基于HPLC 指紋圖譜不同產(chǎn)地板藍(lán)根主要活性成分與其根際土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性研究

秦 露，李 健，耿燕楠，楊 敏，劉廣緒，馮 帥,2*，李 峰,2*

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2.李峰名老中醫(yī)工作室，山東 濟(jì)南 250355

3.山東省中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250355

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽等功效[1]，臨床上常用于預(yù)防和治療流行性感冒、肺炎、腮腺炎等疾病[2-3]?，F(xiàn)代研究表明，板藍(lán)根具有抗炎、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素和免疫調(diào)節(jié)作用[4-7]。板藍(lán)根的主要成分為生物堿類、有機(jī)酸類、蒽醌類、黃酮類、木脂素類、氨基酸類、多糖類、核苷等[8]，其中，腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷等核苷類成分是其抗病毒的主要活性成分，能干擾病毒核酸的合成[9-10]?！吨袊?guó)藥典》2020年版僅規(guī)定了板藍(lán)根中水溶性成分(R,S)-告依春作為其含量測(cè)定項(xiàng)，藥材質(zhì)量難以全面把握[1]。

隨著市場(chǎng)需求的不斷上升，目前菘藍(lán)在全國(guó)各地廣泛種植，主產(chǎn)于河北、山東、安徽、河南、黑龍江等地，但由于生態(tài)環(huán)境（氣候因子、土壤因子、地形因子等）、栽培模式、采收加工等的影響，不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量差異較大，在一定程度上影響了臨床療效[11-14]。土壤作為植物生長(zhǎng)的載體，是藥用植物的生長(zhǎng)、繁育與品質(zhì)形成所需物質(zhì)基礎(chǔ)的主要來(lái)源[15]。尤其是根際土壤，直接接觸植物根系，與藥用植物品質(zhì)的形成密切相關(guān)[16]。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者主要側(cè)重板藍(lán)根化學(xué)成分和藥理作用的研究，而對(duì)其生態(tài)環(huán)境中土壤因子研究頗少[17]，因此，為獲得高品質(zhì)的板藍(lán)根藥材，亟需對(duì)板藍(lán)根質(zhì)量與土壤因子的相關(guān)性進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)選取9 個(gè)不同產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材，采用HPLC 建立指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行分析，同時(shí)測(cè)定板藍(lán)根中胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷和(R,S)-告依春5 個(gè)指標(biāo)成分的含量，并應(yīng)用Origin 軟件對(duì)板藍(lán)根主要指標(biāo)成分與其根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為合理規(guī)范化種植藥材提供參考，也為菘藍(lán)規(guī)范化栽培以及板藍(lán)根藥材質(zhì)量和產(chǎn)量的提升提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）、FA2004B 型萬(wàn)分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）、KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、TDL-5-A 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、FW-80 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

對(duì)照品尿苷（批號(hào)N10M11W109430）、鳥(niǎo)苷（批號(hào) J09GB154303）、(R,S)-告依春（批號(hào)Z27N11X132307）、腺苷（批號(hào)N24D11W135689）、胞苷（批號(hào)T16J7X9000）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；甲醇（色譜純，批號(hào)220655059）、乙腈（色譜純，批號(hào)22065062）購(gòu)自帝蒽科國(guó)際貿(mào)易有限公司；甲醇（分析純，批號(hào)GB/T683-2006）、乙醇（分析純，批號(hào)GB/T678-2002）、甲酸（批號(hào)GB/T15896-1995）、磷酸（批號(hào)Q/12KM4168-2018）購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。共收集板藍(lán)根16 批，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)I.indigoticaFort.的干燥根，具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 板藍(lán)根藥材樣品收集信息Table 1 Collecting information of Isatidis Radix samples

