CRISPR/Cas 系統(tǒng)在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用和挑戰(zhàn)

張鈞 張路 孔瑩瑩

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及CRISPR 相關(guān)基因（CRISPR-associated，Cas）系統(tǒng)，即CRISPR/Cas 系統(tǒng)，通常由一組特征性CRISPR 陣列和CRISPR 相關(guān)基因組成，CRISPR 陣列包含重復(fù)序列和間隔序列，重復(fù)序列分散在可變的間隔序列之間。CRISPR 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄翻譯為Cas 蛋白，具有核酸酶活性[1]。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是遍布于古菌和細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，其防御過(guò)程通常包括3 個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾。當(dāng)噬菌體等外源基因入侵時(shí)，細(xì)菌表達(dá)Cas蛋白形成復(fù)合物，通過(guò)識(shí)別外源基因中稱(chēng)為原間隔鄰近基序（protospacer-adjacent motif，PAM）的特定短序列結(jié)合外源基因，并切割部分外源序列插入自身重復(fù)序列之間，形成CRISPR 陣列，此階段稱(chēng)為適應(yīng)階段。當(dāng)噬菌體等外源基因再次入侵，古菌和細(xì)菌中CRISPR 陣列經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工成前CRISPR RNA（precrRNA），并進(jìn)一步加工成更成熟的CRISPR RNA（crRNA），每個(gè)RNA 包含間隔序列和部分側(cè)翼重復(fù)序列，此階段稱(chēng)為表達(dá)階段。接著，crRNA 與Cas 蛋白復(fù)合物結(jié)合形成有活性的復(fù)合體，在crRNA 引導(dǎo)下，Cas 蛋白復(fù)合體識(shí)別外源基因中的PAM 序列并在上游3 nt 位置切割降解外源核酸，此階段稱(chēng)為干擾階段[1]。目前CRISPR/Cas 系統(tǒng)已被用作強(qiáng)大的RNA 引導(dǎo)DNA/RNA 靶向平臺(tái)，用于基因組編輯[2-4]、轉(zhuǎn)錄干擾[5-6]、表觀遺傳調(diào)控[7]、靶標(biāo)檢測(cè)[8]等。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種CRISPR/Cas 系統(tǒng)，不同系統(tǒng)中Cas 蛋白序列、基因組成和基因組位點(diǎn)結(jié)構(gòu)顯示出較大多樣性。根據(jù)上述基因序列的進(jìn)化關(guān)系，將CRISPR/Cas 分為6 型（Ⅰ～Ⅵ）[9]。按照各系統(tǒng)發(fā)揮作用的不同方式又將這6 型分為兩大類(lèi)[9-10]，這兩類(lèi)系統(tǒng)在crRNA 加工和干擾相關(guān)效應(yīng)模塊的體系結(jié)構(gòu)方面存在根本差異。Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型屬于經(jīng)典的1 類(lèi)CRISPR/Cas 系統(tǒng)，由多個(gè)Cas 蛋白組成的效應(yīng)模塊介導(dǎo)pre-crRNA 加工和干擾。相比之下，2 類(lèi)系統(tǒng)由單一多結(jié)構(gòu)域的Cas 蛋白發(fā)揮作用，它結(jié)合了干擾所需的所有活動(dòng)，更適合用于開(kāi)發(fā)基因編輯和靶標(biāo)檢測(cè)平臺(tái)[11-14]。2 類(lèi)系統(tǒng)主要包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ類(lèi)系統(tǒng)，其中，Cas9、Cas12 和Cas13 分別代表Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)的效應(yīng)器。

核酸是分子診斷技術(shù)檢測(cè)感染性疾病、抗生素耐藥性基因、癌癥或遺傳疾病發(fā)展相關(guān)的突變、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和生物標(biāo)志物的重要目標(biāo)。當(dāng)前核酸檢測(cè)技術(shù)主要基于PCR，需要專(zhuān)業(yè)的設(shè)備，且需高溫打開(kāi)雙鏈以啟動(dòng)后續(xù)擴(kuò)增循環(huán)，極大限制了其在實(shí)驗(yàn)室外場(chǎng)景中的應(yīng)用。CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有在溫和環(huán)境下對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行高效特異識(shí)別和切割的優(yōu)勢(shì)，將其應(yīng)用于核酸檢測(cè)將是開(kāi)發(fā)高靈敏度和高特異度的快速、便攜、低廉的床旁檢測(cè)方向，本文就這一領(lǐng)域的最新發(fā)展方向作一述評(píng)。

