基于重測序的23份香菇種質資源全基因組序列分析

宋琳琳　陳紅芝　毋柳柳　李暢　孟麗　孔維麗

摘? ? 要：為了對河南香菇主產(chǎn)區(qū)的主栽品種進行鑒定，并分析其遺傳多樣性，將河南主栽的23份香菇種質資源進行重測序，對單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和小片段插入缺失（insertion-deletion，InDel）等數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和分析，并基于SNP變異對23份香菇資源進行遺傳結構分析、進化樹構建和主成分分析。結果表明，在23份香菇樣本中，比對到參考基因組上的reads數(shù)目占總數(shù)的比例范圍為72.53%～90.60%，樣品平均測序深度范圍為12.83～19.99，覆蓋率范圍為91.89%～99.32%。SNP位點共計14 115 075個，InDel共計1 909 516個。23份香菇樣本的群體遺傳結構及系統(tǒng)發(fā)育分析表明其包含3個譜系，遺傳距離0.054 90～0.656 89，推測它們至少有3個祖先遺傳成分。結合主成分分析法明確各菌種間的親緣關系遠近，證明了菌種分支具有明顯的地域性。綜合分析表明，以基因序列相似度、遺傳距離差異及親緣關系遠近為主要依據(jù)特點，有助于對香菇地方品種命名和其特征特性關系的認識，促進優(yōu)異種質資源的交流與利用。

關鍵詞：香菇；重測序；單核苷酸多態(tài)性；插入缺失變異；群體遺傳結構

中圖分類號：S646 文獻標志碼：A? ? ? 文章編號：1673-2871（2024）03-028-07

Whole-genome squence analysis of 23 Lentinula edodes germplasms based on genome re-sequencing

SONG Linlin1， CHEN Hongzhi2， WU Liuliu1， LI Chang3， MENG Li1， KONG Weili4

（1. School of Life Science ， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China; 2. Xinxiang Institute of Engineering， Xinxiang， 453700， Henan， China; 3. School of Faculty of Arts and Law， Zhengzhou Technology and Business University， Zhengzhou， 451400， Henan， China; 4. Edible Fungus Research Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450000， Henan， China）

Abstract： To identify and analyze the genetic diversity of Lentinula edodes isolated from the main producing area in Henan province， the study resequenced the genomes of 23 cultivated L. edodes germplasm resources. The researchers analyzed the single nucleotide polymorphism （SNP） and insertion-deletion （InDel） data， and finished the genetic structure analysis， phylogenetic tree construction and principal component analysis based on the SNP variation. The proportion of reads matched to the reference genome ranged from 72.53% to 90.60% among the samples， with an average sequencing depth ranging from 12.83 to 19.99 and coverage rates ranging from 91.89% to 99.32%. The researchers identified a total of 14 115 075 SNP sites and 1 909 516 InDel sites. The results revealed the presence of three lineages with genetic distances ranging from 0.054 90 to 0.656 89， indicating the existence of at least three ancestral genetic components. Based on the principal component analysis， the relative distance of each strain was confirmed， which proved that the strain branches had obvious regional characteristics.The comprehensive analysis considered the similarity of gene sequences， genetic distance differences， and the relationships among relatives as the main characteristics. The understanding of these characteristics could facilitate the exchange and utilization of excellent germplasm resources. Additionally， the study provided insights into the relationship between the naming of local varieties and their genetic characteristics.

Key words： Lentinula edodes; Resequencing; Single nucleotide polymorphism; Insertion-deletion variation; Population genetic structure

香菇（Lentinula edodes）又名香蕈、冬菇，隸屬于傘菌目（Agaricales）光茸菌科（Omphalotaceae）小香菇屬（Lentinula）食用菌，是國際公認的健康食品[1-2]。香菇富含蛋白質、多糖、維生素、微量元素等營養(yǎng)物質。香菇多糖已被證實具有抗病毒、抗衰老、預防心腦血管疾病、預防肝硬化、保護腎功能等功效[3-4]；香菇粗纖維可以幫助消化、緩解便秘、減肥；香菇中的嘌呤、膽堿等可以降血壓、降血脂，預防肝硬化及動脈硬化的發(fā)生；近年來研究證明，食用香菇對減少糖尿病及其并發(fā)癥，如坐骨神經(jīng)痛、視網(wǎng)膜炎等均有一定的治療作用[5-7]。

