響應(yīng)面法優(yōu)化栗蘑多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

牛牧青　徐婉婷　龍麗芳　呂銳玲　徐碧林　鄭永良

摘要：為優(yōu)化栗蘑多糖提取工藝，以栗蘑子實(shí)體為研究對(duì)象，通過(guò)硫酸-苯酚滴定法，結(jié)合紫外分光光度法測(cè)定栗蘑多糖提取率。在單因素多水平實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法，利用Design-Expert軟件，選取提取時(shí)間、提取溫度、提取液料比3個(gè)因素，設(shè)置三水平實(shí)驗(yàn)方案優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，栗蘑多糖最佳提取工藝為提取時(shí)間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1（mL/g），此條件下栗蘑多糖提取率為14.45%?？寡趸钚匝芯拷Y(jié)果表明，栗蘑多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基都具有較好的清除能力，在一定范圍內(nèi)，抗氧化活性隨著多糖濃度的增加而提高。

關(guān)鍵詞：栗蘑；多糖；響應(yīng)面法；提取工藝；優(yōu)化；抗氧化活性

中圖分類號(hào)：TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-9973（2024）01-0183-06

Optimization of Extraction Process of Polysaccharides from Grifola frondosa

by Response Surface Methodology and Study on Their Antioxidant Activity

NIU Mu-qingXU Wan-tingLONG Li-fangLYU Rui-ling

XU Bi-linZHENG Yong-liang1，3*

Abstract： In order to optimize the extraction process of Grifola frondosa polysaccharides， with Grifola frondosa fruit body as the research object， the extraction rate of polysaccharides from Grifola frondosa is determined by sulfuric acid-phenol titration method combined with ultraviolet spectrophotometry. On the basis of single-factor and multi-level experiment， response surface methodology and Design-Expert software are used to select three factors such as extraction time， extraction temperature and extraction liquid-solid ratio. A three-level experimental scheme is set up to optimize the extraction process. The results show that the optimum extraction conditions are as follows： extraction time is 1.9 h， extraction temperature is 80 ℃， extraction liquid-solid ratio is 37∶1（mL/g）， under such conditions， the extraction rate of polysaccharides is 14.45%. Antioxidant activity research results show that the polysaccharides from Grifola frondosa have good scavenging capacity on DPPH free radical and hydroxyl free radical. Within a certain range， the antioxidant activity increases with the increase of polysaccharides' concentration.

Key words： Grifola frondosa; polysaccharides; response surface methodology; extraction process; optimization; antioxidant activity

栗蘑（Grifola frondosa）俗稱灰樹(shù)花，又名舞茸、貝葉多孔菌，是一種十分珍貴的藥食同源蕈菌。野生栗蘑常見(jiàn)于板栗樹(shù)下，具有好氧、喜光的生長(zhǎng)特性[1]。隨著栗蘑栽培技術(shù)的推廣，栗蘑產(chǎn)業(yè)在河北遷西、浙江慶元已經(jīng)形成了一定規(guī)模，我國(guó)栗蘑產(chǎn)量得到了極大的提升[2-3]。栗蘑有著獨(dú)特的香味、脆嫩的口感，并且富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。栗蘑除了可以食用外，還具有極高的藥用價(jià)值，這得益于栗蘑中的生物活性成分，其中多糖作為栗蘑中含有的一種重要活性成分具有提高人體免疫力、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等功效[4-5]。

多糖是一種具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的天然大分子化合物[6]，目前關(guān)于多糖的提取主要采取水提法、酶提法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法等[7]。水提法主要利用多糖易溶于水的特性，且操作簡(jiǎn)單、方便快捷，因此是一種常用于提取多糖的方法[8-10]。響應(yīng)面法可以用于分析提取條件各因素之間的相互作用，是一種精密度高、可行性強(qiáng)的方法。為了提高栗蘑多糖的提取率，確保多糖活性的穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)選擇熱水浸提法對(duì)栗蘑多糖進(jìn)行提取，運(yùn)用Design-Expert 11軟件優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取條件，并測(cè)定栗蘑多糖的自由基清除能力，進(jìn)行抗氧化活性研究，為栗蘑及其相關(guān)功能產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

栗蘑菌種原種（Grifola frondosa JD01）：由本課題組分離保藏；栗蘑子實(shí)體：由課題組實(shí)驗(yàn)基地生產(chǎn)提供。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）、無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、無(wú)水乙醇、30%過(guò)氧化氫：滬試國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

V-5600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；3-18KS高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；MX-S渦旋振蕩器 美國(guó)Scilogex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將所得栗蘑子實(shí)體表面清洗干凈，烘干、粉碎成粉末狀，備用。