1 各種CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基本原理

1.1 Cas9 Cas9 作為Ⅱ型系統(tǒng)的標(biāo)志蛋白，CRISPR/Cas9 是最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于基因編輯的經(jīng)典系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Jinek 等[15]于2012 年首次發(fā)現(xiàn)，已在體外證明其可切割雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）。不久，Cong 等[2]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在大腸桿菌中實(shí)施基因組編輯，Pardee 等[16]利用CRISPR/Cas9 的PAM 特異識(shí)別切割特性，與核酸序列擴(kuò)增（nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）結(jié)合，以單堿基分辨率區(qū)分Zika 菌株。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是RNA 引導(dǎo)的dsDNA 靶向平臺(tái)，包含Cas9 蛋白、crRNA 和反式激活crRNA（transactivating crRNA，tracrRNA）三部分[17]。其中，Cas9 蛋白為雙葉結(jié)構(gòu)，具有RuvC、HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域等多個(gè)參與靶DNA 切割的亞結(jié)構(gòu)域（圖1A）[18-19]。crRNA 和tracrRNA 通過(guò)互補(bǔ)序列結(jié)合形成雙鏈向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）[20]?？梢愿鶕?jù)靶DNA 及上下游序列設(shè)計(jì)合適的sgRNA，其中crRNA 部分與目標(biāo)序列互補(bǔ)而結(jié)合到目標(biāo)序列上，該過(guò)程起到了招募和引導(dǎo)功能，同時(shí)引起整個(gè)sgRNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，激活與之結(jié)合的Cas9 蛋白。Cas9 蛋白被激活后識(shí)別靶DNA 上的PAM 位點(diǎn)，即形式為5'-NGG-3'（N 代表任意堿基）的短DNA 序列，并在PAM 位點(diǎn)上游3 nt 位置進(jìn)行特異性切割[2-3]。一般情況下，Cas9 蛋白需要與sgRNA（或crRNA 和tracrRNA）進(jìn)行預(yù)孵育，形成Cas9 sgRNA 復(fù)合物，該復(fù)合物能精確定位于原間隔序列的PAM 靶位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)dsDNA 的精確特異切割功能，這種切割方式稱(chēng)為順式切割。CRISPR/Cas9 的特異識(shí)別和順式切割特性是其用于開(kāi)發(fā)核酸檢測(cè)系統(tǒng)的主要原理。

圖1 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu)和裂解活性示意圖[18]

1.2 Cas12 和Cas14 Cas12a（以前稱(chēng)為Cpf1）是V 型系統(tǒng)的標(biāo)志蛋白。由Zetsche 等[21]在2015 年發(fā)現(xiàn)第1個(gè)用于基因組編輯的Cas12 核酸酶。與Cas9 相似，Cas12a 可介導(dǎo)順式切割，即識(shí)別和切割目標(biāo)dsDNA 中PAM（“TTTN”，N 代表任意堿基）附近的靶序列。不同之處在于Cas12a 只有唯一的催化結(jié)構(gòu)域RuvC，且介導(dǎo)其自身crRNA 的成熟，無(wú)需tracrRNA 和額外的核酸酶來(lái)處理crRNA（圖1B）[18]。此外Cas12a-crRNA 復(fù)合物還具有非特異性反式切割活性，即一旦Cas12a 完成對(duì)目標(biāo)dsDNA 的順式切割，RuvC 的活性位點(diǎn)就會(huì)空出，供任何單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）進(jìn)入并被切割[22-24]。Cas12a 的反式切割活性裂解報(bào)告熒光探針是其用于開(kāi)發(fā)核酸檢測(cè)系統(tǒng)的重要原理。