據(jù)中國食用菌學會2022年統(tǒng)計，2021年河南省食用菌總產(chǎn)量576.13萬t，位居全國第一。全省食用菌各類品種折合超過57.57億袋，產(chǎn)值410.37億元，較2020年增長2.16%，其中香菇以387.04萬t的產(chǎn)量位居各種主要食用菌產(chǎn)量之首，占全部食用菌產(chǎn)量的68.07%。品質好、性狀穩(wěn)定的菌種是香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎，但多年來河南省品種繁多、引種不清、命名混亂、質量標準不統(tǒng)一等問題已經(jīng)嚴重影響和制約產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。利用形態(tài)和生理生化特征對香菇品種進行鑒定，操作繁瑣，且結果不一定可靠[8]?；诟鞣N分子標記開展的香菇種質資源親緣關系鑒定和遺傳多樣性分析已陸續(xù)進行。汪昊等[9]用簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和目標區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism，TRAP）標記對我國常見的19個香菇品種進行序列擴增和多樣性分析，表明TRAP標記貢獻率最高。吳小燕等[10]、肖東來等[11]、宋瑩等[12]、郭金英等[13]利用ISSR分子標記對我國常見香菇栽培品種或野生菌株進行聚類分析，結果表明，野生和栽培菌株可明顯分開，且名稱相似或者同一地區(qū)的栽培品種聚為一類。董慧等[14]利用簡單重復序列擴增多態(tài)性（simple sequence repeat，SSR）標記對我國香菇51個主栽品種進行聚類分析，認為現(xiàn)有的商業(yè)品種大多遺傳背景相似（遺傳相似系數(shù)均高于0.60）。Xiang等[15]利用68個InDel和2個SSR標記，對我國2個地區(qū)4個香菇居群的遺傳變異進行分析，提出地理位置的不同分布是形成我國香菇當前遺傳結構的重要因素。沈秀芬[16]用重測序獲得的小片段插入缺失（insertion-deletion， InDel）標記對44份野生和地方主栽香菇菌株進行遺傳多樣性分析，提出了可挑選優(yōu)質野生菌株和現(xiàn)有主栽菌株進行雜交以獲得優(yōu)良香菇品種的建議。有關香菇全基因組遺傳關系分析的研究較多，但是利用重測序獲得的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism， SNP）標記對香菇菌種，尤其是國內主栽品種進行親緣關系鑒定和遺傳多樣性分析的研究較少。

筆者針對河南香菇主產(chǎn)區(qū)的23份香菇種質資源進行基因組重測序（whole genome resequencing，WGR），一方面利用獲得的SNP變異對23份樣本進行遺傳結構分析、進化樹構建和主成分分析，對其親緣關系進行鑒定，旨在解決主產(chǎn)區(qū)香菇菌種命名混亂的問題。另一方面，通過重測序獲得香菇樣本的SNP變異、InDel變異等數(shù)據(jù)，利用生物信息學的方法對其特點進行分析，為后期開發(fā)香菇重要性狀分子標記、研究香菇遺傳多樣性和分子育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取河南省南陽、駐馬店、三門峽、漯河4個香菇主產(chǎn)區(qū)的23份香菇菌株作為供試材料（表1）。2023年4－6月收集河南省食用菌種質資源庫、新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院、駐馬店市農業(yè)科學院、河南科技學院微生物教研室保存的上述河南主產(chǎn)區(qū)的香菇品種。

1.2 菌種的活化

2023年7月，在河南科技學院生命科學學院將收集到的23份香菇菌株接種于新的PDA斜面上，28 ℃ 培養(yǎng)活化。選取無污染、長勢良好的活化菌種接種于PDA平板上，在培養(yǎng)基和接種菌塊之間用滅菌的玻璃紙隔開，便于后期收集菌絲。28 ℃培養(yǎng)一周后，用滅菌的鑰勺將玻璃紙上的菌絲輕輕刮下，放入2 mL冷凍管中，立即進行液氮速凍，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取和文庫構建

將收集到的23份香菇菌絲用干冰送樣，由武漢菲沙基因信息有限公司進行DNA提取。檢驗合格的DNA樣品通過Covaris破碎機隨機打斷成長度為350 bp的片段，DNA片段經(jīng)末端修復、加ployA尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。文庫質檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求進行PE150測序。

