Snapshot法測定ET—1基因Taq I多態(tài)性與海南漢族老年腦梗死的關(guān)聯(lián)性研究

邱逸敏+吳懇+蘇春妮+黃維益+王鎮(zhèn)+張?jiān)葡?/p>

【摘要】目的：研究內(nèi)皮素基因1（ET-1）Taq I（rs2071942）位點(diǎn)多態(tài)性與海南漢族老年腦梗死關(guān)聯(lián)性。方法：選用150例海南省老年腦梗死患者作為實(shí)驗(yàn)組，健康對照311例作為對照組，提取基因組DNA，利用snapshot的方法測定Taq I基因多態(tài)性。利用軟件SPSS17.0分析組間差異。結(jié)果：兩組中均可檢測出三種基因型GG、GA、AA，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率為79（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在對照組中的分布頻率為159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%），組間基因型分布頻率沒有明顯差異。等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間也沒有明顯差異。結(jié)論：ET-1的Taq I位點(diǎn)多態(tài)性與海南漢族腦梗死疾病沒有關(guān)聯(lián)性。

【關(guān)鍵詞】腦梗死 ；內(nèi)皮素 ； 單核苷酸多態(tài)性 ； Taq I

【中圖分類號(hào)】R742【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2014）08 2008年衛(wèi)生部調(diào)查結(jié)果顯示，腦血管疾病成為我國居民第一死亡因素，而腦梗死則是腦血管疾病中最為嚴(yán)重的一種，它是指由于患者腦部供血障礙引起的腦組織缺血、缺氧而發(fā)生壞死、軟化形成梗死的腦血管疾病，該病具有典型的發(fā)病率、致殘率、病死率三高的特點(diǎn)，成為我國居民身體健康的“無聲殺手”[1]。國內(nèi)外醫(yī)務(wù)工作者和科研工作者分別從不同的角度對腦梗死的病因進(jìn)行了研究，一般認(rèn)為高血壓、心臟病、糖尿病、高血脂、高血粘度等因素通過影響血液成分的變化及血流動(dòng)力學(xué)的變化而導(dǎo)致血栓形成，發(fā)生腦梗死，而遺傳因素也是腦梗死發(fā)生的重要影響因素之一[2-4]。

內(nèi)皮素是血管收縮性物質(zhì)，對調(diào)節(jié)心血管功能、維持基礎(chǔ)血管張力及心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用。ET-1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的收縮功能最強(qiáng)的內(nèi)源性物質(zhì)，其增高不但與腦梗死的發(fā)病有關(guān)，與其發(fā)展過程中也有著密切關(guān)系[5]。遺傳多態(tài)性是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及表達(dá)水平的重要因素，也是疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。內(nèi)皮素的編碼基因ET-1存在遺傳多態(tài)，其中Taq I（rs2071942）是內(nèi)皮素內(nèi)含子-4G8002A的G/A轉(zhuǎn)換的多態(tài)位點(diǎn)。本研究選擇了腦梗死及健康對照人群，試圖通過比對研究探討該位點(diǎn)的突變是否與海南漢族老年腦梗死存在關(guān)聯(lián)。

1研究對象與方法

1.1研究對象

（1）正常對照組：無血緣關(guān)系的海南漢族健康個(gè)體311例，肝腎功能正常， 排除高血壓病、心血管疾病、糖尿病及血液病病史。對照組中男女比例為194/117，年齡均大于60歲，平均年齡為68.7歲。（2）腦梗死患者組：海南省老年病醫(yī)院心血管內(nèi)科住院部漢族腦梗死患者150例，所有病例均經(jīng)頭部CT掃描確定為腦梗死，并且符合第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的“各類腦血管病診斷要點(diǎn)”中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男女比例為93/57，年齡均在60歲以上，平均年齡為69.3歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩組患者年齡、性別比例及體重等一般體征無顯著差異，存在可比性（P>0.05）。

1.2 ET-1基因多態(tài)性檢測

1.2.1 基因組DNA的獲得：所有入選者采集EDTA抗凝血3ml，利用北京天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA。

