慢性鎘暴露小鼠的肝脂質(zhì)組學(xué)研究

郝蓉蓉,李 玲,田 麗,謝 佳,陳夢(mèng)妍,余爭(zhēng)平,皮會(huì)豐 （陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系軍隊(duì)勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室/教育部電磁輻射醫(yī)學(xué)防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038）

鎘屬于有毒重金屬，其化合物被廣泛用于電池、染料、電鍍、化妝品、香煙等，在日常生活中十分常見(jiàn)。含鎘廢物若處理不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致鎘污染。富含鎘的飲食和飲水是人鎘暴露的主要途徑[1]。鎘在人體主要蓄積于肝和腎[2]，并對(duì)其造成損傷。目前，因脂質(zhì)代謝異常引發(fā)的疾病是最常見(jiàn)的慢病。研究表明，脂質(zhì)代謝參與了高脂血癥、肥胖、2 型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和皮膚病變的發(fā)生及發(fā)展[3]。流行病學(xué)研究表明，鎘接觸與中年人非酒精性脂肪性肝病的患病有關(guān)[4]。既往有研究通過(guò)氯化鎘灌胃成功構(gòu)建了鎘暴露小鼠非酒精性脂肪性肝病模型[5]。還有研究顯示，鎘暴露會(huì)加重原有的非酒精性脂肪性肝病[6]。但目前對(duì)于鎘暴露誘導(dǎo)肝脂質(zhì)譜的變化仍然缺乏系統(tǒng)研究。

脂質(zhì)組學(xué)是一種基于高通量分析技術(shù)，系統(tǒng)性解析生物體脂質(zhì)組成與表達(dá)變化的研究模式，其可高效研究脂類家族和脂質(zhì)分子在各種生物過(guò)程中的改變與功能，進(jìn)而闡明相關(guān)的生物活動(dòng)過(guò)程與機(jī)制[7]。目前，脂質(zhì)組學(xué)分析一般采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），主要分為非靶向分析和靶向分析兩類。本研究采用基于UPLC-Orbitrap 質(zhì)譜系統(tǒng)的非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析平臺(tái)[8]，并結(jié)合LipidSearch（Thermo Scientific?）軟件進(jìn)行脂質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用相對(duì)定量對(duì)組間的差異進(jìn)行分析，并通過(guò)KEGG 富集篩選出差異脂質(zhì)分子參與的代謝通路，為進(jìn)一步了解慢性鎘暴露誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

本次實(shí)驗(yàn)所用均為SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠（8 周齡），由陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)20170002，使用許可證號(hào)：SYXK(渝)20170002］提供。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)過(guò)程及動(dòng)物處死方法均經(jīng)陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)審核通過(guò)（AMUWEWC2020059）。氯化鎘購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 構(gòu)建慢性鎘暴露小鼠模型和樣本收集

雄性C57BL/6J小鼠12只，在SPF級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（正常水喂養(yǎng)）和實(shí)驗(yàn)組[鎘水（0.6 mg/L CdCl2）喂養(yǎng)]，每組6 只。小鼠自由飲水及進(jìn)食6 個(gè)月后處死，即刻采集肝組織后存放于-80 ℃冰箱中，干冰運(yùn)送至上海中科新生命有限公司進(jìn)行LC-MS/MS分析，測(cè)定肝脂質(zhì)組學(xué)。

1.3 樣本預(yù)處理方法

取適量小鼠肝組織樣本，剪碎后加入200 μL 水渦旋，加入800 μL 甲基叔丁基醚渦旋混合，加入240 μL預(yù)冷甲醇渦旋混合，低溫水浴中超聲20 min，室溫放置30 min，14 000 g 10 ℃離心15 min，取上層有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?；質(zhì)譜分析時(shí)加入200 μL 90%異丙醇/乙腈溶液復(fù)溶，充分渦旋，取90 μL 復(fù)溶液，14 000 g 10 ℃離心15 min，取上清進(jìn)樣分析。

1.4 LC-MS/MS

色譜分析：樣品采用UHPLC Nexera LC-30A 超高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。C18色譜柱；柱溫45 ℃；流速300 μL/min。流動(dòng)相A 為乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4，v/v），流動(dòng)相B 為乙腈異丙醇溶液（乙腈∶異丙醇=1∶9，v/v）。

