豆類蛋白聚集機制及調控措施研究進展

李美麒　張學敏　王金辰　刁靜靜　王長遠　徐旖欣　曹榮安

摘要：目前在食品加工、化學工業(yè)生產以及生物醫(yī)藥等領域普遍存在蛋白質聚集的現象。近年來，豆類蛋白生產規(guī)模不斷擴大，其營養(yǎng)價值及經濟效價優(yōu)勢顯著?；诖耍絹碓蕉嗟膶W者對豆類蛋白聚集、解聚行為進行了深入探討。但豆類蛋白在食品加工過程中會產生一些聚集行為，這是不可避免的現象。隨著加工食品的手段越來越多樣化，豆類蛋白的聚集行為對食品品質、口感、風味的影響也逐漸引起人們的重視。文章介紹了豆類蛋白聚集行為的產生機理，系統(tǒng)詳盡地綜述了調控豆類蛋白聚集行為的措施及對豆類蛋白聚集行為進行表征的方法。相信豆類蛋白在未來可以成為更好的蛋白質補充方式，有更加廣泛的發(fā)展和應用空間，并希望為研究豆類蛋白聚集行為提供更多的理論支持。

關鍵詞：豆類蛋白；聚集行為；調控措施；研究進展

中圖分類號：TS201.21文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0209-05

Research Progress on Aggregation Mechanism and Regulatory Measures of Legume Proteins

LI Mei-qiZHANG Xue-minWANG Jin-chenDIAO Jing-jingWANG Chang-yuanXU Yi-xinCAO Rong-an1*

Abstract： At present， the phenomenon of protein aggregation is widely found in the fields of food processing， chemical industrial production and biomedicine. In recent years， the production scale of legume proteins has been continuously expanding， and its nutritional value and economic value advantages are significant. Based on this， more and more scholars have conducted in-depth discussion on aggregation and deaggregation behavior of legume proteins. However， it is inevitable that legume proteins exhibit some aggregation behavior during food processing. With the increasing diversification of food processing methods， the aggregation behavior of legume proteins has gradually attracted people's attention to its effect on food quality， taste and flavor. In this paper， the generation mechanism of aggregation behavior of legume proteins is introduced， and the measures to regulate the aggregation behavior of legume proteins and the methods to characterize the aggregation behavior of legume proteins are systematically reviewed. It is believed that legume proteins can become a better protein supplemental method in the future， with a broader development and application space， so as to provide more theoretical support for the study on aggregation behavior of legume proteins.

Key words： legume proteins; aggregation behavior; regulation measures; research progress

豆類蛋白的聚集行為主要是食品加工過程中蛋白質因受到外界作用而產生的一種蛋白質變性現象。由于豆類蛋白具有良好的功能特性，因豆類蛋白的變性或聚集引起的蛋白質結構和化學組成的變化都可能影響其在食品加工中的應用，還會導致食品生產過程中的口感變化以及對貯藏條件要求的變化。因此，深入了解豆類蛋白的聚集行為機理有利于深入了解其穩(wěn)定性，在加工過程中更好地利用豆類蛋白有利的聚集行為，或通過介入某些手段對產生的聚集行為進行調控，從而改變不利的聚集行為，這些對豆類蛋白在食品加工過程中的應用起著重要作用。例如，了解豆類蛋白的結構和穩(wěn)定性有助于最大限度地減少由熱引起的化學變化，有助于保持豆類蛋白的營養(yǎng)價值、結構和功能特性，通過控制豆類蛋白聚集行為可以得到不同類型的蛋白聚集體，用于營養(yǎng)成分和風味物質的改善[1]，亦或是了解調控豆類蛋白聚集行為的一些方法，從而改變已經發(fā)生的豆類蛋白聚集行為。

1 豆類蛋白聚集行為產生機理

豆類蛋白與其他蛋白質一樣，本質上都是通過肽鏈連接形成的，還有一些分子間或分子內的次級鍵連接形成的具有四級結構的多肽，如二硫鍵、氫鍵、離子鍵、疏水相互作用和范德華力等[2]。而豆類蛋白的聚集則是蛋白質分子在某些特定的條件下發(fā)生改變，如部分展開或折疊，并以特定的方式結合形成蛋白質的高級結構[3]。產生了聚集行為的豆類蛋白構象不會像天然蛋白質那樣，變性后的蛋白是疏水性氨基酸暴露在蛋白質表面，使暴露的疏水殘基增加了與其他分子相互作用的概率，通過疏水相互作用生成了豆類蛋白的聚集體。

