黑牛肝菌多糖提取工藝比較及其體外抗氧化活性研究

王俊杰，牛 蓓，2，時(shí)小東，胡凱丹，徐 鶯

（1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065）

0 引言

黑牛肝菌（Boletus aereus Fr.ex Bull），牛肝菌屬大型可食用真菌，在我國(guó)主要分布于云南、四川、貴州等地區(qū)［1］。其子實(shí)體“低脂、低熱、高蛋白”，富含多種礦物質(zhì)元素以及人體必需氨基酸，是一種食藥兩用的野生真菌［2－6］。當(dāng)前，黑牛肝菌多數(shù)以鮮品或干品的形式直接售賣(mài)，功能挖掘和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工作缺乏，導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益較低，尋找并開(kāi)發(fā)其中的生物活性物質(zhì)是提升黑牛肝菌附加值，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)和利用的途徑之一［3］。

多糖是屬于黑牛肝菌的重要生物活性成分之一，其具有降糖、降脂、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等出色的保健功效［1］。黑牛肝菌多糖高效提取方法的建立是其開(kāi)發(fā)利用的前提。已報(bào)道的方法有超聲輔助萃取、水提醇沉法等［7］，但關(guān)于超聲輔助復(fù)合酶法提取黑牛肝菌多糖的報(bào)道未見(jiàn)描述。本研究開(kāi)展3 種提取黑牛肝菌多糖方法效率的比較研究，并采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助復(fù)合酶提取法條件，最后采用不同的方法測(cè)試所獲得的不同醇沉組分多糖的體外抗氧化活性，以期為黑牛肝菌多糖資源產(chǎn)業(yè)化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮黑牛肝菌子實(shí)體樣品購(gòu)自云南省西雙版納州景洪市牛夫人鮮黑牛肝菌栽培基地，洗凈除雜后，50℃烘干打粉，過(guò)60 目篩后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

熱水提取法。精確稱(chēng)取黑牛肝菌子實(shí)體干粉5 g于錐形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 40、1 ∶ 60、1∶ 80、1∶ 100 g／mL）與蒸餾水混合后進(jìn)行水?。?0、60、70、80、90℃），水浴時(shí)間為（1、2、3、4、5 h）。5 000 r／min離心10 min 并過(guò)濾后收集上清。保持條件不變復(fù)提2 次，第2 次和第3 次所用溶劑體積均為第1 次的50%。合并上清，真空濃縮至原體積的1／4 左右，加入無(wú)水乙醇至終濃度為80%。4℃靜置過(guò)夜后離心（6 000r／min，10min），沉淀復(fù)溶于水后加入1／5 體積的Sevage 試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶ 1），劇烈震蕩30min 后離心，除去中間變形蛋白層和下層有機(jī)試劑層，重復(fù)該過(guò)程直至蛋白層稀薄為止。將獲得的上清液在3 500Da透析袋中透析48h后，冷凍干燥，獲得黑牛肝菌多糖。

超聲提取法。精確稱(chēng)取黑牛肝菌子實(shí)體干粉5 g于錐形瓶中，以料液比（1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1∶ 50、1∶ 60g／mL）和蒸餾水混合后水浴，水浴初始設(shè)定溫度為30℃，在不同水浴功率（200、240、280、320、360 W）和不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）的條件下進(jìn)行處理。其余步驟同1.2.1.1 熱水提取法。

超聲輔助復(fù)合酶提取法。精確稱(chēng)取黑牛肝菌子實(shí)體干粉5 g 于錐形瓶中，加入不同濃度（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%）的復(fù)合酶溶液（纖維素酶：木瓜蛋白酶＝2∶ 1），在不同酶解溫度（30、40、50、60、70℃）、酶解時(shí)間（30、60、90、120、150 min）和超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，之后在100℃水浴鍋中加熱10 min滅活。其余步驟與熱水提取法相同。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