1.3 根際土壤樣品的采集

采用五點(diǎn)采樣法，隨機(jī)選取5 組長(zhǎng)勢(shì)一致的健康菘藍(lán)植株，先將表面約3 cm 的表層土去除，用鐵锨將整個(gè)根挖出，采用抖根法[18]輕輕抖落大塊土壤，用軟刷收集整個(gè)根表的根際土，裝入采樣袋中，注明產(chǎn)地，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，將每個(gè)產(chǎn)地的5 組板藍(lán)根根際土壤分別混勻?yàn)? 個(gè)樣品后自然風(fēng)干，研細(xì)過(guò)篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。采樣點(diǎn)信息見(jiàn)表2。

表2 板藍(lán)根根際土壤采樣地點(diǎn)地理信息Table 2 Geographic information of sampling sites of Isatidis Radix rhizosphere soil

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.3%甲酸水；梯度洗脫：0～14 min，0.5%甲醇；14～24 min，0.5%～10%甲醇；24～35 min，10%～20%甲醇；35～50 min，20%～35%甲醇；50～55 min，35%～50%甲醇；55～60 min，50%～55%甲醇；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量12 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取板藍(lán)根粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，稱定質(zhì)量并記錄，超聲提取60 min（100 W、60 kHz），放冷，用水補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春對(duì)照品1.03、1.51、1.26、1.02、4.52 mg，加水溶解并定容至25 mL，制成質(zhì)量濃度分別為41.20、60.40、50.40、40.80、180.80 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，該方法的峰面積與相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取板藍(lán)根（S4）樣品1份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，峰面積與相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2%，表明該方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批次樣品6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，峰面積與相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.7 相似度評(píng)價(jià) 稱取16 批板藍(lán)根樣品的粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，得到板藍(lán)根的指紋圖譜。將16 批板藍(lán)根的色譜圖以AIA 格式依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012 版）進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，得到吸收強(qiáng)、特征明顯且穩(wěn)定性較好的14 個(gè)共有峰。以S4 為參照?qǐng)D譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.5，采用平均數(shù)法計(jì)算，經(jīng)多點(diǎn)校正和Mark 峰匹配后生成對(duì)照指紋圖譜（R）[19-20]，對(duì)照指紋圖譜和16 批樣品的HPLC 指紋圖譜見(jiàn)圖1、圖2。通過(guò)與混合對(duì)照品溶液的色譜圖比對(duì)，指認(rèn)出5 個(gè)共有峰，分別為胞苷（2 號(hào)峰）、尿苷（7 號(hào)峰）、腺苷（9 號(hào)峰）、鳥(niǎo)苷（10 號(hào)峰）、(R,S)-告依春（11 號(hào)峰）。以生成的對(duì)照指紋圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算得到16 批藥材樣品的HPLC 指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.967、0.984、0.991、0.978、0.992、0.998、0.996、0.932、0.985、0.973、0.987、0.971、0.987、0.971、0.858、0.859，均＞0.85，表明各產(chǎn)地間的板藍(lán)根有較高的一致性。

圖1 16 批板藍(lán)根HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 16 batches of Isatidis Radix

圖2 板藍(lán)根的對(duì)照指紋圖譜 (A) 和混合對(duì)照品指紋圖譜 (B)Fig.2 Control fingerprint (A) and mixed reference fingerprint (B) of Isatidis Radix

2.1.8 聚類分析 選取 (R,S)-告依春（峰11）為參考峰，對(duì)板藍(lán)根的共有峰的峰面積進(jìn)行歸一化，然后將其導(dǎo)入Origin Pro 2022 軟件作圖。結(jié)果顯示，16 批樣品按照產(chǎn)地可分為3 類，第I 類包括萊蕪（S1）、陜西（S9、S14）、神秀谷（S10）、威海（S8）；第II類包括長(zhǎng)清（S2、S11～S13）、泰安（S4）、章丘（S3）、黑龍江（S6）、馬山（S7）、亳州（S5）；第III 類包括甘肅（S15、S16），聚類分析熱圖如圖3 所示。

圖3 16 批板藍(lán)根聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of 16 batches of Isatidis Radix