質(zhì)譜分析：采用電噴霧電離（正離子和負(fù)離子模式）進(jìn)行檢測(cè)，樣品經(jīng)UHPLC分離后采用Q Exactive系列質(zhì)譜儀（Thermo Scientific?）進(jìn)行質(zhì)譜分析。按照下列方法確定脂質(zhì)分子和脂質(zhì)碎片的質(zhì)荷比：每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan，HCD）。MS1在質(zhì)荷比為200 時(shí)分辨率為70 000，MS2在質(zhì)荷比為200 時(shí)分辨率為17 500。

1.5 脂質(zhì)組學(xué)KEGG分析

通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)篩選的差異脂質(zhì)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.6 油紅O染色

取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠肝冰凍切片，然后用4%多聚甲醛固定，放入新配過(guò)濾的油紅O 工作液,浸染8~10 min（加蓋避光）后進(jìn)行背景分化，取出切片停留3 s后浸入60%異丙醇10 min，隨后進(jìn)行細(xì)胞核蘇木素染色3~5 min，最后返藍(lán)液返藍(lán)1 s,自來(lái)水中浸洗。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01 為差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝組織油紅O染色

取小鼠部分肝組織進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯脂滴沉積或增多，見(jiàn)圖1。

圖1 油紅O染色

2.2 模型質(zhì)量驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)組學(xué)探究鎘暴露小鼠脂代謝相關(guān)的脂質(zhì)分子的變化，反映鎘暴露對(duì)小鼠脂代謝水平的影響。對(duì)鑒定到的脂質(zhì)分子進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在PCA 得分圖上均有不同的聚類趨勢(shì)（圖2a），說(shuō)明2 組小鼠的肝組織中脂質(zhì)成分存在顯著差異。正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）得分圖顯示，實(shí)驗(yàn)組樣本均遠(yuǎn)離對(duì)照組樣本，提示鎘暴露可明顯改變小鼠體內(nèi)內(nèi)源性脂質(zhì)水平（圖2b）。同時(shí)，為避免OPLS-DA中發(fā)生過(guò)擬合，采用置換檢驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)，以保證模型的有效性。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到的置換檢驗(yàn)顯示，OPLS-DA 模型評(píng)價(jià)質(zhì)量較好(R2y=0.989；Q2=0.921；R2X=0.592)，見(jiàn)圖2c。火山圖顯示，調(diào)整后的P值與鎘暴露后相關(guān)的脂質(zhì)含量變化倍數(shù)(fold change,FC)之間的關(guān)系（FC>1.5、P<0.05）為FC越大，差異越顯著（圖2d）。以上檢驗(yàn)均提示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組樣本之間存在顯著差異，表明鎘暴露導(dǎo)致肝脂質(zhì)代謝發(fā)生了顯著改變。

圖2 模型質(zhì)量驗(yàn)證

2.3 脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果分析

本研究基于OPLS-DA 模型篩選出與鎘暴露密切相關(guān)的差異代謝物，正、負(fù)離子模式下鑒定到的樣本中脂質(zhì)亞類共43種，包含各類中鑒定到的脂質(zhì)分子共2 709個(gè)（圖3a）。脂質(zhì)組成分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中排名前10 的脂質(zhì)亞類為磷脂酰膽堿（PC）37.572%、三酰甘油（TG）32.22%、磷脂酰乙胺醇（PE）8.916%、二酰甘油（DG）5.747%、磷脂酶C（LPC）4.318%、磷脂（SM）2.051%、鞘神經(jīng)酰胺（Cer）1.513%、磷脂酰肌醇（PI）1.242%、鞘氨醇（SPH）1.212% 和甾醇酯類（ST）0.942%（圖3b）。對(duì)照組排名前10 的脂質(zhì)亞類為三酰甘油（TG）48.316%、磷脂酰膽堿（PC）27.832%、二酰甘油（DG）6.149%、磷脂酰乙胺醇（PE）6.138%、磷脂酶C(LPC)3.864%、鞘磷脂（SM）1.646%、神經(jīng)酰胺（Cer）0.926%、磷脂酰肌醇（PI）0.85%、鞘氨醇（SPH）0.811%、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）0.704%(圖3c)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組磷脂酰乙胺醇（PE）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酶C（LPC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘氨醇（SPH）、甾醇酯類（ST）、神經(jīng)酰胺（Cer）占比增加，二酰甘油（DG）、三酰甘油（TG）占比減少，提示在慢性鎘暴露下肝組織含甘油占比下降。