選擇黑牛肝菌多糖最終得率最高的提取方法，選擇酶添加量、處理溫度和時(shí)間為自變量，以提取率為響應(yīng)值，依據(jù)Box－Behnken原理進(jìn)行設(shè)計(jì)進(jìn)行行因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.3 多糖分級(jí)醇沉組分的制備

向超聲輔助復(fù)合酶提取法獲得的提取上清液中緩慢添加無(wú)水乙醇至乙醇體積比達(dá)到20%，4 ℃靜置12 h，離心（5 000 r／min，15 min），沉淀經(jīng)冷凍干燥后得到20%醇沉多糖組分BAP－20。在上清液中繼續(xù)添加無(wú)水乙醇至體積比為40%、60%、80%，重復(fù)以上操作，得到40%醇沉多糖組分BAP－40、60%醇沉多糖BAP－60 和80%醇沉多糖BAP－80。

1.2.4 多糖測(cè)定

依照鐘方曉等報(bào)道的苯酚—硫酸法［8］進(jìn)行多糖含量測(cè)定。取2.0mL 不同濃度葡萄糖溶液和1.0mL6%苯酚、5.0mL濃硫酸搖勻靜置，30min后測(cè)量490nm吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后將經(jīng)同樣處理的多糖樣品的光吸收值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出多糖濃度。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定。參考王宏亮等報(bào)道的方法［9］進(jìn)行。吸取不同濃度的多糖溶液1 mL與2 mL 的含1 mmol／L DPPH 的乙醇溶液充分混勻，黑暗下靜置30 min，離心10 min 取上清液測(cè)量520 nm處吸光值（A1）。相同濃度的Vc溶液為正對(duì)照。無(wú)水乙醇為樣品對(duì)照組（A2）、純水為空白對(duì)照組（A0）。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

羥自由基清除能力測(cè)定。參考Zhang 等方法［10］進(jìn)行。吸取不同濃度的多糖溶液1 mL 與1 mL ABTS工作液混勻，黑暗下靜置6 min后測(cè)量734 nm 處吸光值。以相同濃度的Vc 溶液為正對(duì)照。ABTS自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A1為樣品組吸光值；A2為對(duì)照組吸光值；A0為空白對(duì)照組吸光值。

還原力測(cè)定。參照馬麗媛等研究所提出的鐵氰化鉀還原法［11］并略作改動(dòng)。取0.5 mL多糖溶液加入10 mL具塞試管中，與2.5 mL0.2 mol／L 磷酸緩沖液（pH 6.6）混勻，加入鐵氰化鉀溶液至終濃度為1%，于 50℃水 浴 20 min 后 與 2.5 mL10%CCl3COOH溶液混勻，3 000 r／min 離心10 min。取2.5 mL上清液、0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液和2.5 mL蒸餾水混勻，充分反應(yīng)10 min 后，于700 nm 處測(cè)定吸光值［12］。

1.2.6 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，獲得數(shù)據(jù)使用Excel 2010、SPSS Statistics 24、Origin 2022 以及方差分析（ANOVA）進(jìn)行處理和顯著性分析。響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design－Expert 12 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 三種黑牛肝菌多糖提取方法的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 熱水提取法的單因素實(shí)驗(yàn)

采用熱水提取法測(cè)定不同液料比、提取時(shí)間和溫度參數(shù)下黑牛肝菌多糖的提取率（圖1A）。當(dāng)固定提取溫度和液料比為70℃和1：60g／mL 時(shí)，多糖得率隨提取時(shí)間增加而逐漸升高，在4h 時(shí)達(dá)到最高。但當(dāng)提取時(shí)間增至5 h 時(shí)后，多糖得率反而略有下降，這可能是因?yàn)樗r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致部分多糖發(fā)生水解所致［13］。將提取時(shí)間和液料比設(shè)定為4h和1：60g／mL 時(shí)，測(cè)試的提取溫度范圍從50℃到90℃，多糖得率同樣表現(xiàn)為先升高后下降，最佳溫度為70℃。設(shè)定提取溫度和時(shí)間分別為70℃和4h，液料比在1：20g／mL到1∶ 100g／mL范圍內(nèi)變化，當(dāng)料液比為1∶ 80 g／mL時(shí)得率最高。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Single－factor experiments