CRISPR/Cas12b（也稱(chēng)為C2c1）作為一種獨(dú)特的VB 型系統(tǒng)，是一種雙RNA 引導(dǎo)的DNA 核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)[25]。與Cas12a 不同，crRNA 和tracrRNA 與Cas12b 的結(jié)合對(duì)于引導(dǎo)鏈和靶鏈之間的配對(duì)至關(guān)重要。值得注意的是，Cas12b 的反式切割特性對(duì)單核苷酸錯(cuò)配極為敏感，這對(duì)于開(kāi)發(fā)單核苷酸分辨率的檢測(cè)系統(tǒng)具有極大的優(yōu)勢(shì)[26]。另外，Cas12b 的體積比Cas9 和Cas12a小，在與病毒載體一起遞送細(xì)胞時(shí)具有優(yōu)勢(shì)[27]。

Cas14a 也屬于Ⅴ型系統(tǒng)，具有對(duì)ssDNA 的特異順式切割活性和非特異反式切割活性（圖1C）[18]。Cas14（也稱(chēng)為Cas12f）是一個(gè)非常緊湊的RNA 引導(dǎo)核酸酶家族，大小為400～700 個(gè)氨基酸，是目前已知的Ⅱ類(lèi)CRISPR/Cas 的一半，在與病毒載體一起遞送細(xì)胞時(shí)特別有吸引力。另外，Cas14 可以在tracrRNA 和crRNA（或sgRNA）的引導(dǎo)下特異性結(jié)合和切割靶ssDNA，而不需要PAM 位點(diǎn)的限制，具有較大的靈活性[28-30]。

1.3 Cas13 Ⅵ型系統(tǒng)的典型代表Cas13a（也被命名為C2c2），由Shmakov 等[13]于2015 年發(fā)現(xiàn)，具有高級(jí)真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotidebinding，HEPN）（圖1D）。Cas13a 是一種RNA 引導(dǎo)的RNA 靶向平臺(tái)，即利用crRNA 作為向?qū)?lái)識(shí)別和切割靶RNA[13]。研究證實(shí)，Cas13a 既能特異性識(shí)別和剪切靶向RNA 片段，也能不加選擇地切割任意RNA序列（類(lèi)似于Cas12a）[31-32]。特異順式切割靶RNA 以及非特異反式切割報(bào)告熒光探針是Cas13a 用于建立核酸檢測(cè)的兩個(gè)主要特性。利用這些特性，Gootenberg 等[8]建立了首個(gè)基于CRISPR/Cas13 的核酸檢測(cè)系統(tǒng)SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlock），實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率檢測(cè)DNA 和RNA 靶標(biāo)。

總的來(lái)說(shuō)，諸如對(duì)dsDNA/ssDNA/RNA 的特異性識(shí)別和順式切割、對(duì)ssDNA/RNA 的非特異性反式切割以及僅使用crRNA 的引導(dǎo)等特性，已經(jīng)引起了CRISPR/Cas 在核酸檢測(cè)應(yīng)用的關(guān)注。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在核酸靶標(biāo)檢測(cè)的應(yīng)用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)核酸的特異性識(shí)別為核酸檢測(cè)提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。通常情況下，由于靶標(biāo)檢測(cè)濃度較低，需要將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。近年來(lái)，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的無(wú)預(yù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)系統(tǒng)也在陸續(xù)開(kāi)發(fā)中。無(wú)預(yù)擴(kuò)增核酸檢測(cè)系統(tǒng)主要通過(guò)兩種方案放大信號(hào)：第一，利用Cas12a、Cas13a 和Cas14 蛋白靶向結(jié)合后激活的反式裂解活性，可以在一定程度上實(shí)現(xiàn)對(duì)原始信號(hào)的擴(kuò)增。第二，利用多種Cas 效應(yīng)蛋白作為高度特異性的序列識(shí)別元件，結(jié)合電化學(xué)、比色法和熒光等多種信號(hào)輸出方法，開(kāi)發(fā)無(wú)擴(kuò)增系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)核酸的高靈敏度和高特異度檢測(cè)。