2.1.9 主成分分析（principal component analysis，PCA） 為進(jìn)一步探討不同產(chǎn)地板藍(lán)根化學(xué)成分的差異，在HPLC 指紋圖譜匹配結(jié)果中，選取峰11(R,S)-告依春為參考峰，對(duì)各色譜峰峰面積進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算不同保留時(shí)間下歸一化峰面積值。將生成的匹配數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro 2022 軟件，建立主成分分析模型，見(jiàn)圖4；選擇特征值大于1 的前3 個(gè)主成分，計(jì)算貢獻(xiàn)率（表3），它們的貢獻(xiàn)率分別是64.21%、14.07%、8.40%，前3 位主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.65%，證明模型擬合能力良好。主成分因子載荷結(jié)果（表4）表明，主成分1 的信息主要來(lái)源于峰1～7、9、10；主成分2 的信息主要來(lái)源于峰8、14；主成分3 的信息主要來(lái)源于峰12、13。由16 批板藍(lán)根PCA 分析圖（圖4）可以看出，不同產(chǎn)地的樣本分類效果較好，尤其是甘肅產(chǎn)地（S15、S16）與其他地區(qū)有明顯的區(qū)別，總體結(jié)果與聚類分析結(jié)果保持一致。

圖4 16 批板藍(lán)根主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of 16 batches of Isatidis Radix

表3 主成分權(quán)重結(jié)果Table 3 Principal component weight results table

表4 因子載荷系數(shù)Table 4 Factor load coefficient table

2.2 5 個(gè)指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春對(duì)照品溶液適量，逐級(jí)稀釋成一定濃度的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，在波長(zhǎng)254 nm 下測(cè)定并記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），求得胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春的回歸方程、線性范圍及回歸方程見(jiàn)表5。

表5 回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Regression equation and correlation coefficient

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春峰面積的RSD 值分別為0.17%、0.09%、0.15%、0.05%、0.34%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取板藍(lán)根S4 樣品0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春峰面積的RSD 值分別為0.40%、0.97%、1.58%、0.35%、0.19%，均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6 份S4 板藍(lán)根粉末0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春峰質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為0.15%、2.11%、0.55%、0.22%、0.12%，均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測(cè)定的板藍(lán)根粉末6 份，每份稱量0.25 g，分別精密加入混合對(duì)照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣分析，胞苷、尿苷、腺苷、尿苷和(R,S)-告依春的加樣回收率分別為103.35%、98.05%、98.11%、96.08%、95.21%，RSD 分別為0.89%、0.23%、0.18%、0.25%、0.17%，符合要求。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 按照“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備16 批板藍(lán)根供試品的溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別測(cè)定其中的胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷、(R,S)-告依春含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值，見(jiàn)表6。16 批藥材樣品中胞苷、尿苷、腺苷、鳥(niǎo)苷，(R,S)-告依春的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.152 0～0.299 4、0.290 2～0.666 1、0.316 5～0.855 2、0.167 4～0.525 8、0.615 0～2.844 8 mg/g，不同產(chǎn)地不同批次的板藍(lán)根藥材中的5 種成分含量差異明顯，均具有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明板藍(lán)根不同種植地區(qū)對(duì)其質(zhì)量影響較大。

表6 16 批板藍(lán)根中5 種成分的含量Table 6 Composition content table

2.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定及分析

收集9 個(gè)不同產(chǎn)地板藍(lán)根（山東萊蕪、山東長(zhǎng)清、山東章丘、山東泰安、安徽亳州、黑龍江大慶、山東馬山、山東威海、陜西商洛）根際土壤，測(cè)定土壤理化性質(zhì)，測(cè)定方法參考《土壤農(nóng)化分析》[21]，其中土壤含水量（soil moisture content，SMC）的測(cè)定方法為烘干法；土壤pH 值的測(cè)定方法為水浸提（水土比2.5∶1）-電位法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)（organicmatter，OM）的測(cè)定方法為外加熱重鉻酸鉀氧化容量法；有效磷（available phosphorus，AP）的測(cè)定方法為碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀（available potassium，AK）的測(cè)定方法為醋酸銨浸提-火焰光度法；銨態(tài)氮（ammonium nitrogen，NH4+-N）的測(cè)定方法為靛藍(lán)比色法；硝態(tài)氮（nitrate nitrogen，NO3--N）的測(cè)定方法為2 mol/L KCl 浸提后用堿解擴(kuò)散法，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。