Andrews等[4]指出，非天然蛋白質聚集是指原始單體或未聚集的蛋白質或多肽自發(fā)自組裝形成的，具有高水平的非天然二級結構的中、高分子量聚集體的過程，這些非天然結構通常（但不總是）富含蛋白質內和蛋白質間的β-折疊。目前學者們較認同的蛋白質聚集的機理是 A Lumry-Eyring Nucleated Polymerization Model的動力學模型，該模型包含5個階段：第一階段是未聚集的蛋白質的構象轉換，包括在構象狀態(tài)之間的所有轉變，被足夠高的自由能壘隔開，二、三、四級結構被破壞，導致蛋白質分子內部疏水基團暴露；第二階段是預成核階段，該階段描述了肽鏈的可逆結合，暴露出來的疏水基團相連接，導致變性蛋白質相互作用形成新的可逆的寡聚體；第三階段是最小的不可逆聚集體的成核階段，也屬于啟動或成核的階段，寡聚體重新排列組合形成了聚集體的核心；第四階段是通過聚合成可溶性聚集體，可溶性聚集體會發(fā)生重排或二級結構產生變化以形成不斷增長的聚集體；第五階段是冷凝或聚集體-聚集體組裝過程，為了形成分子量更高的聚集體。

2 聚集體分類

聚集體通常指代二聚體、四聚體和其他可以通過分子排阻色譜分離的物質，蛋白質聚集描述了蛋白質締合反應，蛋白質聚集體的大小范圍可以從納米到微米級?？赡娴模山怆x的）蛋白質聚集通常是由相對較弱的非共價鍵相互作用引起的蛋白質聚集，可以形成在溶液中的天然分子之間，聚集體的解離可以簡單地通過稀釋溶液來實現，通常是由溶液條件（pH、溫度等）變化引起的；不可逆的（按條件解離的）聚集是發(fā)生在較高分子量的物質中，不是簡單地逆轉產生聚集的條件，而是需要添加變性劑或還原劑才能使聚集體解離，或通過加熱、添加緩沖液或增加其他條件來恢復單體物質，因此蛋白質聚集體的分類[5]可按其大小、可逆性、構象變化、化學鍵修飾和形態(tài)結構變化進行總結，見表1。

3 豆類蛋白聚集行為的表征手段

3.1 濁度法

濁度法是通過測量豆類蛋白質溶液在某一波長下的吸光度值，從而確定蛋白質在不同處理條件下的聚集程度，此操作中蛋白質溶液的紫外吸光度值即可視為濁度，濁度值越高，蛋白聚集程度越明顯。為表征蛋白質溶液的濁度變化，一般檢測小粒徑聚集體時，使用400 nm處的紫外吸光度值，而檢測大聚集體時，使用600 nm 處的紫外吸光度值[6]。李楊等[7]通過對濁度值的測量，得出了綠豆蛋白在超聲作用下能夠有效破碎溶液中的大聚集體，減小蛋白質的粒徑，進而降低綠豆蛋白溶液的濁度。

3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

SDS-PAGE又稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳，是一種以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的區(qū)帶電泳，利用SDS作為陰離子去污劑，與蛋白質亞基結合形成蛋白質-SDS棒狀復合物，消除了不同種類蛋白質分子之間的原有電荷差異。白俊堃等[8]使用聚丙烯酰胺凝膠電泳證明了超聲處理紅小豆分離蛋白導致其疏水性增強，表明超聲造成的蛋白質聚集不是由共價鍵連接的而是由非共價鍵連接的，如靜電作用和疏水作用是促進蛋白聚集的主要作用力，其缺點是改變了蛋白質的分子結構，破壞了蛋白質分子之間及其他物質分子之間的非共價鍵，因此不能作為豆類蛋白聚集形態(tài)的分析檢測。