1.3.2 栗蘑多糖提取工藝

稱取栗蘑粉末5.0 g于錐形瓶中，按液料比40∶1 （mL/g）加入去離子水浸泡，隨后放置在70 ℃的水浴鍋中提取2 h，抽濾，棄去栗蘑廢渣，保留上清液，并濃縮至1/3，醇沉，放于溫度設(shè)置為4 ℃的冰箱中靜置8 h。在轉(zhuǎn)速為6 500 r/min的條件下離心10 min，保留下層沉淀，棄去上清液，再用無(wú)水乙醇洗滌3次后，重復(fù)上述操作，合并沉淀物，即得到栗蘑多糖。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照苯酚-硫酸比色法[11]繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 栗蘑多糖提取率的測(cè)定

按照1.3.3中的方法，測(cè)定多糖溶液的吸光度值，以去離子水為對(duì)照，根據(jù)得到的回歸方程計(jì)算得出栗蘑多糖提取率，計(jì)算公式如下：

栗蘑多糖提取率（%）=[（C×V×N）/（M×106）]×100%。

式中：C為回歸曲線方程計(jì)算得到的栗蘑多糖的濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為栗蘑粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

稱取栗蘑粉末5.0 g，分別以提取溫度、提取時(shí)間、提取液料比（去離子水體積與栗蘑粉末質(zhì)量的比例）為因素，控制單一變量，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，探究多糖提取的最佳條件。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 11軟件設(shè)置響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，分析提取條件各因素之間的交互作用對(duì)多糖提取率的影響，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

1.3.7 栗蘑多糖抗氧化活性研究

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考薛小蘭等[12]的方法，分別配制濃度為0.25，0.5，1，5 mg/mL的栗蘑多糖水溶液，計(jì)算栗蘑多糖的DPPH自由基清除率，同時(shí)以VC作陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率（%）=A空白－（A樣品－A對(duì)照）A空白×100%。

式中：A空白為不含樣品的空白組的吸光度值；A樣品為栗蘑多糖溶液的吸光度值；A對(duì)照為不含DPPH的對(duì)照組的吸光度值。

1.3.7.2 羥基自由基清除率測(cè)定

采用水楊酸法測(cè)定[13-14]，分別配制濃度為0.25，0.5，1，5 mg/mL的栗蘑多糖水溶液，計(jì)算羥基自由基清除率，并以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，計(jì)算公式如下：

羥基自由基清除率（%）=A空白－（A樣品－A對(duì)照）A空白×100%。

式中：A空白為不含樣品的空白組的吸光度值；A樣品為栗蘑多糖溶液的吸光度值；A對(duì)照為不含過(guò)氧化氫的對(duì)照組的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Design-Expert 11軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果進(jìn)行處理和分析，采用Origin 2021軟件進(jìn)行分析繪圖[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1得到回歸曲線方程：Y=0.016 8X－0.016 6，R2=0.999 2，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.2 栗蘑多糖提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取提取溫度為70 ℃、提取液料比為40∶1 （mL/g），將提取時(shí)間分別設(shè)定為1， 4 h，每個(gè)條件各做3組平行對(duì)照[17-18]。由圖2中a可知，提取時(shí)間在1～2 h之間，栗蘑多糖提取率隨著時(shí)間的增加而升高，在2 h時(shí)得到最大提取率。2 h以后，提取率隨著時(shí)間的增加逐漸降低。因此，用于響應(yīng)面優(yōu)化的提取時(shí)間選擇 3 h。

選取提取時(shí)間為2 h、提取液料比為40∶1 （mL/g），將提取溫度分別設(shè)定為60，70，80，90 ℃，每個(gè)條件各做3組平行對(duì)照[19]。由圖2中b可知，提取溫度在60～70 ℃之間，栗蘑多糖提取率隨著溫度的增加而不斷升高，溫度較低時(shí)，多糖不易溶出，得率較少。當(dāng)溫度上升至80～90 ℃時(shí)，體系中的栗蘑多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，造成含量減少，提取率逐漸降低，因此，用于響應(yīng)面優(yōu)化的提取溫度選擇60，70，80 ℃。

選取提取時(shí)間為2 h、提取溫度為70 ℃，將提取液料比分別設(shè)定為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，每個(gè)條件各做3組平行對(duì)照[20]。由圖2中c可知，提取液料比在20∶1～40∶1之間，栗蘑多糖提取率逐漸升高，當(dāng)液料比從40∶1增加到50∶1時(shí)，多糖提取率隨著液料比的增加反而降低。說(shuō)明前期溶液中溶劑較少，溶出的多糖較少，隨著液料比的增加，體系中溶劑增多，多糖溶出量也隨之增大，直至達(dá)到飽和狀態(tài)，栗蘑多糖不再繼續(xù)析出。因此，確定用于響應(yīng)面優(yōu)化的液料比選擇30∶1、40∶1、50∶1。