1.4 測序質檢、同參考基因組進行比對

將測序得到的原始圖像經(jīng)識別后，得到的原始數(shù)據(jù)（Raw reads）需要進一步去除dA、比例高于10%的含N數(shù)據(jù)、低質量數(shù)據(jù)等，得到過濾后的數(shù)據(jù)（Clean reads）。通過比對Clean reads和Raw reads，以及Q20、Q30的數(shù)值等檢測測序質量。以香菇Lentinula edodes ASM1547640v1（NCBI Accession：GCA_015476405.1）為參考基因組，將過濾后的Clean reads用微生物重測序分析軟件BWA（Burrows wheeler alignment，0.7.17）與參考基因組比對，利用GATK（Genome analysis toolkit，4.2.0.0）軟件對PCR重復進行去重處理。對去重后的數(shù)據(jù)進行比對率、覆蓋度和測序深度的統(tǒng)計。

1.5 基因組變異檢測

利用GATK軟件對樣本數(shù)據(jù)進行檢測和過濾，獲得樣本的SNP和InDel變異信息，并利用ANNOVA軟件對香菇全基因組SNP進行注釋，獲得變異位點發(fā)生的位置及類型。

1.6 群體分析

在上述獲得的SNP信息基礎上，對23份香菇樣本進行群體分析。為保證后續(xù)群體分析的可靠性，利用Vcftools（0.1.17）軟件首先對樣本數(shù)據(jù)進行群體過濾。過濾后群體SNP數(shù)量由1 320 359個變?yōu)?74 565個。利用treebest（1.9.2）構建系統(tǒng)進化樹（phylogenetic tree），利用plink（1.90）進行主成分分析（principal components analysis），利用admixture（1.3.0）進行群體遺傳結構分析（population structure analysis）。

2 結果與分析

2.1 23份香菇樣本的基因重測序分析

利用Illunima平臺對23份香菇菌株菌絲DNA進行重測序。Raw reads范圍是6 115 825～9 056 198，經(jīng)過濾后的Clean reads范圍是5 436 754～7 857 618，比率為86.77%～92.58%；Rawbases范圍是0.92～1.36 G，經(jīng)過濾后的Clean bases范圍是0.80～1.15 G。Q20范圍為98.13%～98.82%，Q30范圍為91.16%～100%，說明文庫構建質量符合樣本后續(xù)重測序要求。對23份香菇菌株重測序數(shù)據(jù)與參考基因組進行比較，比對到參考基因組上的reads數(shù)目占總數(shù)的比例范圍為72.53%～90.60%，樣品平均測序深度范圍是12.83～19.99，覆蓋率范圍是91.89%～99.32%，說明測序數(shù)據(jù)基本覆蓋參考基因組，可進行后續(xù)分析。

2.2 23份香菇菌種的重測序SNP變異和InDel變異分析

23份樣本的SNP位點變異范圍是307 684～590 751，其中轉換變異范圍是224 670～431 249，顛換變異范圍是80 536～157 657，Ts/Tv平均值為2.734。InDel變異范圍是40 421～83 544，其中插入變異范圍是21 207～44 368，缺失變異范圍是32 842～63 681。在23份香菇種質資源的SNP變異類型中，編碼區(qū)變異占比最高（30.3%），而編碼區(qū)基因的變異可能會導致氨基酸序列的改變，從而會引起性狀的改變。本試驗所統(tǒng)計的外顯子變異中，同義突變占59.9%，非同義突變占39.4%。23個菌株中，LE14（香泌陽18-2）外顯子變異最大，其次是LE45（南山1號）、LE31（武香1號）和LE38（香18），而這幾個品種分別來自泌陽和舞陽。LE12（香9608）外顯子變異最小，其次是LE44（9608）、LE10（香LS-1）、LE35（808）、LE41（申香215）和LE4（香808），而這幾個品種分別來自舞陽、三門峽和泌陽。