綜上可得，熱水提取法提取黑牛肝菌多糖的最佳條件為：水浴時(shí)間4 h，水浴溫度70 ℃，料液比為1∶ 80 g／mL。

2.1.2 超聲提取法的單因素實(shí)驗(yàn)

采用超聲提取法測(cè)定不同料液比、超聲時(shí)間和功率參數(shù)對(duì)黑牛肝菌多糖提取效率的影響（圖1B）。在料液比為1∶ 40g／mL、超聲功率為280W 的條件下，超聲時(shí)間為20 min 時(shí)得率最高，之后隨著時(shí)間增加得率逐漸降低。這可能是因?yàn)槌晻?huì)促使多糖從組織中溶出，但隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多糖的降解，提取率降低［14］。在超聲時(shí)間為20min，超聲功率為280W 的條件下，料液比為1∶ 30 g／mL 時(shí)，多糖得率達(dá)到6.74%。但當(dāng)料液比繼續(xù)增加后，多糖得率反而呈下降趨勢(shì)。這可能是由于增大溶劑量雖然可以使溶出更充分，而溶劑量過(guò)大會(huì)影響后續(xù)的濃縮沉淀工藝，導(dǎo)致得率降低［15］。在超聲時(shí)間為20min、料液比為1∶ 30g／mL時(shí)，多糖得率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在280 W時(shí)達(dá)到最高。這可能是由于超聲功率過(guò)小使得系統(tǒng)接收的能量小，分子運(yùn)動(dòng)速度相對(duì)偏慢，破碎效率低，而過(guò)大的功率又會(huì)影響多糖結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致得率變低所致［16］。

綜上可得，超聲提取法提取黑牛肝菌的最佳條件為：超聲時(shí)間20 min，超聲功率280W，料液比為1∶ 30g／mL。

2.1.3 超聲輔助復(fù)合酶提取法的單因素實(shí)驗(yàn)

采用超聲輔助復(fù)合酶提取法測(cè)定不同酶添加量、酶解時(shí)間和溫度、超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響（圖1C）。在酶解溫度為50℃、酶添加量為2.50%、超聲時(shí)間為30min的條件下，在30—60 min 的時(shí)間內(nèi)，多糖提取率呈上升趨勢(shì)，60—150 min 則呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵诿噶砍渥愕那闆r下，隨著酶解時(shí)間的增加，不僅底物被不斷消耗，溶出的黑牛肝菌多糖也會(huì)被酶水解而減少所致［11］。在酶解時(shí)間為60min、酶添加量為2.50%、超聲時(shí)間為30min的條件下，隨著酶解溫度的不斷升高，多糖得率呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢(shì)，在40℃時(shí)達(dá)到最高。出現(xiàn)這種趨勢(shì)是由于溫度太低或太高都會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致其分解速率下降，從而影響多糖得率。在酶解時(shí)間為60min、酶解溫度為40℃、超聲時(shí)間為30min的條件下，多糖得率在酶添加量從1.5 %到2.00%呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，達(dá)到最高點(diǎn)，然后隨著酶添加量的繼續(xù)增加開(kāi)始緩慢下降。出現(xiàn)該趨勢(shì)可能是當(dāng)酶的添加量偏低時(shí)，底物充分，得率由酶的數(shù)量驅(qū)動(dòng)，而當(dāng)酶添加量高于2.0 0%時(shí)，由于酶分子處于飽和狀態(tài)，反應(yīng)變?yōu)榈孜矧?qū)動(dòng)型，在底物濃度不變的情況下，底物水解速度不再增加，同時(shí)未參與纖維素降解的酶以多糖為底物將之水解，進(jìn)而影響多糖含量［17］。在酶添加量為2.00%、酶解時(shí)間60min、溫度為40℃的條件下，超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響為先上升再下降，最佳超聲時(shí)間為20 min。