3.3 表面疏水性

豆類蛋白中有許多非極性氨基酸暴露在蛋白質分子的表面，這些氨基酸側鏈因排斥水而聚集在一起，這就是蛋白質的疏水性。所以，可以通過檢測蛋白質的疏水性這一指標，從而判斷在不同條件下的蛋白質聚集程度。疏水相互作用在蛋白質的穩(wěn)定性、構象和功能特性中起著重要作用[9]，作為與周圍環(huán)境接觸的蛋白質分子表面疏水基團含量的指標，蛋白質表面疏水性比總疏水性對功能的影響更大[10]。Creusot等[11]得出，大豆球蛋白在經過酶解后，內部非極性殘基暴露出來，使其蛋白質表面疏水性增大，從而導致了聚集。

3.4 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）可用于研究各種條件影響下的蛋白構象，并通過FTIR光譜定量評估其蛋白的結構變化[12]。傅里葉變換紅外光譜常被用于研究各種食物蛋白質的構象，例如燕麥球蛋白、乳清蛋白、大豆球蛋白和小麥面筋等。孫佳悅等[13]利用傅里葉變換紅外光譜技術分析表明，熱處理會破壞蛋白結構，變性過程中分子中的氫鍵會被破壞，引起聚集，產生變性蛋白聚合物。劉燕燕等[14]利用FTIR分析表明，短時間脈沖能夠引起β-折疊結構略微減少，且隨著脈沖時間的延長，峰會發(fā)生遷移，證明了大豆分離蛋白聚集行為增加。

3.5 熒光光譜

由于蛋白質中存在酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質本身就能吸收紫外光而產生熒光，因此可用于蛋白質的定量研究。蛋白質的熒光光譜主要與自身芳香族氨基酸殘基的極性有關，當蛋白質結構展開后，色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸的生色基團會暴露在溶劑中，發(fā)生淬滅，熒光強度會降低，因而蛋白質的熒光光譜可以用來推測蛋白質分子三級結構的變化[15]。豆類蛋白的疏水區(qū)域可以使用熒光強度來表示，熒光強度與蛋白質濃度成正比[16]。熒光光譜可以反映聚集的增長過程，張業(yè)輝[17]通過熒光光譜檢測蛋白二級構象，發(fā)現隨著加熱時間的延長，熒光強度逐漸變強，α-螺旋轉化成β結構，證明了加熱會導致蕓豆蛋白產生聚集行為。Wu等[18]通過熒光光譜檢測出大豆蛋白的聚集是通過疏水相互作用和暴露的疏水殘基來修飾的。

3.6 原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡

原子力顯微鏡用于直接觀測豆類蛋白聚集體，并可直接明確豆類蛋白的聚集形態(tài)和大小。張業(yè)輝通過原子力顯微鏡對蕓豆蛋白進行了表征，證明了蛋白濃度和加熱時間促進了蛋白質纖維化聚集的增長，并推測這種蛋白質的纖維化聚集可能是螺旋狀結構的[17]。

掃描電子顯微鏡圖像是在150倍放大率下獲得的，可以幫助觀察到不同處理條件下的豆類蛋白微結構。Jiang等[19]應用掃描電子顯微鏡得出：經過不同程度超聲處理和冷凍干燥的樣品會表現出更多的無序結構和不規(guī)則碎片，此時官能團（如疏水基團）暴露出來，它們立即相互作用，導致蛋白質聚集的形成。Tang等[20]發(fā)現分散體中的聚集體越小，它們的溶解度就越高。

3.7 圓二色譜法

圓二色譜法可以用于檢測豆類蛋白發(fā)生聚集前后二級結構的變化及對調控手段的檢測，如局部氨基酸序列片段之間的相互作用，以及處理后的分子不同部分之間的相互作用的破壞，可能導致蛋白質分子的聚集，此時二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲的比例會發(fā)生變化。Jiang等[19]通過圓二色譜法發(fā)現超聲處理誘導的蛋白質聚集體表現出高 β含量，并且具有大量天然α-螺旋結構的蛋白質在超聲處理后顯示出β結構的增加，同時聚集體中的α-螺旋結構減少。畢爽等[21]通過圓二色譜法超聲處理黑豆分離蛋白（36 min，300 W）導致α-螺旋上升，β-折疊下降，認為其余超聲處理條件均會導致α-螺旋下降。

