基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討天花粉治療肺癌的作用機制

崔啟迪 孫杉杉 陸梅 黃燕瑛 呂文文

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，濱州 256603

天花粉（radix trichosanthis）為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim. 或雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，味甘、微苦，性微寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿的功效，可用于熱病煩渴、肺熱燥咳、內(nèi)熱消渴、瘡瘍腫毒的治療［1］。研究表明，天花粉的有效成分主要包括蛋白質(zhì)、淀粉、植物凝血素、多糖、皂苷等，具有抗腫瘤、引產(chǎn)抗孕、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、治療缺血性腦損傷、降血糖、抗炎、抗病毒等作用［2-3］。肺癌是最常見的惡性腫瘤，直至2020年，中國新發(fā)肺癌病例數(shù)為82萬例，死亡病例數(shù)為71 萬例，均位于中國癌癥新發(fā)病例和死亡病例首位［4］。肺癌現(xiàn)已成為我國發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，然而肺癌的治療仍以手術(shù)治療、放療和化療為主。肺癌發(fā)病機制復(fù)雜，傳統(tǒng)治療方法效果有限，不良反應(yīng)明顯［4］，尋求新的治療方法迫在眉睫。中藥因其治療腫瘤的獨特優(yōu)勢越來越受到重視，中醫(yī)治療肺癌的機制主要包括提高機體免疫功能、改善血流變學(xué)及微循環(huán)、抑制腫瘤新生血管形成和誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡［5］。中醫(yī)運用扶正祛邪法治療肺癌1 例，腫塊消除，3 個月后隨訪，未見復(fù)發(fā)［6］。周仲瑛教授從“復(fù)法大方”辨治肺癌1例，采用復(fù)法組合，多藥雜呈，邪正兼顧，以縮小腫瘤、取得良效［7］。上述方法均取得明顯效果，然而具體的作用機制尚不明確［6-7］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)的理論為基礎(chǔ)，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，運用網(wǎng)絡(luò)分析來系統(tǒng)綜合地研究藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，由此展現(xiàn)出藥物作用的一門新興學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在方法學(xué)上的特點為集整體、動態(tài)、分析于一體，與中醫(yī)的整體觀和辨證論治的原則相一致，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析中藥及其復(fù)方的多成分、多靶點、多途徑協(xié)同作用［8］。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究天花粉治療肺癌的作用機制，同時為之后的實驗以及臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.收集與篩選天花粉活性成分

檢索時限為建庫至2022年7月。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）［9］中檢索“天花粉”，獲得天花粉的化學(xué)成分，以化合物的藥動力學(xué)參數(shù)中口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，篩選天花粉的有效活性成分。在中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）（http：//47.100.169.139/tcmid/）［10］中檢索“TIANHUAFEN”，得到天花粉化學(xué)成分后根據(jù)Lipinski 五規(guī)則方法進行篩選，Lipinski 五規(guī)則包括相對分子量小于500、脂水分配系數(shù)（ClogP）小于5、氫鍵給體數(shù)目小于5、氫鍵受體數(shù)目小于10、化合物中可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量小于10［11-12］。查閱相關(guān)文獻［13-15］，回收具有抗癌活性但因不符合條件而被刪除的化學(xué)成分。

2.收集天花粉活性成分作用靶點

整理TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出的活性化合物作用的靶點，運用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）［16］將藥物的靶蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名，再將TCMID 數(shù)據(jù)庫中篩選出來的活性成分所對應(yīng)的靶點整理歸納。然后，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［17］獲取天花粉所有活性成分的canonical SMILES 結(jié)構(gòu)，將其輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction. ch/）［18］預(yù)測靶點，選取可能性（probability）＞0 并且可能性排名位于前15 的靶點。將3 種途徑獲取的靶點整合，去重。

3.收集肺癌疾病靶點

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）［19］、DrugBank 數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.com/）［20］、人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫（OMIM）（https：//omim.org/）［21］和TTD 數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）［22］中以“l(fā)ung cancer”作為關(guān)鍵詞進行搜索，得到肺癌相關(guān)靶點。將以上4 個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點歸納整理并去重。

4.構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

利用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）［23］對肺癌疾病靶點和天花粉活性成分作用靶點取交集，獲得交集基因，并繪制韋恩圖。通過String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）［24］，選擇Multiple Proteins 選項，Organism選擇為Homo Sapiens，獲得交集基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，以TSV 格式保存文件并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進行分析，以連接度（degree）值為依據(jù)篩選核心靶點。

5.基因本體（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

運用Metascape 數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html）［25］對交集基因進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

6.構(gòu)建“藥物-靶點-通路-疾病”與“藥物-化合物-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)

運用Cytoscape 3.8.2 軟件，構(gòu)建藥物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點分別代表藥物、化合物、靶點、通路及疾病，連線表示節(jié)點間的相互作用。

7.分子對接驗證

從PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)鍵小分子化合物的3D 結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，運用Open Babel軟件轉(zhuǎn)化為pdb格式；從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（PDB）數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點蛋白的3D 結(jié)構(gòu)圖，利用PyMOL 軟件去水，去配體。運用AutoDock 軟件進行分子對接，并用PyMOL軟件將對接結(jié)果可視化。

