生成受阻，進(jìn)而引起血漿同型半胱氨酸濃度升高；當(dāng)增加葉酸后甲硫氨酸循環(huán)又可繼續(xù)進(jìn)行，使血漿同型半胱氨酸濃度降低［13］。

大量研究都證實(shí)了葉酸與大多數(shù)疾病包括癌癥密切相關(guān)，Choi［14］和潘慧穎等［15］發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏和葉酸依賴性酶的多態(tài)性可能引起卵巢功能受損和直腸癌等癌癥風(fēng)險(xiǎn)上升。

研究表明，葉酸缺乏也會對視覺系統(tǒng)和骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生影響，造成營養(yǎng)性視弱和骨骼肌發(fā)育障礙等疾?。?6］。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，巨成紅細(xì)胞貧血的疾病機(jī)制與葉酸缺乏有關(guān)［6］。因此，葉酸對于人體的生長發(fā)育是不可或缺的。

1.2 葉酸在植物中的作用

四氫葉酸（tetrahydrofolic，THF）及其衍生物作為一碳單位的供體和受體，是參與C1轉(zhuǎn)移反應(yīng)的重要輔酶，參與了生物體內(nèi)許多重要的生命過程，如在嘌呤、胸苷酸、氨基酸及蛋白質(zhì)的合成及甲基化循環(huán)等過程中葉酸均發(fā)揮重要作用［17］。在植物中，葉酸的一碳單位衍生物參與蝶啶和胸苷酸的形成以合成DNA；同時(shí)也通過參與絲氨酸、甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化以在光呼吸中發(fā)揮重要作用［18］；另外，Pribat等［19］通過研究揭示了四氫蝶呤或10-甲酰四氫葉酸（10-formyltetrahydrofolate，10-F-THF）與芳香族氨基酸代謝之間新的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸通過S-腺苷甲硫氨酸與甲基化過程相聯(lián)系實(shí)現(xiàn)甲基化循環(huán)［20］，并通過甲基化循環(huán)為甜菜堿的生成提供一碳基團(tuán)。此外，葉酸合成的中間代謝產(chǎn)物對氨基苯甲酸（p-aminobenzoate，p-ABA）的前體物分支酸可通過苯丙氨酸參與木質(zhì)素的合成［21］。因此，在植物體中，葉酸對于

光呼吸以及木質(zhì)素、甜菜堿、葉綠素的生物合成也發(fā)揮著重要的作用。

此外，葉酸在植物體內(nèi)的新功能陸續(xù)被揭示。Lin等［22］ 、Malhotra等［23］發(fā)現(xiàn)葉酸分子中的蝶啶環(huán)及葉酸衍生物在依賴葉酸的光裂合酶和隱花色素輔酶作用下起光能捕獲天然色素的作用。Webb等［24］研究發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)葉酸衍生物的含量及分布狀況會對整個植物的甲基化循環(huán)和葉綠素合成產(chǎn)生影響。Storozhenko等［25］發(fā)現(xiàn)，葉酸含量還與氧化逆境耐受性之間可能存在某種關(guān)系。

綜上所述，葉酸在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可替代的作用，但關(guān)于葉酸在植物體內(nèi)的深入研究仍需進(jìn)一步挖掘。

2 葉酸的結(jié)構(gòu)與生物合成途徑

2.1 葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)

葉酸分子由蝶啶、對氨基苯甲酸和一個單（多）谷氨酸尾（Glu）3部分組成。蝶啶與p-ABA由一個亞甲基相連，p-ABA又通過γ肽鍵與一個或多個L型谷氨酸相連。理論上，葉酸分子有150多種存在形式［26］，但目前在動植物組織中僅發(fā)現(xiàn)不到50種［27］。不同氧化水平的一碳單位（甲基、甲?；喖谆龋┛梢栽谌~酸代謝相關(guān)酶的作用下連接到蝶啶的N5或p-ABA的N10位置，形成不同形式的葉酸衍生物。不同一碳取代基也可經(jīng)酶促反應(yīng)相互轉(zhuǎn)化，用于各種代謝反應(yīng)的C1基團(tuán)供體［28］，在不同的代謝途徑中發(fā)揮不同的功能。蝶啶環(huán)有完全氧化、部分氧化及完全還原3種形式，所對應(yīng)葉酸形式分別為蝶酰谷氨酸、二氫葉酸（dihydrofolate，DHF）和四氫葉酸［27］。葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

