單細(xì)胞RNA測序應(yīng)用于繼發(fā)性腎病的研究進(jìn)展

鄒皓珍 楊佳 席哲帆 紀(jì)瑞 董華

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，濱州 256603

科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展使生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)生了翻天覆地的改變，由以前研究的器官、組織水平轉(zhuǎn)向了解單個(gè)細(xì)胞的不同組成結(jié)構(gòu)發(fā)展。腎臟是一個(gè)復(fù)雜且重要的器官，在生理穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮排泄代謝產(chǎn)物、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及內(nèi)分泌等多種重要功能。腎組織含有多種固有細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，各種細(xì)胞大多具有自己獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征及專屬功能［1］。因此，腎臟疾病患者經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥如高血壓、心腦血管疾病等，該病累及的范圍廣泛，包括腎小球疾病、腎腫瘤等。既往只能檢測多種細(xì)胞的平均變化水平，無法辨別個(gè)別細(xì)胞在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用。而單細(xì)胞測序技術(shù)可以從單個(gè)細(xì)胞水平精確地辨別細(xì)胞類型，了解其在疾病中的作用機(jī)制，有助于腎臟疾病的治療及預(yù)防。近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）中的研究有新進(jìn)展［1］。本文闡述單細(xì)胞測序技術(shù)在常見繼發(fā)性腎病的最新應(yīng)用研究。

單細(xì)胞測序技術(shù)

單細(xì)胞測序可以獲得特定微環(huán)境下的細(xì)胞測序差異來研究其功能差異。通過分析基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組以及空間組等信息來定義細(xì)胞類型，深入研究細(xì)胞功能、細(xì)胞譜系、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)變等，主要包括單細(xì)胞基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和表觀遺傳測序，這3 種測序類型各具特點(diǎn)和優(yōu)勢，可以從各個(gè)角度揭示細(xì)胞各個(gè)階段的功能和特點(diǎn)。全基因組測序是對目的細(xì)胞全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增，隨后利用外顯子捕獲技術(shù)進(jìn)而使用高通量測序的過程［2］。轉(zhuǎn)錄組測序是一種用于檢測和定量分析信使RNA 分子的方法，其過程包括將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再行高通量DNA 測序［3］。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序通常在包含數(shù)千到數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的樣本上進(jìn)行，主要用途是評估細(xì)胞群內(nèi)的轉(zhuǎn)錄相似性和差異，揭示未被認(rèn)識(shí)的異質(zhì)性水平，追蹤異質(zhì)但相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)之間的譜系和發(fā)育關(guān)系［4］。表觀遺傳學(xué)測序主要在基因調(diào)控方面起作用，表觀遺傳改變是可逆的，也可以決定基因表達(dá)并負(fù)責(zé)細(xì)胞的異質(zhì)性［5-7］。單細(xì)胞測序流程包括單細(xì)胞的分離制備、遺傳物質(zhì)的提取擴(kuò)增及高通量測序。

在繼發(fā)性腎病中的應(yīng)用

1.DN

DN 是持續(xù)高血糖引起的糖尿病微血管并發(fā)癥，以進(jìn)展性的腎間質(zhì)纖維化為特征，是引起終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）的首要原因。人們利用單細(xì)胞測序技術(shù)首先從細(xì)胞層面剖析DN 的發(fā)病機(jī)制，早期研究DN 小鼠和患者腎臟之間的差異性基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)特定基因、靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，促進(jìn)DN 的進(jìn)展；現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)是尿液細(xì)胞表達(dá)譜、藥物作用靶點(diǎn)的相關(guān)機(jī)制［8］。

DN 發(fā)病機(jī)制與高血壓、高血糖、氧化應(yīng)激、遺傳背景、足細(xì)胞損傷密不可分，通過單細(xì)胞測序技術(shù)可檢測與DN進(jìn)展相關(guān)的基因。Wang 等［8］利用單細(xì)胞RNA 測序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）數(shù)據(jù)中鑒定出13 種細(xì)胞類型，在scRNA-seq 數(shù)據(jù)和Bulk RNA-seq 中鑒定出106 種常見差異表達(dá)基因。尿液外泌體微小RNA-451-5p［9］、3 個(gè)免疫相關(guān)基因（SLIT3、PDE1A、CFH）［10］、MRTF-SRF（在系膜細(xì)胞中激活的機(jī)械敏感信號通路）［11］可作為DN 的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，而EIF4B、RICTOR、PRKCB［12］、ATF3、B2M、VCAM1、CLDN4、SPP1等［13］均可能促進(jìn)DN 進(jìn)展，對早期DN 小鼠巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜分析發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展中的動(dòng)態(tài)巨噬細(xì)胞M1 樣炎癥表型增加［14］。Fu 等［15］也強(qiáng)調(diào)DN 中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以及單個(gè)細(xì)胞的可變反應(yīng)。Roumeliotis 等［16］發(fā)現(xiàn)SPP1、TPO、TTN、SGO2 等21 個(gè)氧化應(yīng)激基因參與或延緩DN 的發(fā)展。有關(guān)遺傳易感性，GREM1 變異體rs1129456［17］、NCALD 基因［18］與DN 相關(guān)；Pei 等［19］對267 例DN 患者EB-1 基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性基因分型，發(fā)現(xiàn)DN 患者和非DN 患者之間有遺傳差異；Gu等［20］發(fā)現(xiàn)在1型糖尿?。―M）中性別決定區(qū)Y-box 2 對DN 具有性別特異性遺傳影響。足細(xì)胞損傷在DN 中起重要作用，Zhang 等［21］研究顯示，吲哚胺2，3-雙加氧酶促進(jìn)DN中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成，并減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。Wang 等［22］應(yīng)用db/db 小鼠，將1 型DM與2 型DM 的足細(xì)胞翻譯mRNA 圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)具有差異性及相似性。翁維維等［23］的實(shí)驗(yàn)提示自噬活性水平與足細(xì)胞功能有關(guān)，抑制自噬活性可使足細(xì)胞受損。