2.1 結(jié)合靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增的CRISPR/Cas 核酸檢測(cè)系統(tǒng)

2.1.1 基于順式切割原理的核酸靶標(biāo)檢測(cè)

2.1.1.1 CUT-PCR Lee 等[33]基于CRISPR 內(nèi)切酶活性結(jié)合PCR 方法開(kāi)發(fā)了一種新方法，即CUT-PCR（CRISPR-mediated ultrasensitive detection of target DNA）。該方法可以利用CRISPR/Cas 內(nèi)切酶切割野生型序列，減少背景DNA 信號(hào)，并通過(guò)PCR 擴(kuò)增豐富癌癥特異性突變體DNA 信號(hào)。CUT-PCR 方法尤其適合去除血液中大量的野生型片段，極大提高循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor deoxyribonucleic acid，ctDNA）的檢測(cè)靈敏度。CUT-PCR 還可以結(jié)合靶向深度測(cè)序檢測(cè)廣泛的癌基因，具有較高的靈敏度（＜0.01%）和準(zhǔn)確性，優(yōu)于傳統(tǒng)的靶向深度測(cè)序。

2.1.1.2 CRISPR/Cas9 觸發(fā)的等溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（CRISPR/Cas9 triggered isothermal exponential amplification reaction，CAS-EXPAR） Huang 等[34]結(jié)合CRISPR/Cas9 位點(diǎn)特異性切割的優(yōu)勢(shì)和等溫指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)的動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)稱(chēng)為CAS-EXPAR，該方法具有快速、位點(diǎn)特異性核酸檢測(cè)的功能。該方法的主要原理是利用CRISPR/Cas9 的特異識(shí)別和切割特性從長(zhǎng)鏈DNA 或RNA 產(chǎn)生特異性EXPAR 觸發(fā)器，觸發(fā)指數(shù)擴(kuò)增，既利用了EXPAR 優(yōu)越的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)，又采用CRISPR/Cas9 彌補(bǔ)傳統(tǒng)EXPAR 只適用于檢測(cè)短序列的局限，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，該方法對(duì)單堿基錯(cuò)配具有良好的特異性，檢出限為0.82 amol，且可以在1 h內(nèi)檢測(cè)到DNA。通過(guò)將單堿基甲基化轉(zhuǎn)化為單堿基突變，CAS-EXPAR 還能夠?qū)崿F(xiàn)位點(diǎn)特異性DNA 甲基化檢測(cè)，這對(duì)于監(jiān)測(cè)腫瘤的診斷和預(yù)后至關(guān)重要。

圖2 CAS-EXPAR 的機(jī)制示意圖[34]

2.1.1.3 CRISDA 檢測(cè)系統(tǒng) 雖然PCR 是最廣泛使用的DNA 擴(kuò)增方法，但熱循環(huán)的要求限制了其非實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。因此，等溫DNA 擴(kuò)增技術(shù)在代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR 的現(xiàn)場(chǎng)診斷應(yīng)用中具有價(jià)值。鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）具有較高的擴(kuò)增效率，采用在引物上引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列而使擴(kuò)增反應(yīng)可在恒溫條件下進(jìn)行，但第一步仍然需要高溫打開(kāi)雙鏈，并未達(dá)到真正的“恒溫”。Zhou 等[35]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在天然DNA 分子中引入單鏈斷裂或缺口，恒溫條件下從天然雙鏈DNA 生成大量單鏈DNA，啟動(dòng)SDA，建立了稱(chēng)為CRISDA（a CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease mediated strand displacement amplification method）的檢測(cè)系統(tǒng)，具體原理見(jiàn)圖3。整個(gè)過(guò)程在25～40 ℃的恒定溫度下進(jìn)行，真正實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增。結(jié)合肽核酸侵襲介導(dǎo)的終點(diǎn)測(cè)量，該方法在復(fù)雜樣品背景下檢測(cè)各種DNA 靶標(biāo)時(shí)具有aM 靈敏度和單核苷酸特異性。CRISDA 是一種強(qiáng)大的等溫工具，用于超靈敏和特異性的核酸檢測(cè)，尤其適用于即時(shí)診斷和現(xiàn)場(chǎng)分析。