2.2 葉酸的合成途徑

2.2.1 葉酸的合成。

葉酸存在于植物細(xì)胞的線粒體、細(xì)胞質(zhì)、液泡和質(zhì)體中，其合成代謝途徑極其保守。植物和微生物中葉酸的合成途徑類似，蝶啶環(huán)和對氨基苯甲酸先分別在其細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)體中合成，隨后二者進(jìn)入線粒體，與谷氨酸組成形成完整的葉酸分子，具體的葉酸合成途徑如圖2所示。

在植物中，蝶啶在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以尿苷三磷酸（GTP）為底物，在GTP環(huán)化水解酶I（GCHI）的作用下生成二氫新蝶呤三磷酸（DHN-P3），DHN-P3在三磷酸二氫新蝶呤焦磷酸水解酶（DHNTP）的作用下生成二氫新蝶呤一磷酸（DHN-P），再經(jīng)非特異性磷酸酶去磷酸化后生成二氫新蝶呤（DHN）。DHN經(jīng)二氫新蝶呤醛縮酶（DHNA）催化生成6-羥甲基二氫蝶呤（HMDHP）并進(jìn)入線粒體。接著，進(jìn)入線粒體的HMDHP在HMDHP焦磷酸激酶（HPPK）的催化下生成6-羥基二氫蝶呤焦磷酸（HMDHP-P2）。對氨基苯甲酸（p-ABA）的合成是在質(zhì)體中以分支酸（Chorismate）為底物開始，通過氨基酸脫氧分支酸合成酶（ADCS）催化形成氨基酸脫氧分支酸（ADC），再經(jīng)氨基酸脫氧核苷酸裂解酶（ADCL）催化形成p-ABA進(jìn)入線粒體。HMDHP-P2和p-ABA在二氫蝶酸合成酶（DHPS）的作用下生成二氫蝶酸（DHP）。DHP與谷氨酸（Glu）在線粒體內(nèi)的二氫葉酸合成酶（DHFS）的作用下生成二氫葉酸（DHF），最后，DHF在二氫葉酸還原酶（DHFR）的作用下被還原成單谷氨酸尾的四氫葉酸（THF）［29］。

2.2.2 葉酸的多聚谷氨酸化。

線粒體內(nèi)合成的THF被轉(zhuǎn)運(yùn)至其他細(xì)胞器中，由葉酰多聚谷氨酸合成酶（FPGS）催化更多的谷氨酸殘基逐一連接到葉酸中谷氨酸的γ位，形成具有多谷氨酸尾的THF。在模式植物擬南芥中，F(xiàn)PGS有3種異構(gòu)體，分別位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體3個細(xì)胞器中行使加尾功能［30］。

自然形式的葉酸主要以多聚谷氨酸形式存在，葉酸的谷氨酸鏈長度在1～14，其隨著葉酸所處細(xì)胞或細(xì)胞器的不同而不同。單谷氨酸葉酸是葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所偏愛的形式，多谷氨酸葉酸則是參與一碳代謝的葉酸依賴型酶所偏愛的形式［31］。多尾形式的葉酸傾向于與蛋白質(zhì)結(jié)合，穩(wěn)定了葉酸的狀態(tài)，同時(shí)可以降低多谷氨酸葉酸被γ-谷氨酰水解酶（GGH）水解的速率［32］。在植物中，谷氨酸尾長度越長，與其結(jié)合的酶的活性就越高，如甲硫氨酸合成酶、甘氨酸脫羧酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶等［27］。同時(shí)也有研究表明，多聚谷氨酸形式對葉酸的區(qū)室化和依賴葉酸的代謝過程如光呼吸、泛酸和蛋氨酸的合成十分重要［33］。多聚谷氨酸鏈的長度變化可能存在著一定的生理作用，但其在不同生物中存在變化的原因還尚不明確［34］。