3.8 分子排阻色譜法

分子排阻色譜法是以具有一定孔徑范圍的多孔凝膠為固定相，流動相為液體的色譜法，又稱凝膠色譜法或空間排阻色譜法。樣品組分會按照分子大小受到不同的排阻而先后由色譜柱排出，因此可通過停留在色譜柱的時間不同來對其分子量進行分布分析。郭健[22]通過分子排阻色譜法得知，變性蛋白質的溶解性可以通過水熱處理提高，從而產生了可溶性聚集體，并且在pH 7.0，8.0，9.0時堿性多肽的譜圖表明，經過水熱處理后可溶性組分（上清液）有大量聚集體形成。

4 豆類蛋白聚集調控措施

安然[23]將大豆蛋白進行熱處理后，研究表明，蛋白質的二級結構組分含量發(fā)生了變化，其中β-折疊結構含量降低，無規(guī)則卷曲結構含量增加，即大豆分離蛋白的二級結構從有序向無序結構轉變。王冬梅等[24]研究表明，隨著熱處理溫度的升高，大豆蛋白形成了可溶性聚集體，粒徑和分子量逐漸增大，濁度顯著增加。60，80 ℃熱誘導的聚集體以單個分子顆粒狀形式存在，而100 ℃熱誘導的聚集體呈小尺寸粒子形式。

豆類蛋白的聚集對于蛋白質資源的有效利用和食品品質的提高具有重要意義，增加豆類蛋白的聚集在食品生產過程中有重要意義，如豆腐是利用大豆蛋白的凝膠能力制成的大豆制品，腐竹也是利用豆類蛋白聚集行為的食品，對豆類蛋白聚集行為的有效利用可以得到一些品質優(yōu)良、營養(yǎng)價值高的食品。而一些物理方法如超聲、均質化、高壓和脈沖電場等可作為調控蛋白聚集的手段用以修飾蛋白質的結構和改善蛋白質的功能性質，這些非熱技術被認為是熱處理的替代品或輔助手段，可以在低溫下改善營養(yǎng)物質的保存和食物的感官質量[25]。近年來，使用超聲作為調控豆類蛋白聚集的手段較多，因為超聲調控不僅操作簡便，而且更適合在食品工廠中應用。

4.1 熱處理對豆類蛋白聚集的影響

熱處理誘導蛋白質聚集是最常見的一種調控蛋白聚集的方式，因為在加工豆類蛋白時，無論是殺菌處理還是噴霧干燥等工藝操作都避免不了熱加工處理。而熱誘導蛋白質聚集的原理是當溫度達到某一值時，蛋白質內部熱處理誘導的蛋白聚集是蛋白質非天然聚集，并且是一種不可逆過程[26]。加熱殺菌以及噴霧干燥對豆類蛋白及其制品的功能性質，如溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性等具有較大影響。目前對豆類蛋白的熱處理改性有廣泛的研究[27]。

4.2 微波對豆類蛋白聚集的影響

微波是電磁頻譜的一部分，頻率范圍為300 MHz～300 GHz，對應于1 m～1 mm的波長范圍，微波處理的熱效應與水、有機分子或離子吸收微波能量后產生的熱量有關[28]。然而，微波增強效應是指可觀察到的現象，不能僅用微波處理物質的溫度升高來解釋，大量科學證據將微波增強效應歸因于微波處理的非熱效應的存在。微波加熱是通過直接吸收能量并將其轉化為熱量來實現的[27]，人們普遍認為，微波場引起的蛋白質結構構象是由于微波的熱效應造成的[29]。然而，Gomaa等[30]提出，微波的非熱效應也可能對蛋白的二級和三級結構產生影響。