結(jié)果

1.天花粉的活性成分

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，按照OB≥30%、DL≥0.18 條件進行篩選，得到2 種天花粉的活性成分，為菠菜甾醇（spinasterol）和仙人掌甾醇（schottenol）；查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)［13-15］，葫蘆素B（cucurbitacin B）雖不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，但已被證實具有較好的抗腫瘤活性，因此，將該化學(xué)成分也納入其中。見表1。檢索TCMID 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)Lipinski 五規(guī)則篩選得到活性成分25種（表2）。共計得到28種活性成分。

表1 天花粉活性成分（TCMSP數(shù)據(jù)庫）

表2 天花粉活性成分（TCMID）

2.活性成分作用靶點

通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫和TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫收集活性成分的靶點，一共獲得314個靶點，去重后為201個。

3.肺癌疾病靶點

通過檢索GeneCards 數(shù)據(jù)庫，選取score≥20 分的靶點，得到798 個疾病靶點；檢索OMIM、DrugBank 和TTD 數(shù)據(jù)庫分別獲得908、17和158個肺癌相關(guān)靶點。通過標(biāo)準(zhǔn)化并去重后共獲得肺癌相關(guān)靶點1 645個。

4.PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選

利用Venny 2.1 將獲得的天花粉活性成分靶點與肺癌靶點取交集并繪制韋恩圖，得到天花粉與肺癌共同靶點37 個（圖1）。將交集靶點提交至String 平臺，得到交集靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2）。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進行分析，獲得靶點degree 值。degree 表示靶點連接的邊的數(shù)目，數(shù)值越大，說明該靶點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性越高。分析PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點degree值，計算出平均值為8.167，以degree值大于平均值為篩選條件，由此獲得關(guān)鍵靶點共13 個（表3）。這些關(guān)鍵靶點可能在天花粉治療肺癌中具有重要作用。

圖1 天花粉（radix trichosanthis）治療肺癌（lung cancer）交集靶點韋恩圖

圖2 天花粉治療肺癌交集靶點蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

表3 天花粉治療肺癌的關(guān)鍵靶點

5.GO和KEGG富集分析

將交集基因上傳至Metascape 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，設(shè)置顯著性（P值）的界值為0.01，選擇生物過程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、細胞組成（Cellular Components）、KEGG 通路（KEGG Pathway）進行富集分析。將分析結(jié)果分別保存至Excel文件中，按照P值進行排序。

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，其主要參與的生物過程為腺體發(fā)育、細胞增殖的調(diào)控、分解代謝過程的負性調(diào)控、炎癥反應(yīng)、細胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、細胞黏附的調(diào)節(jié)、細胞對白細胞介素6 的反應(yīng)、DNA 損傷刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白細胞遷移的負性調(diào)控、細胞內(nèi)類固醇激素受體信號通路的調(diào)控、免疫系統(tǒng)過程的負性調(diào)控等；主要細胞組分即靶點所在的細胞位置為細胞質(zhì)核周區(qū)、線粒體膜、核膜、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、軸突、膜筏等；主要分子功能為調(diào)控血紅素結(jié)合、核受體活性、激酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、激素結(jié)合、雙加氧酶活性、蛋白質(zhì)N 末端結(jié)合、電子轉(zhuǎn)移活性、核受體結(jié)合、裂解酶活性、信號受體調(diào)節(jié)劑活性、肽酶活性等。見圖3。count值代表富集在該生物過程或者功能上的基因數(shù)，count 值越大，富集的基因數(shù)目越多。

圖3 天花粉治療肺癌交集靶點基因本體（GO）富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，天花粉治療肺癌的靶點主要涉及化學(xué)致癌受體激活、癌癥通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號通路、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥、癌癥中的微RNA、癌癥中的蛋白聚糖、程序性死亡受體配體1（PD-L1）在癌癥中的表達和程序性死亡受體1（PD-1）檢查點通路等信號通路，依據(jù)P值選取排名前20 位的通路繪制氣泡圖，見圖4。其中，圓點由小到大代表分值逐漸升高，靶點富集數(shù)目增多，通路顯著性增強；顏色由藍到紅代表-log10（P-value）值逐漸增大，P值逐漸減小。

圖4 天花粉治療肺癌交集靶點京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析

6.“藥物-靶點-通路-疾病”與“藥物-化合物-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.8.2 構(gòu)建天花粉治療肺癌的藥物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，藥物、靶點、通路與疾病之間的相互網(wǎng)絡(luò)見圖5。其中綠色方形代表天花粉，藍色圓形代表靶點，黃色菱形代表通路，紅色方形代表疾病。利用Network Analyzer 插件對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，獲得節(jié)點degree 值，根據(jù)degree 值判斷節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，結(jié)果Chemical carcinogenesis - receptor activation 通路，BCL2 靶點和Pathways in cancer 通路的degree 值最高，分別為15、14、14，說明其在該生物網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用。