3 葉酸的測定

3.1 植物中葉酸的提取方法

植物性食品原料中葉酸含量較低，且受植物種類、收獲季節(jié)、種植氣候及采后處理等因素的影響［35］。由于葉酸極不穩(wěn)定，易在光、熱和氧氣中降解，因此試驗(yàn)操作均應(yīng)在暗光下進(jìn)行，提取與測定過程中的玻璃儀器應(yīng)為棕色，并在提取液中加入抗氧化劑。另外，由于葉酸被埋在基質(zhì)中而不利于提取，且許多生物材料含有內(nèi)源性共軛酶和能夠引起各種形式的葉酸衍生物相互轉(zhuǎn)化及分布變化的酶，進(jìn)而影響了葉酸測定［36］，因此研究植物葉酸的提取與測定具有一定的挑戰(zhàn)性。

目前，提取葉酸的方法主要有化學(xué)法和酶解法。化學(xué)法是利用葉酸在中性或堿性溶液中溶解度高和穩(wěn)定性強(qiáng)的特性，常采用熱偏磷酸浸提法進(jìn)行提?。?7］，如小米中葉酸的提?。?8］?；瘜W(xué)法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、條件易控制且成本較低。酶解法則是利用葉酸軛合酶、蛋白酶和淀粉酶等聯(lián)合處理樣品，使與蛋白質(zhì)、淀粉等相結(jié)合的葉酸充分水解出來［39］。葉曉利等［40］通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化化學(xué)法磷酸鹽溶液提取玉米葉酸的最佳條件為溫度42 ℃、料液比1∶11.7（g∶mL）、活性炭用量1.2 g、提取時(shí)間7.3 h，且各因素對玉米籽粒中葉酸提取的影響為溫度>料液比>時(shí)間。王博倫等［41］發(fā)現(xiàn)了一種利用酶解法優(yōu)化玉米中5-甲基四氫葉酸（5-methyl-tetrahydrofolate，5-M-THF）的提取方法，評價(jià)了高效液相色譜法（HPLC）測定玉米中5-M-THF含量的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，優(yōu)化最佳提取參數(shù)為葉酸提取液pH為6.5，蛋白酶、α-淀粉酶、大鼠血清的添加量分別為0.028、12.000、14.000 μL/mL，固相萃取凈化柱收集洗脫液2.5 mL，樣品加標(biāo)平均回收率為104.57%。優(yōu)化后的HPLC條件適用于測定玉米中5-M-THF與總?cè)~酸含量。另外，郭文柱［42］指出，三酶法包括了多谷氨酸尾的水解，若提取的目標(biāo)化合物為多谷氨酸葉酸，二酶法（蛋白酶、α-淀粉酶）效果更佳，并發(fā)現(xiàn)玉米籽粒加入0.48～0.72 U/mg的α-淀粉酶，加入0.002 1～0.002 8 U/mg的蛋白酶效果最優(yōu)。但是有一些學(xué)者僅僅用葉酸軛合酶處理谷物樣品，其得到的結(jié)果卻比與用3種酶處理的偏高，這可能是因?yàn)楣任锏娜柑幚韺?dǎo)致葉酸的損失，由于萃取液的不穩(wěn)定性和不良峰形的影響，不能準(zhǔn)確測定出葉酸的含量［43］。