1.2.2 基因序列的獲得及引物設(shè)計(jì)：從GENBANK中獲取人類ET-1編碼基因，并獲得rs2071942的位點(diǎn)信息（GTATTTACCACTTTCCCTGAGAAATC[A/G]AAAATCATTTTGGGGAGCGGACATT）。根據(jù)以上信息在rs2071942位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物（P11 CACATAC CATTTCATCTACAGG，P22GGCCATCTGAAT AACTGCAAC），引物擴(kuò)增片段的長度為218bp。③PCR擴(kuò)增體系及條件：每管在1×PCR緩沖液（10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2）中含模板DNA 0.2 μg，引物各0.2～0.5 μmol/L，4種dNTP各100 μmol/L， Taq DNA聚合酶（北京天根公司產(chǎn)品）1U，擴(kuò)增體系為15ul。PCR循環(huán)參數(shù)為：首先在95℃預(yù)變性3min，之后進(jìn)行11個(gè)循環(huán)反應(yīng)（每個(gè)循環(huán)包括94℃ 15s， 60℃15s），循環(huán)完成后72℃溫育30s，接著進(jìn)行24個(gè)循環(huán)反應(yīng)（每個(gè)循環(huán)包括94℃ 15s， 60℃15s），循環(huán)完成后72℃溫育3min。④PCR產(chǎn)物的純化：PCR擴(kuò)增后取3ul PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，主要是用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的DNTP。⑤SNP分型 利用延伸引物TACCACTTTCC CTGAGAAATC進(jìn)行延伸反應(yīng)，取1ul延伸產(chǎn)物，加8ul上樣loading，95°C變性3min，立即冰水浴，上測序儀進(jìn)行分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算。組間基因型與等位基因頻率比較用2檢驗(yàn)。組間年齡、性別、體重等計(jì)量資料用t檢驗(yàn)。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。

2研究結(jié)果

2.1基因分型結(jié)果

如圖1-3所示，延伸產(chǎn)物堿基的對應(yīng)顏色A：綠色 G：藍(lán)色，圖1-3表示基因型分別為AG、AA、GG。

圖1 SNP分型為AG

圖2 SNP分型為AA

圖3 SNP分型為GG

兩組中均可檢測出三種基因型AA、AG、GG，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率為79（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在對照組中的分布頻率為159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%），組間基因型分布頻率均無顯著差異 （P>0.05）。

等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間也沒有明顯差異（P>0.05）。

表1兩組患者基因型分布頻率

基因型 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2兩組患者等位基因分布頻率

等位基因 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

3討論

老齡化社會(huì)的到來使得老年性疾病的發(fā)生率逐日增高，腦梗死的三高的特點(diǎn)成為老年人身體健康的重要威脅因素，也是影響老年患者生存質(zhì)量的重要因素，徹底破解腦梗死發(fā)生的原因是防治該病的必要前提。諸多研究從不同的角度對該病的發(fā)病原因進(jìn)行了探討，但到目前為止依然沒有確切的答案。

內(nèi)皮素對心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，而目前發(fā)現(xiàn)的三類內(nèi)皮素中，內(nèi)皮素-1被發(fā)現(xiàn)收縮功能最強(qiáng)。金啟建等檢測腦梗死病人ET-1的水平并與正常對照比較，研究結(jié)果顯示腦梗死病人血清ET-1水平明顯高于正常對照組。眾多相關(guān)研究指向ET-1增高是腦梗死發(fā)病的內(nèi)源性危險(xiǎn)因素之一[6]。

我們對海南漢族人群中腦梗死和健康對照進(jìn)行了比對研究，結(jié)果顯示兩組中均可檢測出三種基因型GG、GA、AA，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率為7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在對照組中的分布頻率為159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）組間基因型分布頻率均無明顯差異（P>0.05）。等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間差異無顯著（P>0.05）。以上研究結(jié)果說明，ET-1的Taq I位點(diǎn)多態(tài)性與海南漢族腦梗死疾病沒有關(guān)聯(lián)性。

參考文獻(xiàn)

[1]Kevin M. Barrett； James F. Meschia. Cerebral infarction in older age. Neurology， 2012，79（15）：1524-1525

[2] Ueda N，Satoh S， Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma. The Neurologist，2011，17（1）：34-37

[3]楊發(fā)滿.老年腦梗死患者血栓調(diào)節(jié)蛋白及IL-6水平[J].中國老年學(xué)雜志，2013，（第18期）：4573-4574

[4]李紅娟，李慶.腦梗死患者相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]劉靜波.急性腦梗死患者血漿內(nèi)皮素表達(dá)水平的臨床研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭麗瑋，周建中，王珍，竇貴旺，鐘望濤，吳志紅.內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與高血壓缺血性卒中的關(guān)系[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，（第1期）：116-121

