大孔樹脂吸附法純化酸棗仁總黃酮的工藝研究

杜國軍　洪婉婷　李占鋒　劉禹萱

摘要：利用7種大孔樹脂對酸棗仁的總黃酮進(jìn)行純化，依據(jù)其吸附能力及解吸能力，選出最佳的大孔樹脂型號，研究了上樣液濃度、上樣速度、上樣液體積對大孔樹脂吸附率的影響以及洗脫劑類型、洗脫劑濃度、洗脫速度、洗脫劑體積對大孔樹脂解吸率的影響，采用正交試驗(yàn)對酸棗仁總黃酮的純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，DM301大孔樹脂純化酸棗仁總黃酮效果最佳，在上樣液濃度為0.1 mg/mL、上樣速度為1 BV/h、上樣液體積為30 mL、洗脫劑為丙酮、洗脫劑濃度為100%、洗脫速度為2 BV/h、洗脫劑體積為55 mL的條件下，獲得的酸棗仁總黃酮純度最高，相較于純化前提高了約1.1倍。

關(guān)鍵詞：酸棗仁；總黃酮；大孔樹脂；正交試驗(yàn)；純化

中圖分類號：TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1000-9973（2024）01-0100-07

Study on Purification Process of Total Flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen by Macroporous Resin Adsorption Method

DU Guo-jun， HONG Wan-ting， LI Zhan-feng， LIU Yu-xuan

Abstract： Seven kinds of macroporous resins are used to purify the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen. According to the adsorption and desorption capacity， the best macroporous resin model is selected. The effects of loading solution concentration， loading speed and loading solution volume on the adsorption rate of macroporous resins and the effects of eluent type， eluent concentration， elution speed and eluent volume on the desorption rate of macroporous resin are studied. The purification process of total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen by macroporous resin is optimized by orthogonal test. The results show that DM301 macroporous resin has the best purification effect on the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen. Under the conditions of loading solution concentration of 0.1 mg/mL， loading speed of 1 BV/h， loading solution volume of 30 mL， eluent of acetone， eluent concentration of 100%， elution speed of 2 BV/h and eluent volume of 55 mL， the purity of the total flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen is the highest， which is 1.1 times higher than that before purification.

Key words： Ziziphi Spinosae Semen; total flavonoids; macroporous resin; orthogonal test; purification

酸棗仁（Ziziphi Spinosae Semen）為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，產(chǎn)于河北、陜西、遼寧、河南等地，主要成分包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、多糖類、脂肪酸、氨基酸等[1-2]。其中黃酮類化合物具有鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗氧化等作用，且分子量較小，易被人體消化吸收，在調(diào)味食品和保健食品中得到了一定應(yīng)用[3-7]。羅曉等[8]采用超聲波法提取石香薷總黃酮，結(jié)合柱層析法制備了石香薷總黃酮調(diào)味品。黃俊生[9]以白簕中的黃酮類化合物為原料，研制出顆粒完整均一、滋味醇厚的白簕特色蘸粘調(diào)味品。李玲玲[10]采用浸提法提取銀杏葉總黃酮和荷葉總黃酮，以銀杏葉浸提液和荷葉浸提液為原料，研發(fā)出一種色澤均勻、酸甜適中的保健飲料。

目前，國內(nèi)對酸棗仁的研究主要集中于酸棗仁總皂苷及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)，酸棗仁總黃酮的相關(guān)研究較少。常用的黃酮類化合物純化方法包括膜分離法、硅膠柱層析法、聚酰胺樹脂吸附法、大孔樹脂吸附法等[11-14]。其中大孔樹脂吸附法具有選擇性好、易于洗脫、可重復(fù)使用、成本低的特點(diǎn)，且純化后的有效物質(zhì)純度高、品質(zhì)好，在天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[15-17]。因此，本研究采用大孔樹脂吸附法純化酸棗仁總黃酮，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對酸棗仁總黃酮的純化條件進(jìn)行優(yōu)化，為酸棗仁總黃酮的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

酸棗仁：購于河北省贊皇縣；7種大孔樹脂（HPD100、NKA-9、HPD400、DM301、D101、DM130、AB-8）：鄭州和成新材料科技有限公司。

1.2 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海麥克林生化科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、丙酮（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

玻璃層析柱（Φ16 mm×300 mm） 上海琪特分析儀器有限公司；SHZ-D Ⅲ循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；LXJ-2B臺式低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BSA124S-CW分析電子天平 上海天平儀器廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 酸棗仁總黃酮提取液的制備

稱取20 g酸棗仁粉，加入500 mL氯化膽堿-乳酸低共熔溶劑（質(zhì)量比2∶1，含水量50%），在微波600 W下處理60 s，90 ℃水浴66 min，10 000 r/min條件下離心15 min，真空抽濾，獲取酸棗仁總黃酮提取液。