圖5 天花粉治療肺癌的藥物-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

運用Cytoscape 3.8.2 軟件構(gòu)建天花粉的藥物-化合物-交集靶點的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。其中紅色方形代表天花粉，藍色菱形代表化合物，橙色圓形代表靶點。對該網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，獲得節(jié)點degree 值，發(fā)現(xiàn)仙人掌甾醇、菠菜甾醇的degree 值最高，為7，推測此2 種成分可能為天花粉治療肺癌的關(guān)鍵小分子化合物。

圖6 天花粉藥物-化合物-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖

7.分子對接

將活性成分菠菜甾醇和仙人掌甾醇分別與核心靶點雌激素受體1（ER1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、孕激素受體（PGR）、CXC 趨化因子配體8（CXCL8）、多聚腺苷酸轉(zhuǎn)移酶1（PARP1）進行分子對接，AutoDock軟件對接結(jié)果見表4。通常認為，蛋白質(zhì)與化合物之間的結(jié)合能數(shù)值＜0，說明二者能夠自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能數(shù)值越低，二者的親和力越強。分子對接結(jié)果顯示，菠菜甾醇和仙人掌甾醇與蛋白的結(jié)合能均＜-7 kJ/mol，表明具有較好的結(jié)合活性。其中，2種活性成分與PARP1靶點的結(jié)合能最低，繪制對接模式圖，見圖7。

圖7 天花粉活性成分與靶點分子對接模式圖。A 為菠菜甾醇（spinasterol）與多聚腺苷酸轉(zhuǎn)移酶1（PARP1）分子對接圖；B 為仙人掌甾醇（schottenol）與PARP1分子對接圖

表4 天花粉活性成分與靶點蛋白的分子對接結(jié)果

討論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居首位。天花粉是一種常見的中草藥，應(yīng)用廣泛，且具有抗腫瘤的作用。研究表明，天花粉可抑制人惡性黑色素瘤A375 細胞的增殖和遷移［26］。天花粉蛋白能在體外顯著抑制結(jié)直腸癌細胞增殖，促進凋亡［27］。天花粉多糖也可誘導(dǎo)人乳腺癌細胞凋亡［28］。此外，天花粉中的小分子化合物也具有抗腫瘤活性，其中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）可顯著抑制肺巨細胞癌細胞（PG 細胞）和人早幼粒白血病細胞（HL-60）的增殖，且都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來發(fā)揮作用［29］，其中的萜類化學(xué)成分葫蘆素B 具有顯著抗腫瘤作用，其通過抑制細胞增殖、阻滯細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞遷移和侵襲、破壞細胞骨架、抗血管生成、誘導(dǎo)細胞衰老、改善腫瘤耐藥等而發(fā)揮作用［30］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探討了中藥天花粉治療肺癌的作用機制。

通過構(gòu)建交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，運用Cytoscape 3.8.2 軟件進行拓撲分析發(fā)現(xiàn)ER1、STAT3、EGFR等為天花粉治療肺癌的核心靶點。ER1 基因編碼ERα，也稱為NR3A1，是雌激素受體的2 種主要類型之一，ER 是由性激素雌激素激活的核受體。非小細胞肺癌細胞在細胞核和核外部位同時表達ERα 和ERβ，并且阻斷其中任何一個都會導(dǎo)致細胞增殖顯著減少［31-32］。STAT3 是一種原癌基因，是信號傳導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，STAT3 與惡性腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系。STAT3 參與了小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，且STAT3可以直接激活血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達［33］。STAT3 在非小細胞肺癌組織中高表達且持續(xù)激活，它的持續(xù)激活與腫瘤的增殖、分化、細胞凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［34］。因此，STAT3與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為肺癌治療的有效靶點。EGFR 作為上皮生長因子（EGF）細胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，是人類表皮生長因子受體（HER）家族成員之一。EGFR在腫瘤的細胞增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及抑制細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在非小細胞肺癌中，EGFR 基因突變廣泛，與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型等相關(guān)，且基因突變的患者靶向治療效果顯著［35］。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，天花粉可作用于多種生物進程，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，參與肺癌的治療。PD-1/PD-L1 信號通路阻止T 細胞的增殖和擴散，導(dǎo)致腫瘤細胞免疫逃逸，進而促進腫瘤細胞生長［36］。HIF-1 是哺乳動物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧狀態(tài)下由血管生成，在肺癌中呈現(xiàn)高表達［37］。在低氧環(huán)境下，HIF-1α 通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路、熱休克蛋白（HSP）90通路、促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路對腫瘤細胞的血管生成、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡進行調(diào)控［38］。

綜上所述，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法分析天花粉治療肺癌的有效成分及靶點，初步揭示了天花粉治療肺癌的可能作用機制，為后續(xù)研究提供了參考，但本研究仍存在許多局限性，文中數(shù)據(jù)主要是利用數(shù)據(jù)庫進行推測，其結(jié)論有待進一步實驗研究加以驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明崔啟迪：設(shè)計文章的思路與框架，繪制圖表，撰寫論文初稿；孫杉杉、陸梅：文獻收集、整理和提煉；黃燕瑛：論文的修訂；呂文文：論文終稿的審定，文章的質(zhì)量控制及審校；崔啟迪、呂文文：對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理