圖3 CRISDA 的反應(yīng)機(jī)制示意圖[35]

2.1.1.4 RACE 檢測(cè)系統(tǒng) 細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）衍生的miRNA 譜在疾病診斷和預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。但直接和可靠地檢測(cè)EV 衍生的多個(gè)miRNA 仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇蠹s19～23 個(gè)核苷酸的小尺寸很難設(shè)計(jì)用于傳統(tǒng)PCR 反應(yīng)的引物[36-37]。Wang 等[38]整合CRISPR/Cas9 高度特異識(shí)別切割和方便快捷的優(yōu)點(diǎn)以及滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circular amplifification，RCA）高靈敏度和高特異度的優(yōu)勢(shì)建立了稱(chēng)為RACE（RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage）的檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)在RCA 循環(huán)中引入PAM 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有PAM 且與RCA 產(chǎn)物中特異性靶標(biāo)互補(bǔ)的熒光探針，CRISPR/Cas9 特異識(shí)別和切割RCA 產(chǎn)物中PAM 附近的靶標(biāo)序列和熒光探針，釋放熒光，見(jiàn)圖4。釋放的CRISPR/Cas9 復(fù)合體觸發(fā)新一輪的識(shí)別和切割，通過(guò)這一過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)循環(huán)切割，直到所有靶標(biāo)都被切割。通過(guò)設(shè)計(jì)多對(duì)RCA 的掛鎖探針和熒光探針，并改變熒光探針的熒光基團(tuán)即可實(shí)現(xiàn)多重miRNA 的檢測(cè)。RACE 在檢測(cè)培養(yǎng)癌細(xì)胞和臨床肺癌患者與RT-qPCR顯示出高度一致性，驗(yàn)證了其穩(wěn)健性，單重檢測(cè)可以達(dá)到90 fM 的靈敏度，揭示了其在疾病的篩查、診斷和預(yù)后方面的潛力?？傊琑ACE 具有高靈敏度和高特異度，可實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)的方便快捷檢測(cè)系統(tǒng)，用于即時(shí)診斷和現(xiàn)場(chǎng)分析。

圖4 RACE 的反應(yīng)機(jī)制示意圖[38]

2.1.2 基于反式切割原理的核酸靶標(biāo)檢測(cè)

2.1.2.1 DETECTR 檢測(cè)系統(tǒng) 一旦CRISPR/Cas12a 與crRNA 和靶DNA 形成復(fù)合體，該系統(tǒng)的反式切割活性就能有效裂解系統(tǒng)中的任何ssDNA。Chen 等[24]充分利用了這一特點(diǎn)，將重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）與Cas12a 結(jié)合建立了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）的檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括Cas12a、crRNA 和熒光團(tuán)猝滅劑標(biāo)記的報(bào)告基因，一旦Cas12a 檢測(cè)到并切割目標(biāo)DNA 序列，就會(huì)激活反式切割活性，切割帶有熒光團(tuán)猝滅劑標(biāo)記的TaqMan 探針，釋放熒光。通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)可以準(zhǔn)確地定量靶DNA 的存在。結(jié)果表明，DETECTR 系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地從臨床樣本中檢測(cè)出16 型和18 型以外的HPV 類(lèi)型。Harrington 等[28]將DETECTR 的原理與Cas14a 的高特異性結(jié)合靶標(biāo)特性相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出Cas14a-DETECTR，可實(shí)現(xiàn)高保真SNP基因組分型。

2.1.2.2 HOLMES Li 等[39]利用Cas12a 在熒光標(biāo)記的ssDNA上的反式切割功能，開(kāi)發(fā)了HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）。HOLMES與DETECTR 系統(tǒng)的不同之處在于，HOLMES 借助PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)０暹M(jìn)行擴(kuò)增。在目標(biāo)DNA 存在的情況下，Cas12a-crRNA 與目標(biāo)DNA 形成三元復(fù)合物，并反式切割ssDNA，產(chǎn)生熒光信號(hào)。SNP 是人類(lèi)最常見(jiàn)的遺傳變異，與疾病的易感性和發(fā)病率密切相關(guān)。HOLMES平臺(tái)通過(guò)在引物中引入相關(guān)的PAM 序列，能夠檢測(cè)SNP 位點(diǎn)的存在。