圖3 脂質(zhì)亞類組成

2.4 顯著性差異脂質(zhì)分子的鑒定

以VIP>1 和P<0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選到144 個(gè)具有顯著性差異的脂質(zhì)分子，涉及17 種脂質(zhì)亞類：三酰甘油（TG）、二酰甘油（DG）、甘油一酯（MG）、甘油磷脂（PA）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙胺醇（PE）、磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）、鞘磷脂（phSM）、鞘氨醇（SPH）、甾醇酯類（ST）、心磷脂（CL）、神經(jīng)酰胺（Cer）、輔酶（Co）、己糖神經(jīng)酰胺（Hex1Cer）、磷脂酶C（LPC），見(jiàn)圖4a。實(shí)驗(yàn)組中共有68 種差異脂質(zhì)分子上調(diào)，76種差異脂質(zhì)分子下調(diào)（圖4b）。將差異脂質(zhì)分子通過(guò)KEGG 富集得到6 種通路：甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇（GPI）生物合成、甘油脂代謝、花生四烯酸代謝（圖4c）。

圖4 顯著差異分子表達(dá)

2.5 顯著性差異脂質(zhì)分子的鏈長(zhǎng)度分析

對(duì)篩選出來(lái)的43 種脂質(zhì)亞類進(jìn)行分子層面的分析發(fā)現(xiàn)，在碳原子數(shù)目總和（C）>21的長(zhǎng)鏈脂肪酸中含有顯著性差異的脂質(zhì)亞類16 種（圖5a、b），12

圖5 不同碳鏈長(zhǎng)度脂質(zhì)分子分析

3 討論

鎘作為有毒重金屬，進(jìn)入人體后在體內(nèi)蓄積，半衰期為10～30年[9]。肝是脂質(zhì)代謝最主要的場(chǎng)所。本課題組前期研究顯示，與對(duì)照組相比，慢性鎘暴露組小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量顯著增加，HE 染色提示肝組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)局灶性壞死，肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變[10]。本研究采用鎘水（0.6 mg /L CdCl2）喂養(yǎng)6個(gè)月的方式，深入了解慢性鎘暴露對(duì)肝脂質(zhì)代謝的影響[11]。既往研究報(bào)道，小鼠在飲用鎘水（0.6 mg/L CdCl2）13周后測(cè)得血鎘濃度為0.3～0.4 μg/L[12]，與美國(guó)一般非吸煙者人群血鎘濃度相當(dāng)[13]。我國(guó)成年男性的血鎘濃度為0.38～2.88 μg/L,成年女性的血鎘濃度為0.31～0.92 μg/L[14]。研究表明，鎘污染環(huán)境地表水和地下水中鎘濃度為0.025~6.26 mg/L[15]。因此，本研究中使用的鎘濃度相對(duì)較低，與環(huán)境相關(guān)，能夠模擬建立長(zhǎng)期鎘暴露環(huán)境。既往研究通過(guò)給C57BL/6J 小鼠自由飲用鎘水（10 mg/L）20 周，行脂質(zhì)油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠有大量脂滴沉積于肝組織，且出現(xiàn)非酒精性脂肪性肝病的改變[5]。本研究通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行鎘水喂養(yǎng)24周后對(duì)肝組織進(jìn)行脂質(zhì)油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠未見(jiàn)脂滴形成。由于本研究所采用的鎘濃度（0.6 mg/L CdCl2）遠(yuǎn)低于10 mg/L,因此考慮劑量差異導(dǎo)致肝組織油紅O 染色未見(jiàn)脂滴形成，但不否定肝代謝發(fā)生異常變化。我們進(jìn)一步對(duì)肝組織行脂質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了144種具有顯著差異的脂質(zhì)分子；進(jìn)行通路富集發(fā)現(xiàn)，這些差異脂質(zhì)分子主要參與甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、糖基磷脂酰肌醇生物合成、甘油酯代謝、花生四烯酸代謝。