2.3 群體分析

2.3.1 群體遺傳結構分析 基于SNP的數(shù)據(jù)信息，對23份香菇菌株樣本進行群體結構分析。由圖1可以看出，當K=3時，錯誤率最低，因此K=3時模型較為可靠。由圖2可知，當K=2時，23份香菇菌株樣本分化為2個譜系種群；當K=3時，2個譜系種群進一步分化為3個譜系：由棕色構成的第一譜系，分別是9608（LE9）、慶元2號（LE11）、L18（LE8）、香LS-1（LE10）、L26（LE30）、武香1號（LE43）、慶科212（LE42）、靈仙1號（LE2）、L18（LE5），這些香菇大多數(shù)來自于西峽、盧氏和泌陽；由紫色構成的第二譜系，分別是香808（LE4）、香9608（LE12）、808（LE35）、武香1號（LE44）、808（LE39）、L9608（LE34）和申香215（LE41），這些香菇來自于河南菌種資源庫、泌陽和舞陽；由綠色構成的第三譜系，分別是香泌陽18-2（LE14）、武香1號（LE31）、香18（LE38）、南山1號（LE45），這4株香菇來自泌陽和舞陽。LE1號香菇來源于河南省菌種資源庫，推測其由2個祖先遺傳成分；LE3和LE7含有2個相同的祖先遺傳成分?？偟膩碚f，23份香菇菌株有3個譜系，推測至少有3個祖先遺傳成分。

2.3.2 主成分分析 基于SNP結果，采用主成分分析方法對23份香菇菌株資源3個群體（pop1、pop2、pop3）的遺傳背景相似性進行歸類（圖3）。通過主成分分析，共提取到2個主成分（PC1：47.26%、PC2：32.37%），方差累積貢獻率為79.63%，其能夠較好解釋變量的總體變化情況。由圖3可知，結合PC1和PC2把23份香菇菌種分為三大類，第一類（pop1）為9608（LE9）、慶元2號（LE11）、L18（LE8）、香LS-1（LE10）、L26（LE30）、武香1號（LE43）、慶科212（LE42）、靈仙1號（LE2）、L18（LE5）、香升龍1-1（LE3）、香931-2（LE7），主要由來自西峽、盧氏和泌陽的菌株構成；第二類（pop2）為香931（LE1）、武香1號（LE31）、香18（LE38）、香泌陽18-2（LE14）、南山1號（LE45），主要由來自泌陽和舞陽的菌株構成；第三類（Pop3）為香808（LE4）、香9608（LE12）、808（LE35）、武香1號（LE44）、808（LE39）、L9608（LE34）和申香215（LE41），由來自泌陽和舞陽的菌株構成。供試的23份香菇菌種分類與聚類分類結果基本一致，結果表明，PC1和PC2基本能明顯區(qū)分這23個品種。主成分分析結果進一步驗證了這些菌株親緣關系非常近，尤其是來自西峽的9608（LE9）和來自盧氏的慶元2號（LE11），來自西峽的靈仙1號（LE2）和L18（LE5），來自泌陽的武香1號（LE43）、慶科212（LE42）和來自舞陽的L26（LE30），來自泌陽的香泌陽18-2（LE14）和來自舞陽的南山1號（LE45），遺傳距離幾乎重疊。

2.3.3 聚類分析 根據(jù)treebest軟件計算供試菌株序列間的遺傳距離，23份香菇菌株的遺傳距離在0.054 90～0.656 89之間。其中，武香1號（LE31）與慶元2號（LE11）的遺傳距離最遠；L26（LE31）、香18（LE38）、香931（LE1）、香泌陽18-2（LE14）、南山1號（LE45）與其他菌株的遺傳距離在0.520 14～0.656 89之間，遺傳距離相對較遠。

為探究各香菇菌株間的進化關系，將香菇序列構建 NJ 系統(tǒng)進化樹（圖4），根據(jù)物種親緣關系，23份香菇菌種被細分為3個亞科。南山1號（LE45）、香泌陽18-2（LE14）、香931（LE1）、香18（LE38）、武香1號（LE31）聚為一支，其中，南山1號（LE45）、香泌陽18-2（LE14）2個菌株組成姐妹群，且與香931（LE1）親緣關系較近；香9608（LE12）、香808（LE4）、808（LE35）、9608（LE44）、808（LE39）、申香215（LE41）、L9608（LE34）7個菌株組成一個單系類群，親緣關系較近；其余11個品種為第3支，其中，L26（LE30）、慶科212（LE42）2 個菌株組成姐妹群，親緣關系較近。