2.1.2.3 CDetection Teng 等[40]發(fā)現(xiàn)從嗜酸乳桿菌Cas12b（Alicyclobacillus acidophilus Cas12b，AaCas12b）中提取的Cas12b 系統(tǒng)對(duì)dsDNA 敏感。該團(tuán)隊(duì)基于AaCas12b-sgRNA-dsDNA 激活劑系統(tǒng)設(shè)計(jì)基于Cas12b的DNA 檢測(cè)（CDetection）平臺(tái)[41]。當(dāng)激活劑濃度超過(guò)10 nM 時(shí)，CDetection 不僅可以檢測(cè)HPV，還可以區(qū)分HPV16 和HPV18。若引入調(diào)諧向?qū)NA（tune guide RNA，tgRNA），CDetection 可以在單堿基水平上區(qū)分差異，并以較高的準(zhǔn)確性確定ABO 血型。

2.1.2.4 SHERLOCK 不同于Cas12 的crRNA 引導(dǎo)的dsDNA 識(shí)別和切割活性，Cas13 是一種crRNA 引導(dǎo)識(shí)別和切割靶RNA 的核酸酶活性[13]，特別適合用于開(kāi)發(fā)RNA 靶標(biāo)檢測(cè)。張峰團(tuán)隊(duì)首次利用Cas13 對(duì)RNA 特異識(shí)別和非特異反式切割活性，結(jié)合RPA 擴(kuò)增靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了SHERLOCK（specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking），提供了具有aM 靈敏度和單堿基錯(cuò)配特異性的快速DNA 或RNA 檢測(cè)[8]。隨后，多個(gè)團(tuán)隊(duì)在SHERLOCK 的基礎(chǔ)上修改完善補(bǔ)充，開(kāi)發(fā)了多個(gè)高靈敏高特異方便快捷的檢測(cè)系統(tǒng)[42-45]。

2.2 無(wú)靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增的CRISPR/Cas 核酸檢測(cè)系統(tǒng) 為了達(dá)到較好的靈敏度和特異度，目前的CRISPR 系統(tǒng)經(jīng)常與擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)靶富集和信號(hào)擴(kuò)增。而無(wú)擴(kuò)增核酸檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)主要包括原始信號(hào)檢測(cè)提高保真性、避免潛在的氣溶膠污染和縮短檢測(cè)時(shí)間等。利用無(wú)擴(kuò)增系統(tǒng)是CRISPR/Cas 檢測(cè)的大趨勢(shì)。構(gòu)建無(wú)擴(kuò)增系統(tǒng)的策略主要包括CRISPR/Cas 產(chǎn)生的反式裂解活性增強(qiáng)，以及提高信號(hào)檢測(cè)器的靈敏度兩個(gè)方面。

第一，基于CRISPR/Cas 產(chǎn)生的反式裂解活性增強(qiáng)的無(wú)擴(kuò)增系統(tǒng)。Fozouni 等[46]基于CRISPR/Cas13a 開(kāi)發(fā)了一種可在30 min 內(nèi)以100 拷貝/μL 的靈敏度檢出鼻拭子樣品中新型冠狀病毒的無(wú)擴(kuò)增精密檢測(cè)方法。該方法將多個(gè)crRNA 連接起來(lái)以提高CRISPR 診斷的檢測(cè)靈敏度，并利用酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)量化病毒載量。Liu 等[47]利用多個(gè)crRNA 探針進(jìn)行串聯(lián)，建立了靈敏度高達(dá)30 拷貝/μL 的無(wú)擴(kuò)增靶RNA 檢測(cè)方法。該方法通過(guò)靶RNA 觸發(fā)Cas13a/crRNA 的反式裂解活性，裂解ssRNA 探針，激活Csm6 蛋白的RNA 內(nèi)切酶活性來(lái)剪切熒光分子，使分子爆裂放大信號(hào)。該系統(tǒng)中將8 個(gè)crRNA 探針串聯(lián)，檢測(cè)靈敏度再次從1 000 拷貝/μL 提高到31 拷貝/μL。Tian 等[48]采用微滴法，通過(guò)減少CRISPR 反應(yīng)的體積，使其達(dá)到Cas13a 蛋白所需的最小濃度，從而提高靶核酸的濃度，在單分子水平上實(shí)現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)，將濃度提高到pM 水平。