綜上可得，超聲輔助復(fù)合酶提取的最佳條件為：酶解時(shí)間60 min，酶解溫度40℃，酶添加量2.00%，超聲時(shí)間20 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超聲輔助復(fù)合酶提取法的得率最高。選擇該方法中對(duì)多糖得率影響較大的3 個(gè)因素（酶解溫度、酶添加量和酶解時(shí)間）為變量，以多糖得率為響應(yīng)值，采用Box－Behnken 組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)，開(kāi)展包括12 個(gè)析因點(diǎn)及5 個(gè)中心點(diǎn)組成的共17 組實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示，方差分析結(jié)果如表3 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of ANOVA analysis

利用Design－Expert軟件對(duì)表2 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到多糖提取率的多元二次回歸模型：Y ＝18.33 ＋0.2875A－0.125B ＋0.8025C－0.4750AB ＋0.6AC－0.225BC－1.61A2－0.802B2－1.68C2。

由表3 可知，超聲輔助復(fù)合酶提取法的多糖得率回歸模型的p值小于0.000 1，達(dá)到極顯著水平，說(shuō)明模型擬合精度良好，可用于后續(xù)提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)。失擬項(xiàng)p ＝0.507 1 ＞0.05，模型總決定系數(shù)R2＝0.998 4，adj＿R2＝0.996 4，說(shuō)明模型擬合優(yōu)度較好，試驗(yàn)誤差小，可用于響應(yīng)值的預(yù)測(cè)［18－20］。

根據(jù)響應(yīng)面的陡峭程度、等高線(xiàn)形狀分析各因素變化對(duì)多糖得率的影響以及因素間交互作用的強(qiáng)弱及影響作用的大小［20］結(jié)果如圖2 所示。由圖2可知，酶添加量、酶解時(shí)間和溫度3 個(gè)因素兩兩之間的交互作用對(duì)黑牛肝菌多糖提取率的影響都非常顯著，并且該結(jié)果與回歸分析保持一致。當(dāng)固定酶解時(shí)間時(shí)，酶解溫度曲線(xiàn)的陡峭程度大于酶添加量的曲線(xiàn)，表明酶解溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響大于酶添加量（圖2A）。在固定酶添加量時(shí)，響應(yīng)曲面圖開(kāi)口向下，兩個(gè)方向的響應(yīng)面均呈現(xiàn)出先上升后下降的陡峭變化曲線(xiàn)，即酶解溫度和酶解時(shí)間的增加對(duì)多糖得率的影響都是先促進(jìn)后抑制，這與單因素結(jié)果保持一致（圖2B）。從圖2C 可見(jiàn)，當(dāng)固定酶解溫度時(shí)，酶添加量和水浴時(shí)間對(duì)多糖得率的影響均是先增加再降低的趨勢(shì)。

圖2 因素間交互作用對(duì)黑牛肝菌多糖提取的影響Figure 2 Influence of response surface plots of variable parameters on the B.aereus polysaccharide yield

綜上，優(yōu)化結(jié)果為：酶解溫度42.7 ℃，酶解時(shí)間67 min，酶添加量為1.92 %，超聲時(shí)間為20 min。此方案下的預(yù)期黑牛肝菌多糖得率為18.867%。

2.3 黑牛肝菌多糖的體外抗氧化活性研究

對(duì)獲取的黑牛肝菌多糖水溶液進(jìn)行逐級(jí)醇沉，獲得不同分子量的4 種組分：BAP20、BAP40、BAP60和BAP80，4 種組分的多糖含量分別為86.01%、69.55%、75.95%、65.61%。以Vc 為對(duì)照，分別采用DPPH、ABTS、羥自由基清除能力和還原力測(cè)定4種方法測(cè)定4 種組分的體外抗氧化活性，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 黑牛肝菌多糖的體外抗氧化活性Figure 3 The in vitro antioxidant activity of B.aereus polysaccharides