2.3 提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面模型擬合與顯著性分析檢驗(yàn)

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，依據(jù)方案開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，處理數(shù)據(jù)[21-22]，結(jié)果見(jiàn)表2。

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，可得到方程：Y=13.80+0.79A+1.46B+0.61C－1.20AB－0.30AC－1.15BC－2.31A2－0.78B2－0.94C2。

該模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3中方差分析結(jié)果可知，模型P<0.000 1，表明栗蘑多糖的提取率與各提取因素的回歸方程關(guān)系極顯著[23]；失擬項(xiàng)的P=0.149 2>0.05，不顯著，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與該模型的擬合度良好。由可信度分析可知R2=0.984 5， RAdj2=0.964 6，二者的差值小于0.2，表明實(shí)際值與預(yù)測(cè)值十分接近，且C.V.為3.28%，表明可信度高，因此可以用該模型來(lái)進(jìn)行栗蘑多糖提取工藝的優(yōu)化。

一次項(xiàng)分析表明，各因素對(duì)多糖提取率的影響大小為提取溫度>提取時(shí)間>提取液料比，由方差分析還可知，模型中AB、BC、A2、B2、C2對(duì)栗蘑多糖提取率的影響顯著，AC對(duì)栗蘑多糖提取率的影響不顯著。

2.3.2 響應(yīng)面三維模型分析

根據(jù)該回歸模型方程，繪制三維曲面圖及等高線圖，見(jiàn)圖3。

在三維曲面圖中可以得到一個(gè)開(kāi)口向下的凸面，表明栗蘑多糖提取率存在一個(gè)極大值。圖3中曲面坡度可以反映出所探究的因素對(duì)栗蘑多糖提取率影響的顯著性大小，曲面坡度越陡，表明影響越顯著；反之，曲面坡度越平緩，表明影響越不顯著[24]。

由圖3可知，3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素中對(duì)栗蘑多糖提取率的影響大小為提取溫度>提取時(shí)間>提取液料比，與方差分析結(jié)論一致。通過(guò)等高線圖分析可以得到兩個(gè)因素交互作用的程度大小，圖3中d和f圖更接近橢圓形，因此AB和BC的交互作用顯著。

2.4 最佳提取工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用Design-Expert 11軟件，以栗蘑多糖提取率最大值作為指標(biāo)，根據(jù)所得擬合模型進(jìn)行分析計(jì)算，可得到理論上最優(yōu)提取條件為提取時(shí)間1.93 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g），此時(shí)栗蘑多糖提取率為14.57%。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，依據(jù)實(shí)際條件將提取條件優(yōu)化為提取時(shí)間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g），進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到平均提取率為14.45%，與預(yù)測(cè)得出的栗蘑多糖提取率相差較小，表明通過(guò)優(yōu)化后得到的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.5 栗蘑多糖抗氧化性研究

2.5.1 DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率越大，說(shuō)明還原性越強(qiáng)，栗蘑多糖具有較好的抗氧化能力。不同濃度栗蘑多糖溶液的DPPH自由基清除率見(jiàn)圖4。

在一定的濃度范圍內(nèi)，栗蘑多糖具有較好的DPPH自由基清除能力，且與多糖溶液的濃度呈現(xiàn)出量效關(guān)系。由圖4可知，當(dāng)栗蘑多糖溶液濃度為5 mg/mL時(shí)，其DPPH自由基清除率存在最大值，為87.5%，與陽(yáng)性對(duì)照組VC的清除能力相差較小。綜上所述，栗蘑多糖有較好的抗氧化活性。

2.5.2 羥基自由基清除率

還原劑的能力越強(qiáng)，對(duì)羥基自由基的清除效果越好，不同濃度栗蘑多糖溶液的羥基自由基清除率見(jiàn)圖5。

由圖5可知，低濃度的多糖溶液羥基自由基清除率較小，且與VC陽(yáng)性對(duì)照組相差較大，但隨著濃度的不斷增加，栗蘑多糖的羥基自由基清除率呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，且在濃度為5 mg/mL時(shí)達(dá)到94.36%，與VC的清除率逐漸接近，說(shuō)明栗蘑多糖具有較好的羥基自由基清除能力。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)利用水提醇沉法提取栗蘑多糖，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方法對(duì)多糖提取條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最佳提取工藝，即在提取時(shí)間1.9 h、提取溫度80 ℃、提取液料比37∶1 （mL/g）的條件下，栗蘑多糖提取率達(dá)到14.45%，且該工藝穩(wěn)定可行。此外，抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，栗蘑多糖具有較好的DPPH自由基、羥基自由基清除率，且在栗蘑多糖濃度為5 mg/mL時(shí)抗氧化能力最強(qiáng)，栗蘑多糖具有較好的抗氧化活性，是一種優(yōu)質(zhì)的天然抗氧化劑。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳強(qiáng)，黃晨陽(yáng).日本食用菌栽培歷史、產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與啟示[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，2015（4）：20-22.