3.2 葉酸的檢測方法

各種天然食品中存在的不同形式葉酸的分析和檢測技術(shù)取得一定進(jìn)展。檢測葉酸的方法主要有：微生物法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光法和電化學(xué)法等。測定食品中葉酸含量的標(biāo)準(zhǔn)方法為微生物法，通常所用的微生物有鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus（ATCC 7469）及糞鏈球菌Streptococcus faecalis（ATCC8043）。國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.211—2014）中選用的微生物為鼠李糖乳桿菌［28］。微生物法適用范圍較廣，但局限于樣品中總?cè)~酸含量的測定，無法單獨(dú)測定不同葉酸衍生物的含量。HPLC彌補(bǔ)了這一缺點(diǎn)，基于不同葉酸衍生物與色譜柱親和能力的差異，利用流動相對目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫，可將樣品中THF、5-M-THF、5-F-THF（5-Formyltetrahydrofolate）、10-F-THF、DHF等分離，進(jìn)而測定不同形式葉酸的含量［36，44］。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）測定食品中葉酸的方法近年也開始迅速發(fā)展，其優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)快速地測定出數(shù)種不同葉酸形式及不同尾數(shù)谷氨酸形式的葉酸含量［36］，且與HPLC相比，LC-MS具有更高的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，但質(zhì)譜在定量準(zhǔn)確性方面低于HPLC，且設(shè)備及日常維護(hù)費(fèi)用較高。另外，研究者們利用電化學(xué)法和熒光法可測定出食品或復(fù)合維生素制劑中葉酸的含量［45-46］，但相對來說測定葉酸的形式較為單一［47］。綜上可知，每種測定方法的應(yīng)用各不相同，主要根據(jù)檢測葉酸樣品的種類來決定。

4 作物中葉酸強(qiáng)化的研究進(jìn)展

強(qiáng)化作物中葉酸含量一般從兩種途徑出發(fā)，一是提高作物食用部分葉酸的生物利用率及減少葉酸降解，如改變食品加工方式，研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵后的谷物與浸泡過的豆類食品中葉酸含量顯著增加［48-50］。二是提高食物中葉酸的水平。近幾十年來，通過植物育種、基因工程、代謝工程等手段鑒定葉酸積累關(guān)鍵調(diào)控基因以及優(yōu)良等位變異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)作物葉酸生物強(qiáng)化成為一種解決葉酸缺乏現(xiàn)狀的重要途徑。

4.1 基因工程

在利用基因工程加強(qiáng)葉酸生物合成方面，可通過提高葉酸合成支路中關(guān)鍵酶的基因轉(zhuǎn)錄水平來增加葉酸含量，也可通過降低GGH的活性來減少葉酸的降解。GCHI和ADCS是葉酸合成通路中2種重要的酶。研究表明，同時(shí)過表達(dá)GCHI和ADCS會比單獨(dú)過表達(dá)其中1個基因?qū)μ嵘~酸含量的效應(yīng)更高［25］。只有當(dāng)兩者共同表達(dá)，使蝶啶和p-ABA含量同時(shí)增加，才能使葉酸含量顯著增加。其他葉酸合成途徑的酶也會引起葉酸含量的改變，擬南芥和各作物的葉酸代謝基因工程研究匯總結(jié)果見表1。