第二，通過(guò)提高信號(hào)檢測(cè)器的靈敏度構(gòu)建CRISPR/Cas 無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)。Dai 等[49]建立了以CRISPRCas12a 為基礎(chǔ)的電化學(xué)生物傳感器（E-CRISPR）系統(tǒng)，在靶核酸存在的情況下，Cas12a 的反式裂解被激活，亞甲基藍(lán)修飾的ssDNA 偶聯(lián)在金電極上被裂解，導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的脫離和電導(dǎo)率的轉(zhuǎn)變，通過(guò)電流值的變化來(lái)監(jiān)測(cè)目標(biāo)核酸，可以達(dá)到pmol 的靈敏度。該團(tuán)隊(duì)還嘗試?yán)肊-CRISPR 結(jié)合核酸適配體檢測(cè)非核酸靶標(biāo)。Xu 等[50]通過(guò)將CRISPR 裂解活性引入E-DNA 傳感器，構(gòu)建了Cas9/Cas12a 增強(qiáng)的E-DNA 傳感器，該檢測(cè)系統(tǒng)可以在無(wú)擴(kuò)增的情況下檢測(cè)到pmol 水平的核酸。Hajian 等[51]整合CRISPR/Cas9 和基于石墨烯的場(chǎng)效應(yīng)晶體管技術(shù)，開(kāi)發(fā)了石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管技術(shù)，稱(chēng)為CRISPR-chip。該檢測(cè)系統(tǒng)可以在15 min 內(nèi)以高達(dá)1.7 fM 的靈敏度實(shí)現(xiàn)無(wú)擴(kuò)增直接檢測(cè)目標(biāo)DNA。

3 CRISPR/Cas 檢測(cè)非核酸靶標(biāo)

多項(xiàng)研究正在嘗試?yán)肅RISPR/Cas 構(gòu)建非核酸靶標(biāo)如蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞等的檢測(cè)系統(tǒng)。通過(guò)生物祖體（包括適體、DNAzymes 和抗原-抗體反應(yīng)）特異性識(shí)別靶物質(zhì)實(shí)現(xiàn)非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)換為核酸信號(hào)，將實(shí)現(xiàn)基于CRISPR/Cas 的非核酸物質(zhì)檢測(cè)系統(tǒng)[18]。如核酸適體是一種短的寡核苷酸序列，能以高親和力和高特異性與相應(yīng)的配體結(jié)合，常被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”[52]。適體在溶液中主要表現(xiàn)為非結(jié)構(gòu)化。一旦適體與其配體結(jié)合，它們就折疊成分子結(jié)構(gòu)，配體就成為核酸結(jié)構(gòu)的固有部分。適配體-配體結(jié)合的特異性通常依賴(lài)于平面部分的精確堆疊、特定的氫鍵和分子形狀的互補(bǔ)性[53-54]。因此，結(jié)合適體已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多基于CRISPR/Cas 的非核酸檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、小分子、細(xì)胞等。隨著技術(shù)的進(jìn)步，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)構(gòu)建非核酸靶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)將越來(lái)越成熟，有巨大的應(yīng)用潛力。