單細(xì)胞測序在尿液細(xì)胞研究中也有進(jìn)展。Abedini等［24］對5 例DN 患者及10 例健康對照組的尿液樣本進(jìn)行分析，將尿液細(xì)胞與人類腎臟和人類膀胱數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，除了巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和膀胱細(xì)胞外，幾乎所有的腎細(xì)胞類型如足細(xì)胞、近端小管、髓袢和集合管都可以在尿液中識(shí)別。尿液細(xì)胞與人腎細(xì)胞在基因表達(dá)上具有相似性，以后可采集患者尿液細(xì)胞而非腎活檢，這種簡單的取材方式有助于疾病的診斷，并有助于患者個(gè)性化預(yù)后［25］。

單細(xì)胞測序在治療DN 的藥物作用機(jī)制方面是一大熱點(diǎn)，血管緊張素受體阻滯劑和鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑（sodium-dependent glucose transporters 2 inhibitor，SGLT2i）被用于治療DN，但具體作用仍不清楚［26-28］。Wu等［26］鑒定db/db 小鼠10 個(gè)不同的腎細(xì)胞簇，發(fā)現(xiàn)血管緊張素受體阻滯劑具有較強(qiáng)抗炎和抗纖維化作用，而SGLT2i 影響小管線粒體功能，血管緊張素受體阻滯劑和SGLT2i 在保護(hù)腎臟中發(fā)揮疊加效應(yīng)而非協(xié)同效應(yīng)。SGLT2i可誘導(dǎo)模擬禁食和缺氧反應(yīng)，對近端小管富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子7的剪接體選擇性剪接調(diào)節(jié)是潛在作用機(jī)制［27］。Dalb?ge等［28］在db/db-UNx-ReninAAV 小鼠中發(fā)現(xiàn)，司美格魯肽聯(lián)合賴諾普利可顯著降低血糖、血壓和蛋白尿，改善腎小球硬化程度、足細(xì)胞過濾縫隙密度，減少炎癥。Wang 等［29］發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl-peptidase 4，DPP4）在DN 足細(xì)胞中表達(dá)特異性上調(diào)，與足細(xì)胞增殖有關(guān)，半邊蓮?fù)ㄟ^抑制足細(xì)胞DPP4 的活性來治療DN。以上為DN 治療提供了理論依據(jù)，期待更多有關(guān)藥物作用機(jī)制的研究。

2.LN

LN 是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）的腎臟損害，是ESRD 的重要原因之一。LN 的復(fù)雜性及異質(zhì)性涉及多種細(xì)胞類型以及免疫和非免疫機(jī)制，對LN患者的固有腎細(xì)胞和浸潤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序是一種新方法，可在細(xì)胞水平上明確腎損傷途徑［30］。LN 是首個(gè)應(yīng)用于單細(xì)胞測序腎活檢的疾病類型，除了腎組織，血液、尿液、皮膚也可用于LN 單細(xì)胞水平檢測發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物，對LN的發(fā)病機(jī)制及治療的研究也層出不窮［30］。