4.1.1 水稻。

水稻是我國及世界重要的糧食作物，但其米粒尤其是經(jīng)蒸煮加工后的大米葉酸含量極低，不能滿足人體的葉酸需求。在水稻的葉酸生物強(qiáng)化研究中，Storozhenko等［25］研究發(fā)現(xiàn)，僅表達(dá)AtGCHI的水稻株系中蝶啶含量提高25倍但葉酸含量未發(fā)現(xiàn)提高，僅過表達(dá)AtADCS的水稻株系p-ABA含量提高49倍且葉酸含量提高6倍，同時(shí)過表達(dá)AtGCHI和AtADCS的水稻株系中葉酸含量達(dá)到野生型對照的100倍，說明通過過表達(dá)ADCS提高p-ABA含量對于葉酸含量的提升至關(guān)重要。Blancquaert等［20］的研究也支持該結(jié)果。Gillies等［56］在水稻中過表達(dá)小麥TaHPPK/TaDHPS，發(fā)現(xiàn)株系葉片葉酸含量增加75%，籽粒葉酸增加40%。董薇［34］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AtGCHI、AtADCS、AtDHFS和AtFPGS，葉酸含量分別增加3.7～6.1倍、1.5～1.8倍、14.5%～27.2%和7.5%～19.9%，但轉(zhuǎn)AtDHNA或AtADCL的轉(zhuǎn)基因水稻株系中葉酸含量下降。Blancquaert等［65］研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)OsGCHI和OsADCS的轉(zhuǎn)基因水稻中同時(shí)過表達(dá)線粒體和細(xì)胞質(zhì)定位的AtFPGS和牛來源的FBP，可以獲得比野生型葉酸含量高出150倍的水稻株系，這是因?yàn)槿~酸與FBP形成的化合物可以提高轉(zhuǎn)基因水稻中四氫葉酸的穩(wěn)定性［69］。

4.1.2 玉米。

玉米作為世界主要糧食作物之一，其葉酸合成相關(guān)基因和生物強(qiáng)化仍處于起步階段且相關(guān)研究十分有限。已有的研究中，在玉米中過表達(dá)編碼GCHI的大腸桿菌folE基因使得玉米籽粒葉酸含量增加了2倍［57］，聯(lián)合過表達(dá)大豆來源的GmGCHI/GmADCS使得葉酸含量增加了4.2倍。同時(shí)，連通［70］研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白序列上，玉米籽粒中葉酸合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平與葉酸含量積累水平之間無明顯相關(guān)性，表明玉米籽粒發(fā)育過程中的葉酸積累較為復(fù)雜，其調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

4.1.3 番茄。

De La Carza等［52］研究發(fā)現(xiàn)，將哺乳動物小鼠的GCHI轉(zhuǎn)入番茄中，蝶啶和葉酸的含量分別提高了140倍和2倍，將小鼠GCHI轉(zhuǎn)入番茄中并施加外源性p-ABA，葉酸含量提高了10倍。接著，將番茄中的GCHI和ADCS基因過表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)葉酸含量增加了25倍，這表明只有同時(shí)提高蝶啶和p-ABA的含量才能使葉酸含量增加。另外，也有研究證實(shí)，將番茄液泡中的LeGGH的含量提高3倍，可使葉酸含量下降46%［59］。

4.1.4 擬南芥和煙草。

在擬南芥的葉酸生物強(qiáng)化相關(guān)研究中，人們發(fā)現(xiàn)不同來源的GCHI和ADCS使蝶啶和p-ABA含量以不同的倍數(shù)增加。如Hanson等［51］將大腸桿菌中的GCHI編碼基因folE轉(zhuǎn)入擬南芥，其蝶啶和葉酸的含量分別增加了1 250倍和2～4倍；而姚琳［61］將大豆來源的GmGCHI和聯(lián)合GmGCHI/GmADCS分別在擬南芥中過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉酸的含量分別增加了57%和111%，這與汪冉冉［63］的試驗(yàn)結(jié)果類似。Akhtar等［59］在擬南芥將GGH的表達(dá)量提高3倍，使得葉酸含量減少39%，而通過RNAi減少GGH表達(dá)，會使多聚谷氨酸尾增加，導(dǎo)致擬南芥中葉酸含量增加34%。