1.4.2 大孔樹脂的預(yù)處理

將大孔樹脂在室溫條件下用無水乙醇浸泡24 h，用蒸餾水沖洗至無醇味，用5% NaOH溶液浸泡5 h，用蒸餾水洗至中性，最后用5% HCl溶液浸泡5 h，用蒸餾水洗至中性，置于蒸餾水中備用。

1.4.3 酸棗仁總黃酮濃度的測定方法

采用NaNO2-Al（NO3）3法[18]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為y=12.26x－0.001R2=0.999 3。測定酸棗仁總黃酮的吸光度值，代入線性回歸方程即求得酸棗仁總黃酮濃度。

1.4.4 大孔樹脂的篩選

1.4.4.1 大孔樹脂對酸棗仁總黃酮靜態(tài)吸附性能的測定

7種大孔樹脂經(jīng)預(yù)處理后，各稱取5 g置于100 mL錐形瓶中，加入酸棗仁總黃酮提取液10 mL，密封后置于恒速振蕩器中，在150 r/min條件下吸附24 h。待吸附平衡后進(jìn)行真空抽濾，吸取1 mL濾液置于比色皿中，測定吸光度值，計(jì)算酸棗仁總黃酮濃度，再利用酸棗仁總黃酮濃度計(jì)算出各大孔樹脂的靜態(tài)吸附量和吸附率，公式如下：

式中：C0為酸棗仁總黃酮提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；C1為吸附平衡后總黃酮濃度（mg/mL）；V0為加入的酸棗仁總黃酮提取液體積（mL）；M為大孔樹脂質(zhì)量（g）。

1.4.4.2 大孔樹脂對酸棗仁總黃酮靜態(tài)解吸性能的測定

將真空抽濾后的7種大孔樹脂置于100 mL錐形瓶中，分別加入丙酮溶液10 mL，密封后置于恒速振蕩器中，在150 r/min條件下解吸24 h，待解吸平衡后測定解吸液的吸光度值，計(jì)算酸棗仁總黃酮濃度，最后依據(jù)酸棗仁總黃酮濃度計(jì)算出各大孔樹脂的靜態(tài)解吸量和解吸率，公式如下：

式中：C0為酸棗仁總黃酮提取液中總黃酮濃度（mg/mL）；C1為吸附平衡后總黃酮濃度（mg/mL）；C2為解吸液中總黃酮濃度（mg/mL）；V0為加入的酸棗仁總黃酮提取液體積（mL）；V1為解吸液體積（mL）；M為大孔樹脂質(zhì)量（g）。

1.4.4.3 大孔樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線及解吸動力學(xué)曲線的繪制

稱取10 g大孔樹脂置于錐形瓶中，加入20 mL酸棗仁總黃酮提取液，均勻混合后置于恒速振蕩器中，在150 r/min條件下每隔1 h吸取上清液，測定吸光度值。將吸附后的樹脂進(jìn)行抽濾，用適量蒸餾水洗去樹脂表面殘留的總黃酮溶液后置于錐形瓶中，加入20 mL丙酮溶液，振蕩解吸，每隔1 h測定解吸液的吸光度值，計(jì)算大孔樹脂的吸附量和解吸量，以吸附時間（解吸時間）為橫坐標(biāo)，以吸附量（解吸量）為縱坐標(biāo)，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線及解吸動力學(xué)曲線。

1.4.5 大孔樹脂的動態(tài)吸附條件優(yōu)化

1.4.5.1 單因素試驗(yàn)

考察上樣液濃度、上樣速度和上樣液體積對最佳大孔樹脂吸附酸棗仁總黃酮能力的影響。

1.4.5.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化酸棗仁總黃酮的吸附工藝條件。

1.4.6 大孔樹脂的動態(tài)解吸條件優(yōu)化

1.4.6.1 單因素試驗(yàn)

考察洗脫劑類型、洗脫劑濃度、洗脫速度、洗脫劑體積對最佳大孔樹脂解吸酸棗仁總黃酮能力的影響。

1.4.6.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化酸棗仁總黃酮的解吸工藝條件。

1.5 酸棗仁總黃酮純度的測定

將樣品經(jīng)減壓濃縮和真空冷凍干燥處理，用無水乙醇溶解，測其濃度，計(jì)算出酸棗仁總黃酮純度，公式如下：

純度（%）=[（C×V）/m]×100%。

式中：C為凍干樣品溶液的總黃酮濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；m為凍干樣品質(zhì)量（mg）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 2018軟件繪圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每組數(shù)據(jù)平行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂型號的初步篩選