最近對SLE 血液和組織測序顯示分子異質(zhì)性，并確定幾個(gè)不同的亞群是SLE 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵參與者［31］。Nehar-Belaid 等［32］分析外周血單核細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，SLE 患者的干擾素刺激基因（interferon stimulating gene，ISG）表達(dá)增加，富含ISG 和/或單基因狼瘡相關(guān)基因的獨(dú)特亞群的擴(kuò)增與疾病活動(dòng)性相關(guān)。Vanarsa 等［33］對SLE 患者尿液進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)尿血管生成素樣蛋白4（Angptl4）、L-選擇素和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1 為LN 疾病活動(dòng)的潛在生物標(biāo)志物。同樣，Arazi等［34］發(fā)現(xiàn)2種趨化因子受體CXCR4和CX3CR1廣泛表達(dá)，免疫細(xì)胞在尿液和腎臟中的基因表達(dá)密切相關(guān)。干擾素（interferon，IFN）-γ 誘導(dǎo)的趨化因子較高為增生性LN，首次應(yīng)用尿液蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合腎活檢單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)尿液趨化因子主要由浸潤C(jī)D8+T 細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞和骨髓細(xì)胞產(chǎn)生，而尿液趨化因子數(shù)目與腎浸潤性CD8+細(xì)胞數(shù)相關(guān)［35］。早期增生性LN 患者腎小球樣本間基因表達(dá)有很大的異質(zhì)性，可鑒定IFN 誘導(dǎo)基因特征等4 個(gè)主要簇［36］。Der 等［37］對21 個(gè)腎臟和17 個(gè)皮膚樣本進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，小管細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞IFN 評分之間以及小管細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞纖維化評分之間的相關(guān)性，并證明慢性指數(shù)、免疫球蛋白G（IgG）沉積和蛋白尿量與腎小管細(xì)胞中由IFN 誘導(dǎo)基因組成的基于轉(zhuǎn)錄組的評分相關(guān)［38］。以上研究表明血液、尿液、皮膚的scRNA-seq 分析可作為腎臟疾病的生物標(biāo)志物，說明了scRNA-seq 的潛在用途，為LN 的發(fā)病機(jī)制提供新見解。

近來研究發(fā)現(xiàn)，TNFSF13B［39］、白細(xì)胞介素（IL）16［40］、可溶性CD163［41］、循環(huán)免疫復(fù)合物［42］與LN 的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，轉(zhuǎn)化生長因子β 信號傳導(dǎo)參與LN 的發(fā)展［43］，microRNA-199a通過靶向Klotho調(diào)節(jié)核因子（NF）-κB的激活而參與LN發(fā)病機(jī)制［44］。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)殺菌/通透性增加蛋白在T 細(xì)胞衍生的外泌體或外周血T 細(xì)胞中的過表達(dá)可能是LN 的生物標(biāo)志物和致病因素［45］。IFN 信號有IFN-α、IFN-β和IFN-γ 3種反應(yīng)基因，含有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4）rs17268364 的狼瘡易感區(qū)通過結(jié)合EWSR1 在功能上降低CTLA4 的表達(dá)，并與IFN-α 信號相關(guān)［46］。

Zhou 等［47］研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞通過減少CD4+、CD8+、巨噬細(xì)胞、長壽命漿細(xì)胞、促炎中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞對腎臟區(qū)域免疫細(xì)胞的影響來治療LN。Peng 等［48］發(fā)現(xiàn)一種新的DDX58致病性變體R109C可提高IFN信號傳導(dǎo)而致病，Janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）抑制劑可用于LN 的治療。厚樸酚可抑制NLRP3/IL-33/ST2 軸的激活來抑制腎臟固有巨噬細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞之間的異常串?dāng)_，從而對LN起到預(yù)防和治療作用［49］。

結(jié)語與展望

近幾年隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的深入研究，scRNA-seq技術(shù)與常規(guī)組學(xué)或單細(xì)胞組學(xué)的聯(lián)合分析會(huì)成為大熱點(diǎn)，如結(jié)合scRNA-seq 與批量RNA 測序可以發(fā)現(xiàn)組織轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)特異性信息，識(shí)別細(xì)胞與組織水平的共同特征；腎scRNA-seq 與尿蛋白組學(xué)聯(lián)合分析有助于挖掘疾病活動(dòng)的生物特異性標(biāo)志物，尋找反映腎臟復(fù)雜分子生物學(xué)活動(dòng)的尿蛋白［50］。最后，還有利于生物標(biāo)志物和新藥的研發(fā)，scRNA-seq 可能會(huì)取代大量基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，包括腎臟疾病。雖然在腎臟疾病領(lǐng)域應(yīng)用較少［51］，但是隨著單細(xì)胞測序相關(guān)方法變得更加精練、更高通量、更廉價(jià)，以及在靈敏度、準(zhǔn)確性、成本效益、處理時(shí)間和每個(gè)細(xì)胞可評估的參數(shù)方面的改進(jìn)，相信未來幾年該項(xiàng)技術(shù)在腎臟領(lǐng)域的基礎(chǔ)和臨床方面的研究將更加廣泛，也可能會(huì)改變對腎臟疾病分子發(fā)病機(jī)制的理解［52］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明鄒皓珍、紀(jì)瑞：起草文章，指導(dǎo)；楊佳：對文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)；席哲帆：分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，指導(dǎo)；董華：對文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)