除葉酸合成途徑中GCHI、ADCS和GGH 3種主要的酶外，有學(xué)者在模式植物中展開了對其他酶如5-FCL、DHPS、PTR1的研究。5-FCL是合成葉酸主要形式5-F-THF的重要酶之一，但5-F-THF會抑制其他葉酸依賴性酶的合成。Goyer等［53］通過抑制擬南芥中5-FCL使得其葉酸含量增加了2倍。梁業(yè)紅等［54］利用過表達(dá)細(xì)菌來源的DHPS使得葉酸含量提高45%，證實(shí)了DHPS在葉酸合成途徑中的調(diào)控作用。鹿曄等［60］通過利用組成型啟動子驅(qū)動依賴NADPH的利什曼原來源PTR1在擬南芥和煙草中進(jìn)行過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因PTR1的擬南芥5-F-THF含量增加，轉(zhuǎn)基因PTR1的煙草中5-M-THF含量增加。除此之外，陳金鳳等［64］為了研究葉酰聚谷氨酸合成酶DFB對其同工酶DFC的彌補(bǔ)作用，在擬南芥DFC突變體中過表達(dá)AtDFB，使得葉酸增加了90%～116%，進(jìn)而驗(yàn)證了DFB對DFC缺失的彌補(bǔ)作用。

4.1.5 其他物種。

在小麥中，研究發(fā)現(xiàn)分別過表達(dá)大豆來源的GmGCHI/GmADCS，可使葉酸含量提高62%～230%，但過表達(dá)密碼子優(yōu)化的GmGCH/GmADCS可使小麥葉酸含量提高5.6倍［63］。在生菜和菜豆中，分別過表達(dá)雞和擬南芥來源的GCHI，使葉酸含量分別增加2.1～8.5倍和3.0倍，但在過表達(dá)AtGCHI和過表達(dá)AtGCHI/ADCS的馬鈴薯中葉酸含量無顯著變化［58，62，66］。因此，在不同的植物中過表達(dá)相同的葉酸合成代謝酶，葉酸的含量變化存在差異。

在轉(zhuǎn)錄水平，馬貴芳等［71］根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果揭示了ADCS、DHFR2 和GGH基因是谷穗葉酸積累的關(guān)鍵基因。張玖漪等［72］發(fā)現(xiàn)，在菠菜中除 SoGCHI、SoADCS和SoGGH外，大部分葉酸合成代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)量與菠菜葉酸總含量沒有明顯的規(guī)律性。在黃瓜中，周琪等［73］發(fā)現(xiàn)CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA和CsADCS是影響黃瓜果實(shí)葉酸含量變化的關(guān)鍵基因，GCHI和ADCS是調(diào)控葉酸合成限速步驟的關(guān)鍵酶基因且功能相對保守。

綜上所述，同時(shí)過表達(dá)GCHI基因和ADCS基因會使葉酸含量顯著增加，但在相同作物中過表達(dá)不同來源的2個基因或在不同作物中過表達(dá)相同來源的2個基因結(jié)果導(dǎo)致葉酸增加比例不同，說明在不同植物中相同的酶可能發(fā)揮作用程度不同。另外，過表達(dá)HPPK、DHPS、DHFS、FPGS、DFB、GGHRNAi基因也會使作物中葉酸含量呈不同比例增加，但過表達(dá)GGH會使葉酸含量下降。這說明提高葉酸合成途徑中相關(guān)酶的編碼基因的表達(dá)或降低葉酸降解相關(guān)酶的編碼基因的表達(dá)對葉酸含量的提高存在著巨大潛力。因此，雖然已成功運(yùn)用一些工程策略來提高葉酸含量，但不同作物中葉酸的代謝途徑較為復(fù)雜，未來仍需對其進(jìn)行更深入的研究。

4.2 利用自然變異

由于公眾對于利用基因工程技術(shù)來提高葉酸含量的接受度相對較低，有研究者開始通過現(xiàn)代育種手段來改善農(nóng)作物中微量元素的含量。分子育種技術(shù)是生物強(qiáng)化的一種行之有效的途徑，利用分子育種可以創(chuàng)制微量營養(yǎng)素強(qiáng)化作物，進(jìn)而改善人們部分營養(yǎng)素缺乏現(xiàn)狀。