4 討論

CRISPR/Cas 系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用且已取得極大的突破[2-3，55]，除了其強(qiáng)大的基因編輯能力，CRISPR/Cas 系統(tǒng)中Cas 蛋白的特性，如序列特異性識(shí)別、特異性核酸內(nèi)切酶活性以及Cas12、Cas13 和Cas14 的反式裂解活性，以及CRISPR 可編程特性等激發(fā)了人們對(duì)開(kāi)發(fā)新型檢測(cè)工具的極大興趣。本文旨在介紹CRISPR/Cas 系統(tǒng)在檢驗(yàn)中的檢測(cè)原理以及在核酸檢測(cè)應(yīng)用中的現(xiàn)狀，以期掌握CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展方向，為臨床疾病診斷帶來(lái)積極的影響。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)核酸的特異性識(shí)別為核酸檢測(cè)提供了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目標(biāo)中痕量原始濃度的信號(hào)轉(zhuǎn)換和放大是分析系統(tǒng)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。解決的方案主要包括：（1）將CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)，如PCR[56]以及SDA[57-58]、RCA[59]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增[60]等恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，提高核酸檢測(cè)靈敏度。（2）利用Cas12、Cas13 和Cas14 等的反式裂解活性，即特異識(shí)別激活后裂解非特異性核酸探針，使信號(hào)明顯放大[13]。該策略實(shí)現(xiàn)無(wú)靶標(biāo)預(yù)擴(kuò)增的核酸檢測(cè)，便于現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)檢測(cè)；實(shí)現(xiàn)原始信號(hào)的放大，避免了預(yù)擴(kuò)增中引入的錯(cuò)誤，大大提高特異度和靈敏度。（3）利用多種Cas 效應(yīng)蛋白作為高特異度的序列識(shí)別元件，結(jié)合電化學(xué)、比色法和熒光等多種信號(hào)輸出方法，開(kāi)發(fā)了一系列無(wú)擴(kuò)增系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了核酸的高靈敏度和選擇性檢測(cè)[49]。

基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)對(duì)非核酸靶標(biāo)的檢測(cè)仍處于起步探索階段[18]。CRISPR/Cas 系統(tǒng)檢測(cè)非核酸靶標(biāo)面臨的挑戰(zhàn)是如何進(jìn)行將非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)。核酸適體、DNAzymes 和抗原抗體等具有特異性結(jié)合靶蛋白的能力，可以有效地完成非核酸信號(hào)的轉(zhuǎn)化和輸出。

盡管CRISPR/Cas 系統(tǒng)在生物傳感方面已經(jīng)突出了各種優(yōu)勢(shì)，但仍有一些挑戰(zhàn)需要克服。首先，由于目標(biāo)預(yù)擴(kuò)增過(guò)程容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，因此開(kāi)發(fā)基于CRISPR/Cas 的檢測(cè)方法，在不進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增的情況下達(dá)到預(yù)期靈敏度是非常關(guān)鍵的。最近，多種crRNA 組合的策略被設(shè)計(jì)用來(lái)提高靈敏度和特異度，從而可以直接定量分析病毒載量。此外，延長(zhǎng)crRNA 的3'或5'端可以提高Cas12a 的側(cè)支裂解活性和識(shí)別特異性。其次，Cas 蛋白存在一定的背景活性，不同批次的背景活性不同，導(dǎo)致樣品檢測(cè)結(jié)果存在差異。第三，crRNA 和ssDNA/ssRNA 信號(hào)報(bào)告序列在臨床復(fù)雜樣品中仍然存在降解的風(fēng)險(xiǎn)。添加RNase 抑制劑和重新設(shè)計(jì)報(bào)告基因可以避免不必要的降解。

綜上所述，由于CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有模塊化和可編程的特點(diǎn)，可以與擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)超低濃度樣品的精確、靈敏檢測(cè)。此外，通過(guò)將CRISPR/Cas系統(tǒng)與其他設(shè)備如基于紙張的橫向流動(dòng)分析、場(chǎng)效應(yīng)晶體管和微流體設(shè)備耦合，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和特異度的即時(shí)檢測(cè)。目前，結(jié)合特異性適配體，CRISPR/Cas 系統(tǒng)已成功用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞、蛋白質(zhì)和金屬離子等非核酸檢測(cè)，同時(shí)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)的基因編輯，也將成為細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的有力工具。

（本文由浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)推薦）