[2]王亞敏，謝夢(mèng)洲，張超文，等.藥食用真菌灰樹(shù)花防治腫瘤相關(guān)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2019（3）：83-86.

[3]阮海東，陳秀娟，林程，等.福建省灰樹(shù)花工廠化栽培技術(shù)[J].東南園藝，2015，3（4）：82-84.

[4]陳卓，吳克儉.灰樹(shù)花多糖生物活性的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（5）：785-788.

[5]徐錚奎.灰樹(shù)花多糖抗癌作用及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)進(jìn)展[J].上海醫(yī)藥，2010，31（11）：496-497.

[6]甘長(zhǎng)飛.灰樹(shù)花及其藥理作用研究進(jìn)展[J].食藥用菌，201 22（5）：264-267，281.

[7]胡玲玲，烏雪燕.枸杞多糖的水提醇沉法工藝優(yōu)化[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，49（7）：128-133.

[8]劉思揚(yáng)，陸雅琦，海日漢，等.功能性植物多糖及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2022，43（21）：444-453.

[9]程婷婷，陳貴元.植物多糖提取及抗腫瘤研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2022，18（2）：225-229.

[10]陳紅，楊許花，查勇，等.植物多糖提取、分離純化及鑒定方法的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，27（22）：32-35.

[11]曹丹，孫于寒，彭浩，等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化灰樹(shù)花多糖超聲波輔助提取工藝及其抗氧化活性分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2021，42（5）：113-118.

[12]薛小蘭，范瑜珊.灰樹(shù)花粗多糖提取物體外抑菌及抗氧化活性初步探究[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2021，52（9）：15-19.

[13]閆旭宇，李玲.水提醇沉法提取薏米多糖及其對(duì)羥自由基的清除作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2019，40（18）：1-5.

[14]YEH J Y， HSIEH L H， WU K T， et al. Antioxidant properties and antioxidant compounds of various extracts from the edible basidiomycete Grifola frondosa （Maitake）[J].Molecules，2011，16（4）：3197-3211.

[15]CHEN Y H， HSU T H， LO H C. Submerged-culture mycelia and broth of the maitake medicinal mushroom Grifola frondosa （higher basidiomycetes） alleviate type 2 diabetes-induced alterations in immunocytic function[J].International Journal of Medicinal Mushrooms，2015，17（6）：541-556.

[16]LI Q， WANG W， ZHU Y， et al. Structural elucidation and antioxidant activity a novel Se-polysaccharide from Se-enriched Grifola frondosa[J].Carbohydrate Polymers，2017，161：42-52.

[17]付佳樂(lè)，耿直.灰樹(shù)花多糖體外抑菌及抗氧化活性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2020，37（8）：945-948.

[18]曹丹，孫于寒，彭浩，等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化灰樹(shù)花多糖超聲波輔助提取工藝及其抗氧化活性分析[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2021，42（5）：113-118.

[19]申紅林，王鳳玲.灰樹(shù)花多糖復(fù)合酶協(xié)同微波輔助提取工藝及抗氧化性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2020，41（22）：124-131.

[20]喻治達(dá)，沈丹丹.海鮮菇多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化性分析[J].中國(guó)調(diào)味品，2023，48（1）：27-30.

[21]謝渟，肖春，王涓，等.灰樹(shù)花活性多糖構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2022，49（8）：3401-3419.

[22]張心馳，惠和平，李曉東，等.響應(yīng)面法優(yōu)化敗醬草多糖超聲提取工藝及其體外抗氧化活性研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2022，34（9）：2074-2081.

[23]胡棟寶，杜薇，楊猛.響應(yīng)面法優(yōu)化巨大口蘑多糖提取工藝及抗氧化活性[J].中國(guó)調(diào)味品，2021，46（10）：78-82.

[24]王自凡，盧永仲，張振.響應(yīng)面優(yōu)化白芨多糖提取工藝及流變性研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（7）：58-63.

收稿日期：2023-07-12

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（32001207）；湖北省中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)資金（2019zyyd044）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020BBB091）

作者簡(jiǎn)介：牛牧青（1997－），女，碩士，研究方向：食藥用菌活性物質(zhì)。

*通信作者：鄭永良（1969－），男，教授，博士，研究方向：食藥用菌及其功能。