通過育種手段進(jìn)行葉酸生物強(qiáng)化的前提是葉酸含量在目標(biāo)物種中存在著足夠大的表型變異，進(jìn)而可從群體中找到影響表型的數(shù)量性狀位點(diǎn)。董薇［34］通過QTL定位在重組自交系群體和回交群體中鑒定出3個與水稻葉酸含量相關(guān)的QTL（qFC-3a、qFC-3b和qFC-3c），貢獻(xiàn)率分別為7.8%、11.1%～15.8%和24.8%。Shahid［74］對524份對不同種質(zhì)糙米中葉酸含量進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，針對5-M-THF、5-F-THF、THF和總?cè)~酸4種成分含量性狀確定了16個顯著關(guān)聯(lián)SNP，并初步確定了16個葉酸含量候選基因。郭文柱［42］利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了玉米籽粒中與5-F-THF含量變異顯著關(guān)聯(lián)基因ZmGFT1，并在該基因上發(fā)現(xiàn)2個顯著SNP位點(diǎn)，可以解釋5-F-THF含量變異的27.6%。接著對GFT1基因進(jìn)行擴(kuò)增重測序分析和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)了4個位于該基因5′UTR顯著關(guān)聯(lián)的InDel功能位點(diǎn)，并通過構(gòu)建分離群體定位QTL與該基因的遺傳變異互相印證。潘廣磊等［75］通過對玉米GFT1基因的功能SNP位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在3種類型的等位基因變異，即GGG、CAA、GAA，基因型為GGG的玉米中籽粒葉酸含量顯著高于基因型為GAA的玉米。根據(jù)功能SNP位點(diǎn)開發(fā)的CAPS標(biāo)記GFT1-2，能準(zhǔn)確鑒定GFT1的基因型。同時(shí)趙桐等［76］也通過五引物擴(kuò)增受阻突變體系（penta-primer amplification refractory mutation system，PARMS）識別到GGG基因型玉米材料的平均葉酸含量顯著高于GAA和CAA 2種基因型。

目前，在作物中利用全基因組關(guān)聯(lián)分析或QTL定位來尋找與葉酸性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)的研究還相對較少，未來可以通過該途徑尋找相應(yīng)的變異位點(diǎn)，并進(jìn)行進(jìn)一步研究，為培育高葉酸作物品種打下分子基礎(chǔ)。

5 展望

隨著生活水平的提高，人們越來越重視葉酸缺乏的問題，葉酸生物強(qiáng)化也成為一個研究熱點(diǎn)。目前，對植物體內(nèi)葉酸的合成代謝途徑已基本闡述清楚，然而，葉酸合成代謝的調(diào)控機(jī)理方面的研究還鮮有報(bào)道。研究者們已經(jīng)在水稻和番茄等作物中通過基因工程手段提高葉酸含量，但此方法在其他作物中的應(yīng)用仍待進(jìn)一步研究。首先，后續(xù)研究可從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和代謝水平3個層次對不同作物的不同組織器官進(jìn)行分析，這將有助于準(zhǔn)確找到葉酸生物強(qiáng)化的突破點(diǎn)。其次，應(yīng)加強(qiáng)對現(xiàn)有植物種質(zhì)資源的挖掘，通過關(guān)聯(lián)分析和連鎖分析，挖掘植物中調(diào)控葉酸的新基因，結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種，將優(yōu)良等位變異快速導(dǎo)入具有其他優(yōu)良農(nóng)藝性狀的親本中，縮短育種周期、提高育種效率。最后，可利用動物飼喂試驗(yàn)測試葉酸生物強(qiáng)化的效果，闡明葉酸生物強(qiáng)化育種與人類健康的具體關(guān)系，明確不同葉酸衍生物對人體健康的影響，上述問題的回答將對人類的營養(yǎng)健康產(chǎn)生積極的影響。

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