4.3 冷凍對豆類蛋白聚集的影響

冷凍下的蛋白分子多肽鏈會由規(guī)則變化變?yōu)椴灰?guī)則聚集，可能發(fā)生的是不可逆的凍結變性。趙婭柔[31]在對大豆蛋白進行冷凍誘導處理的過程中，發(fā)現在較高溫度如-5 ℃下比在低溫條件下更容易發(fā)生游離變性，形成不易溶的聚集體，即大豆蛋白發(fā)生了不完全變性。隨著冷凍溫度降低，蛋白的聚集行為增強，形成了不可溶聚集體。榮薈等[32]研究表明，隨著冷凍誘導程度的加深，蛋白的溶解性降低，濁度升高，蛋白質發(fā)生聚集，導致其微觀結構由稀疏到致密，變得更加穩(wěn)定。

4.4 脂質氧化作用對豆類蛋白聚集的影響

脂質過氧化反應產生的自由基可誘導蛋白質聚集，脂質過氧化反應誘導的蛋白質聚集是自由基鏈式反應聚合引起蛋白質-蛋白質的交聯[33]。丙烯醛作為脂質過氧化的代表性次級副產物，Wu等[18]研究表明，隨著丙烯醛濃度的增加，聚集體會逐漸形成。

4.5 脈沖電場對豆類蛋白聚集的影響

脈沖電場（PEF）是一種非熱食品保存方法[34]，可替代巴氏殺菌。使用恒定的PEF處理288 μs，大豆分離蛋白的溶解度隨著PEF強度的增加而增加，當PEF處理強度為30 kV/cm時，其溶解度達到最大值（82%）。當PEF處理強度達到30 kV/cm 以上時，SPI的溶解度略有下降，即增加了聚集。Li等[35-36]研究PEF對大豆分離蛋白理化性質的影響發(fā)現，經一定強度的脈沖電場處理后的大豆分離蛋白會由于疏水相互作用和二硫鍵使其發(fā)生變性和聚集。

4.6 高壓均質對豆類蛋白聚集的影響

將蛋白質溶液分別以103 MPa和207 MPa通過高壓均質機處理，Yang等[37]在對蠶豆蛋白進行研究時，證明高壓均質可以調節(jié)蛋白質聚集體之間的疏水相互作用，導致大蛋白質聚集體（>1 μm）解離成可溶性分子聚集體。

4.7 超聲調控對豆類蛋白聚集的影響

低功率的超聲處理會破壞豆類蛋白分子內部疏水相互作用，加速蛋白質分子運動，導致蛋白質聚集。而在中功率的超聲處理中會引發(fā)不穩(wěn)定的聚集體被空化力分解成較小的可溶性蛋白聚集體，在高功率的超聲處理中，聚集體會通過非共價相互作用再進行聚合。

超聲處理對于豆類蛋白聚集行為的調控主要是由空化效應引起的物理化學綜合作用的結果[38]，由于超聲波具有綠色、高效、操作簡單等優(yōu)點，適合在食品工廠中進行食品加工[39]。超聲處理可以改變聚集體的三級結構，減小粒徑，提高溶解度和表面疏水性[40]。高強度超聲可產生強烈的空化效應和機械力，可用于改變豆類蛋白的理化和功能性質[41]。

5 總結與展望

目前國內外對于豆類蛋白的研究已經較為深入，研究豆類蛋白質的聚集行為在食品加工過程中的結構和功能特性具有重要意義?，F有研究表明豆類蛋白的聚集行為會破壞蛋白質的結構，從而影響其溶解性、乳化性及其他功能特性。由于豆類蛋白的聚集行為對結構和功能的影響是復雜的，甚至有些調控手段會互相影響，因此不同的調控技術對豆類蛋白聚集的影響機制仍需要進一步研究。而本文除了對豆類蛋白的聚集行為進行概述以外，更希望植物蛋白資源可以被更多人研究、開發(fā)和利用，豆類蛋白資源的應用前景也會隨著研究的深入變得更加廣闊。未來，對豆類蛋白聚集可以在藥食同源方面進行研究，利用豆類蛋白的聚集行為調節(jié)人體內常見的高血脂、高血糖甚至心腦血管類疾病。

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收稿日期：2023-07-16

基金項目：中央引導地方科技發(fā)展專項（DQKJJYD0001）

作者簡介：李美麒（1997—），女，碩士研究生，研究方向：食品科學。

*通信作者：曹榮安（1980—），男，副教授，博士，研究方向：食品科學。