考察型號為HPD100、NKA-9、HPD400、DM301、D101、DM130、AB-8的7種大孔樹脂靜態(tài)吸附及解吸性能，結(jié)果見表1。

由表1可知，在7種大孔樹脂中，DM301的吸附能力最強(qiáng)，吸附率達(dá)到86.33%，HPD100的吸附率次之，為84.49%；DM301和HPD100的解吸能力較強(qiáng)，解吸率分別達(dá)到85.44%和85.51%。綜合考慮，純化酸棗仁總黃酮的大孔樹脂型號初步確定為DM301和HPD100。

2.2 最佳大孔樹脂型號的確定

2.2.1 靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線

DM301和HPD100大孔樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線見圖1。

由圖1可知，在0～4 h內(nèi)，隨著吸附時間的延長，兩種大孔樹脂吸附總黃酮的量也在增加，在4 h時趨于平穩(wěn)，說明兩種大孔樹脂與酸棗仁的總黃酮含量之間均屬于快速吸附類型，其中DM301大孔樹脂吸附酸棗仁總黃酮的量最多，為0.210 4 mg/g。

2.2.2 靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線

DM301和HPD100大孔樹脂的靜態(tài)解吸動力學(xué)曲線見圖2。

由圖2可知，在0～5 h內(nèi)，兩種大孔樹脂解吸酸棗仁總黃酮的量隨著洗脫時間的延長而逐漸增加，5 h后趨于平穩(wěn)，HPD100大孔樹脂與DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸量分別為0.176 7 mg/g和0.173 1 mg/g。

2.2.3 大孔樹脂最佳型號的選擇

綜上所述，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附與解吸能力最強(qiáng)，達(dá)到吸附與解吸平衡的時間最短。因此，選擇DM301大孔樹脂為純化酸棗仁總黃酮的最佳樹脂型號。

2.3 DM301大孔樹脂純化酸棗仁總黃酮吸附條件的確定

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 上樣液濃度的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，分別加入30 mL濃度為0.025，0.05，0.1，0.15，0.2 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液，將流速設(shè)置為3 BV/h，收集流出液，測定吸光度值，計(jì)算吸附率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在上樣液濃度為0.1 mg/mL時，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附率最高，達(dá)到63.38%。因此，選擇0.1 mg/mL為最適上樣液濃度。

2.3.1.2 上樣速度的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，將30 mL濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液上柱，上樣速度分別設(shè)置為1，5 BV/h，收集流出液，測定吸光度值，計(jì)算吸附率，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)上樣速度為1 BV/h時，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附率最高，為64.56%。因此，選擇1 BV/h為最適上樣速度。

2.3.1.3 上樣液體積的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，將適量濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液以3 BV/h的速度上樣，每5 mL收集一管流出液，測定總黃酮濃度，以流出液體積為橫坐標(biāo)，流出液中酸棗仁總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線。當(dāng)流出液中酸棗仁總黃酮濃度達(dá)到上樣液濃度的1/10時即達(dá)到泄露點(diǎn)，此時流出液體積即為最佳上樣液體積，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)上樣液體積從5 mL增至30 mL時，上樣液中酸棗仁總黃酮濃度也隨之上升，在30 mL時大孔樹脂吸附達(dá)到飽和。因此，選擇30 mL為最適上樣液體積。

2.3.2 正交試驗(yàn)

以DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附率為指標(biāo)，選取上樣液濃度、上樣速度和上樣液體積3個因素的3個水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表L9（33）（見表2），正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表3和表4。

由表3中極差R可知，在DM301大孔樹脂吸附酸棗仁總黃酮過程的影響因素中，各因素的影響主次順序?yàn)锳>C>B，即上樣液濃度>上樣液體積>上樣速度。根據(jù)3個因素的最大值KA=67.063，KB=60.983，KC=62.533，確定理論最佳吸附組合為A1B1C2，即上樣液濃度為0.1 mg/mL，上樣速度為1 BV/h，上樣液體積為30 mL。由表4中方差分析可知，上樣液濃度對吸附過程的影響顯著，上樣速度和上樣液體積對吸附過程的影響不顯著。

在正交試驗(yàn)所得理論適宜吸附工藝參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的吸附率為71.45%，高于設(shè)計(jì)表中吸附率最大值，證明正交試驗(yàn)成功。因此，DM301大孔樹脂最佳吸附工藝條件為上樣液濃度0.1 mg/mL、上樣速度1 BV/h、上樣液體積30 mL。

2.4 DM301大孔樹脂純化酸棗仁總黃酮解吸條件的確定

2.4.1 單因素試驗(yàn)

2.4.1.1 洗脫劑類型的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，將30 mL濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后用3 BV的蒸餾水洗脫，再分別用55 mL的甲醇、55 mL的乙醇和55 mL的丙酮溶液以2 BV/h的速度洗脫，收集洗脫劑，測定吸光度值并計(jì)算解吸量和解吸率，結(jié)果見表5。