3 討論和結論

在食用菌研究中，傳統(tǒng)的分子標記如SSR、ISSR、SRAP和TRAP等常被用于菌株鑒定和種質資源多樣性分析。隨著高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的物種基因組被測序和注釋，基于全基因組重測序技術開發(fā)的SNP[17]、InDel等分子標記也得到廣泛應用。筆者的研究針對河南香菇主產(chǎn)區(qū)的23份香菇樣本進行重測序，通過生物信息學分析，獲得了大量的群體變異信息，這為研究香菇遺傳多樣性提供了理論基礎；基于這23份樣本的SNP位點變異，筆者進行了遺傳結構分析、聚類分析和主成分分析，旨在探索菌株之間的親緣關系和進行菌種鑒定，為解決河南主產(chǎn)區(qū)香菇菌種命名混亂的問題和明確今后分子育種的方向提供了一定的依據(jù)。群體遺傳結構分析結果表明：23份香菇菌株來源于3個譜系，遺傳背景相對單一，這與董慧等[14]和Li等[18]提出的中國現(xiàn)有的香菇商業(yè)品種大多遺傳背景相似的觀點相一致，在今后的育種工作中應盡量拓寬遺傳基礎，如收集野生香菇菌種資源與現(xiàn)有優(yōu)良栽培品種進行雜交[16]。聚類分析結果表明，來自于西峽和盧氏的品種多數(shù)聚為一類，來自于泌陽和舞陽的品種多數(shù)聚為一類，來自泌陽、舞陽的9608和808多數(shù)聚為一類，這與吳小燕等[10]提出的名稱相似或者同一地區(qū)的栽培品種會聚為一類的觀點相符合；相近地區(qū)的菌種之間遺傳分化和遺傳距離相對較小，與董慧等[14]和Zhang等[19]的研究結果一致。崔筱等[20]通過香菇菌絲拮抗試驗證實來源于西峽、泌陽、盧氏等基地的香菇命名雖然不同（包括香9608、慶元2號、香931-2、香939、香升龍1-1、靈仙1號等），但這些菌株的菌絲無拮抗現(xiàn)象，在筆者的試驗中，主成分分析結果進一步驗證了這些菌株親緣關系非常近，尤其是來自西峽的9608（LE9）和來自盧氏的慶元2號（LE11）、西峽的靈仙1號（LE2）和L18（LE5）、泌陽的武香1號（LE43）和慶科212（LE42）、泌陽的香泌陽18-2（LE14）和來自舞陽的南山1號（LE45）。因此初步判斷這些香菇品種存在同種異名現(xiàn)象；但來自舞陽的武香1號和來自泌陽的武香1號遺傳距離較遠，初步判斷為同名異種。

防止菌種混亂這一問題，需要從管理者、生產(chǎn)者、推廣者等多方進行監(jiān)督，一是管理部門需通過各種宣傳手段增強育種工作人員知識產(chǎn)權保護意識，通過法律法規(guī)切實保護食用菌新品種新菌株；二是菌種生產(chǎn)者需自覺樹立良好職業(yè)道德和嚴格的執(zhí)業(yè)態(tài)度，不得隨意命名和編號；三是要提升菌種生產(chǎn)人員的專業(yè)技能，嚴格從業(yè)人員考核制度；四是推廣者需做好引種溯源工作，切實落實各項食用菌菌種管理制度。

綜上所述，基于重測序的SNP變異數(shù)據(jù)，將河南省香菇主產(chǎn)區(qū)的23份資源分為3個譜系，推測它們至少有3個祖先遺傳成分，結合主成分分析法明確了各菌種間的親緣關系遠近，證明了菌種分支具有明顯的地域性。研究結果有助于對香菇地方品種命名和其特征特性關系的認識，對優(yōu)異種質資源的交流與利用具有重要的促進作用。

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收稿日期：2023-11-20；修回日期：2024-01-17

基金項目：河南省重點研發(fā)與推廣專項（212102110056）

作者簡介：宋琳琳，女，講師，主要從事食藥用真菌資源開發(fā)和分子遺傳研究。E-mail：cnusll@126.com

通信作者：孔維麗，女，研究員，主要從事食用菌育種及平菇發(fā)酵料栽培機制研究。E-mail：kongweili2005@126.com