三酰甘油是一種化合物，由甘油的3 個(gè)羥基與3 個(gè)脂肪酸分子酯化生成的甘油酯，其增高可使血液黏稠度增加，加速動(dòng)脈粥樣硬化，從而引發(fā)心血管疾病[16-18]。脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)大量積聚可導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病的產(chǎn)生[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，三酰甘油(11:0_10:1_16:0)和三酰甘油(16:0_16:1_18:2)在實(shí)驗(yàn)組中顯著增高，可能成為前期非酒精性脂肪性肝病的潛在生物分子指標(biāo)。二酰甘油具有多種營(yíng)養(yǎng)功能，能夠預(yù)防肥胖、高血糖、心血管疾病，抑制胰島素抵抗，減輕非酒精性脂肪性肝病的癥狀[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的二酰甘油明顯降低，這一改變可能對(duì)非酒精性脂肪性肝病的形成提供了條件。磷脂是生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類。甘油磷脂主要包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇，磷脂酰膽堿分布最廣，也是二酰甘油、溶血磷脂酰膽堿和花生四烯酸等脂質(zhì)信使的前體。有研究表明，磷脂酰乙醇胺n-甲基轉(zhuǎn)移酶敲除(Pemt（-/-）)小鼠的磷脂酰膽堿(PC)/磷脂酰乙醇胺(PE)下降會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，引發(fā)肝損傷，并發(fā)展為非酒精性脂肪性肝病[22]。通過(guò)給Pemt(-/-)小鼠喂養(yǎng)缺乏膽堿飲食會(huì)發(fā)生快速非酒精性脂肪性肝病，導(dǎo)致肝功能衰竭[23]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中磷脂酰膽堿(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)占比均發(fā)生改變(實(shí)驗(yàn)組中PC/PE 約為4.21，對(duì)照組中PC/PE 約為4.46)。根據(jù)本次結(jié)果，我們認(rèn)為慢性鎘暴露有可能會(huì)使PC/PE 降低，進(jìn)而改變肝細(xì)胞膜的完整性，誘發(fā)肝損傷，造成非酒精性脂肪性肝病。神經(jīng)酰胺是由長(zhǎng)鏈脂肪酸與鞘氨醇的氨基經(jīng)脫水而形成的一類酰胺化合物[24]，其可以破壞胰島素敏感性、胰腺β細(xì)胞功能、血管反應(yīng)性和線粒體代謝，在大鼠和小鼠中抑制神經(jīng)酰胺生物合成，誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺降解可以改善許多代謝疾病，包括糖尿病、心肌病、胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病[25-27]。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去除二氫神經(jīng)酰胺去飽和酶或增加酸性神經(jīng)酰胺酶活性來(lái)降低肝的神經(jīng)酰胺水平時(shí)，肝脂肪變性減少[28]。臨床數(shù)據(jù)顯示，非酒精性脂肪性肝病患者神經(jīng)酰胺水平顯著增加[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)酰胺水平明顯升高，但未發(fā)現(xiàn)明顯脂滴沉積，表明機(jī)體存在自我保護(hù)機(jī)制，有助于抑制因神經(jīng)酰胺水平升高而引起的非酒精性脂肪性肝病，使機(jī)體處于代償期。同時(shí)，差異脂質(zhì)分子參與甘油酯、亞油酸和花生四烯酸的代謝，這3 種代謝通路均與非酒精性脂肪性肝病的形成有關(guān)[30-33]。

綜上所述，本研究通過(guò)建立慢性鎘暴露雄性小鼠模型分析發(fā)現(xiàn)，慢性鎘暴露可引起肝脂質(zhì)代謝紊亂，由于機(jī)體的自我保護(hù)能力和疾病發(fā)展的病理生理過(guò)程，可能鎘暴露的時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，其造成的肝脂質(zhì)紊亂會(huì)發(fā)展為非酒精性脂肪性肝病。但本研究?jī)H采用雄性小鼠，不能完全代表慢性鎘暴露后小鼠的肝脂質(zhì)代謝的變化情況。后期我們將優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)構(gòu)建雌雄各半的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，進(jìn)一步研究慢性鎘暴露誘導(dǎo)肝的脂質(zhì)改變及其具體機(jī)制。