等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間也沒有明顯差異（P>0.05）。

表1兩組患者基因型分布頻率

基因型 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2兩組患者等位基因分布頻率

等位基因 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

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老齡化社會(huì)的到來使得老年性疾病的發(fā)生率逐日增高，腦梗死的三高的特點(diǎn)成為老年人身體健康的重要威脅因素，也是影響老年患者生存質(zhì)量的重要因素，徹底破解腦梗死發(fā)生的原因是防治該病的必要前提。諸多研究從不同的角度對該病的發(fā)病原因進(jìn)行了探討，但到目前為止依然沒有確切的答案。

內(nèi)皮素對心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，而目前發(fā)現(xiàn)的三類內(nèi)皮素中，內(nèi)皮素-1被發(fā)現(xiàn)收縮功能最強(qiáng)。金啟建等檢測腦梗死病人ET-1的水平并與正常對照比較，研究結(jié)果顯示腦梗死病人血清ET-1水平明顯高于正常對照組。眾多相關(guān)研究指向ET-1增高是腦梗死發(fā)病的內(nèi)源性危險(xiǎn)因素之一[6]。

我們對海南漢族人群中腦梗死和健康對照進(jìn)行了比對研究，結(jié)果顯示兩組中均可檢測出三種基因型GG、GA、AA，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率為7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在對照組中的分布頻率為159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）組間基因型分布頻率均無明顯差異（P>0.05）。等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間差異無顯著（P>0.05）。以上研究結(jié)果說明，ET-1的Taq I位點(diǎn)多態(tài)性與海南漢族腦梗死疾病沒有關(guān)聯(lián)性。

參考文獻(xiàn)

[1]Kevin M. Barrett； James F. Meschia. Cerebral infarction in older age. Neurology， 2012，79（15）：1524-1525

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[4]李紅娟，李慶.腦梗死患者相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]劉靜波.急性腦梗死患者血漿內(nèi)皮素表達(dá)水平的臨床研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭麗瑋，周建中，王珍，竇貴旺，鐘望濤，吳志紅.內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與高血壓缺血性卒中的關(guān)系[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，（第1期）：116-121

等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間也沒有明顯差異（P>0.05）。

表1兩組患者基因型分布頻率

基因型 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2兩組患者等位基因分布頻率

等位基因 實(shí)驗(yàn)組（例/率） 對照組（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

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老齡化社會(huì)的到來使得老年性疾病的發(fā)生率逐日增高，腦梗死的三高的特點(diǎn)成為老年人身體健康的重要威脅因素，也是影響老年患者生存質(zhì)量的重要因素，徹底破解腦梗死發(fā)生的原因是防治該病的必要前提。諸多研究從不同的角度對該病的發(fā)病原因進(jìn)行了探討，但到目前為止依然沒有確切的答案。

內(nèi)皮素對心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用，而目前發(fā)現(xiàn)的三類內(nèi)皮素中，內(nèi)皮素-1被發(fā)現(xiàn)收縮功能最強(qiáng)。金啟建等檢測腦梗死病人ET-1的水平并與正常對照比較，研究結(jié)果顯示腦梗死病人血清ET-1水平明顯高于正常對照組。眾多相關(guān)研究指向ET-1增高是腦梗死發(fā)病的內(nèi)源性危險(xiǎn)因素之一[6]。

我們對海南漢族人群中腦梗死和健康對照進(jìn)行了比對研究，結(jié)果顯示兩組中均可檢測出三種基因型GG、GA、AA，三種基因型在實(shí)驗(yàn)組中的分布頻率為7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在對照組中的分布頻率為159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）組間基因型分布頻率均無明顯差異（P>0.05）。等位基因G和A在實(shí)驗(yàn)組的分布頻率為211（70.3%）、89（29.7%），在對照組中的分布頻率為430（69.1%）、192（30.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示組間差異無顯著（P>0.05）。以上研究結(jié)果說明，ET-1的Taq I位點(diǎn)多態(tài)性與海南漢族腦梗死疾病沒有關(guān)聯(lián)性。

參考文獻(xiàn)

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[3]楊發(fā)滿.老年腦梗死患者血栓調(diào)節(jié)蛋白及IL-6水平[J].中國老年學(xué)雜志，2013，（第18期）：4573-4574

[4]李紅娟，李慶.腦梗死患者相關(guān)危險(xiǎn)因素分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]劉靜波.急性腦梗死患者血漿內(nèi)皮素表達(dá)水平的臨床研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭麗瑋，周建中，王珍，竇貴旺，鐘望濤，吳志紅.內(nèi)皮素-1基因多態(tài)性與高血壓缺血性卒中的關(guān)系[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，（第1期）：116-121