結(jié)果顯示，各醇沉組分均展示出了劑量依賴(lài)性的抗氧化能力，其中BAP－80 的各項(xiàng)抗氧化活性均最高。當(dāng)濃度為5mg／mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到68.03%，在此濃度下的維生素C 清除率為72.37%，兩者無(wú)顯著性差異（p ＞0.05）；ABTS自由基清除率為94.65%，同濃度維生素C 清除率為89.83%，黑牛肝菌多糖對(duì)于A(yíng)BTS 自由基的清除能力略高于維生素C；羥自由基清除率為62.85%，同等濃度的維生素C 清除率達(dá)到85.62%，黑牛肝菌多糖的羥自由基清除能力遠(yuǎn)低于維生素C。黑牛肝菌多糖同樣具有良好的還原能力，BAP－80 依然為最高活性組分。分析不同醇沉組分的組內(nèi)關(guān)系，基本呈現(xiàn)出醇沉濃度越高，得到的多糖組分抗氧化活性越高的趨勢(shì)。

3 討論

高得率的多糖提取方法是黑牛肝菌多糖開(kāi)發(fā)利用的前提，本研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助復(fù)合酶提取法的多糖得率遠(yuǎn)高于其它兩種方法，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化后的平均得率為18.47%，并且獲得的黑牛肝菌多糖表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性，說(shuō)明黑牛肝菌多糖具有深度開(kāi)發(fā)的潛力。

在黑牛肝菌多糖提取中，熱水提取法的得率在5%左右，提取時(shí)間在4h 左右［21］，超聲輔助提取法的得率約為 10%，提取時(shí)間僅需 30min 左右［12，22－24］。兩相比較可以看出后者不僅在得率上達(dá)到提高，在時(shí)間效率方面也有很大優(yōu)勢(shì)，可以降低提取能耗。超聲輔助復(fù)合酶提取法則在保持超聲輔助提取法的優(yōu)勢(shì)上，進(jìn)一步將多糖得率提高了80%，這無(wú)疑會(huì)大大降低原料成本。從原理上來(lái)說(shuō)，真菌的多糖組要存在于其細(xì)胞壁，后者包括纖維素、殼多糖、蛋白質(zhì)以及其他次生代謝產(chǎn)物。超聲處理和酶解處理都能促進(jìn)細(xì)胞壁的破碎，釋放出其中的多糖分子。不僅如此，超聲還可形成微流，使溶劑更易進(jìn)入，使得酶與細(xì)胞壁接觸更充分。有文獻(xiàn)研究表明纖維素酶對(duì)纖維素的可及性是制約酶解效率的重要參數(shù)，貢獻(xiàn)度達(dá)到90%以上［26］，因此超聲和酶解共同處理的效果不是單純的數(shù)量相加關(guān)系。

抗氧化活性是多糖的主要生物活性之一。影響多糖抗氧化活性高低的因素很多，如分子量、糖基組成、鏈結(jié)構(gòu)等，一般而言，高分子量、復(fù)雜的多糖結(jié)構(gòu)可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。然而有意思的是，本研究中分子量最低的BAP—80 組分體外抗氧化活性表現(xiàn)最為突出。已有文獻(xiàn)報(bào)道云南大理黑牛肝菌同樣在醇沉濃度為80%時(shí)得到的多糖提取物抗氧化活性最強(qiáng)［7］?？紤]到BAP—80 組分的多糖含量在4 種組分中最低，因此不能排除其中可能含有其他成分如多酚、糖醛酸、蛋白類(lèi)物質(zhì)參與了氧化還原反應(yīng)［27－29］，因此在后續(xù)的研究中非常有必要開(kāi)展進(jìn)一步的純化工作。