由表5可知，丙酮對酸棗仁總黃酮的洗脫效果最好，解吸率達(dá)到86.21%，甲醇和乙醇的洗脫效果較差，解吸率分別為66.96%和41.43%。因此，選擇丙酮為最適洗脫劑。

2.4.1.2 洗脫劑濃度的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，將30 mL濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后用3 BV的蒸餾水洗脫，再分別用50%、60%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液洗脫，收集洗脫劑，測定吸光度值，計(jì)算解吸率，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，當(dāng)丙酮濃度從50%增加到100%時，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸率從29.46%增加到86.40%，達(dá)到了最大值。因此，選擇100%為丙酮的最適濃度。

2.4.1.3 洗脫速度的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，取30 mL濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液，以3 BV/h的速度上柱，吸附完全后，用3 BV的蒸餾水沖洗柱子，再用丙酮溶液分別以1，5 BV/h的速度洗脫，收集洗脫劑，測定吸光度值，計(jì)算解吸率，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，當(dāng)洗脫速度達(dá)到2 BV/h時，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸率達(dá)到最大值75.68%。因此，選擇2 BV/h為最適洗脫速度。

2.4.1.4 洗脫劑體積的確定

稱取DM301大孔樹脂20 g濕法裝柱，將30 mL濃度為0.1 mg/mL的酸棗仁總黃酮提取液以1 BV/h的速度上柱，待吸附平衡，用3 BV蒸餾水洗脫，用恒流泵以2 BV/h的速度加入丙酮溶液，每5 mL收集一次洗脫劑，測定吸光度值，測定各管洗脫劑中酸棗仁總黃酮濃度，以收集洗脫劑體積為橫坐標(biāo)，洗脫劑中酸棗仁總黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，隨著洗脫劑體積的增加，洗脫劑中酸棗仁總黃酮濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)洗脫劑體積為40 mL時，洗脫劑中酸棗仁總黃酮濃度達(dá)到最大值，當(dāng)洗脫劑體積繼續(xù)增加到55 mL時，洗脫劑中酸棗仁總黃酮濃度較低，趨于穩(wěn)定，說明被吸附的酸棗仁總黃酮已被大部分洗脫。因此，選擇55 mL為最適洗脫劑體積。

2.4.2 正交試驗(yàn)

以DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸率為指標(biāo)，選取洗脫劑濃度、洗脫速度和洗脫劑體積3個因素的3個水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表L9（33）（見表6），試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表7和表8。

由表7中極差R可知，在DM301大孔樹脂解吸酸棗仁總黃酮過程的影響因素中，各因素的影響主次順序?yàn)镕>D>E，即洗脫劑體積>洗脫劑濃度>洗脫速度。根據(jù)3個因素的最大值KD=80.617，KE=80.207，KF=81.470，理論最佳吸附組合為D3E2F3，即洗脫劑濃度為100%，洗脫速度為2 BV/h，洗脫劑體積為55 mL。由表8中方差分析可知，洗脫劑濃度和洗脫劑體積對解吸過程的影響顯著，洗脫速度對解吸過程的影響不顯著。

在正交試驗(yàn)所得理論最佳工藝參數(shù)下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，DM301大孔樹脂對酸棗仁總黃酮的解吸率為82.83%，高于設(shè)計(jì)表中解吸率最大值，證明正交試驗(yàn)成功。因此，DM301大孔樹脂解吸最佳工藝條件為洗脫劑濃度100%、洗脫速度2 BV/h、洗脫劑體積55 mL。

2.5 酸棗仁總黃酮純化效果評價

DM301大孔樹脂純化前、后的酸棗仁總黃酮純度見表9。

由表9可知，酸棗仁總黃酮經(jīng)大孔樹脂純化前純度為18.3%，經(jīng)DM301大孔樹脂純化后純度達(dá)到38.7%，純度提高了約1.1倍。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用7種大孔樹脂對酸棗仁總黃酮進(jìn)行純化，通過考察靜態(tài)吸附能力與解吸能力，確定了DM301大孔樹脂為最適型號，研究了DM301大孔樹脂的最適純化條件。當(dāng)上樣液濃度為0.1 mg/mL、上樣速度為1 BV/h、上樣液體積為30 mL、洗脫劑為丙酮、洗脫劑濃度為100%、洗脫速度為2 BV/h、洗脫劑體積為55 mL時，獲得的酸棗仁總黃酮純度最高，相較于純化前提高了約1.1倍，效果良好。

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收稿日期：2023-08-22

基金項(xiàng)目：黑龍江省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)科研項(xiàng)目（145109313）

作者簡介：杜國軍（1972－），男，遼寧鐵嶺人，教授，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。