測(cè)定結(jié)果如圖5 所示，9 個(gè)產(chǎn)地的板藍(lán)根根際土壤理化性質(zhì)有較大差異。其中土壤pH 范圍在5.86～8.00，除陜西的土壤偏酸性以外，其余產(chǎn)地均偏堿性，亳州的土壤堿性最強(qiáng)，陜西的土壤pH 值顯著低于其他產(chǎn)地（P＜0.05）；含水量范圍為7.86%～21.15%，亳州）最高，威海最低，差異性顯著（P＜0.05）；有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.50～31.51 g/kg，黑龍江最高，威海最低，具有顯著差異（P＜0.05）。銨態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.32～67.59 mg/kg，亳州最高，長(zhǎng)清最低；硝態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40.68～219.30 mg/kg，除萊蕪與黑龍江的含量無(wú)顯著性差異外，其余產(chǎn)地含量均有顯著性差異（P＜0.05）；有效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在14.08～43.49 mg/kg，亳州（S5）最高，威海最低；速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為146.40～636.00 mg/kg，亳州最高，威海最低，9 個(gè)產(chǎn)地均具有顯著性差異（P＜0.05）。在9 個(gè)產(chǎn)地中，亳州產(chǎn)地的pH 值、含水量、銨態(tài)氮、有效磷和速效鉀5 個(gè)理化性質(zhì)的含量較其他產(chǎn)地顯著偏高，威海產(chǎn)地的含水量、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、有效磷和速效鉀5 個(gè)理化性質(zhì)的含量較其他產(chǎn)地顯著偏低。

圖5 土壤理化性質(zhì)匯總圖Fig.5 Summary map of soil physical and chemical properties

2.4 相關(guān)性分析

將板藍(lán)根藥材樣品（S1～S9）活性成分含量測(cè)定數(shù)據(jù)及與之對(duì)應(yīng)的板藍(lán)根根際土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro 2022 軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖6。胞苷含量與pH、含水量、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關(guān)，與銨態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)；尿苷含量與含水量、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、速效鉀含量呈正相關(guān)，與pH、銨態(tài)氮、有效磷、含量呈負(fù)相關(guān)；腺苷含量與含水量、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關(guān)，與pH 呈負(fù)相關(guān)；鳥(niǎo)苷含量與pH、含水量、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關(guān)，與硝態(tài)氮含量呈負(fù)相關(guān)；(R,S)-告依春含量與pH、硝態(tài)氮、有效磷含量呈正相關(guān)，與含水量、有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、速效鉀含量呈負(fù)相關(guān)。其中，胞苷含量與有效磷含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；尿苷含量與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；腺苷含量與含水量和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。尿苷含量與腺苷含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。pH 與硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；速效鉀含量與含水量和有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，土壤理化性質(zhì)與板藍(lán)根藥材主要化學(xué)成分含量具有一定的相關(guān)性，其中土壤pH、含水量、有效磷、速效鉀是影響板藍(lán)根藥材質(zhì)量的主控因子。

圖6 板藍(lán)根活性成分與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性圖Fig.6 Correlation diagram of active components of medicinal materials and soil physicochemical properties

3 討論

控制中藥的質(zhì)量是保證其發(fā)揮藥效的前提，也是中藥產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化需面對(duì)的問(wèn)題。目前，隨著中藥材種植區(qū)域范圍的逐漸擴(kuò)大，中藥材的質(zhì)量更加難以保障，不僅影響了中藥在臨床中發(fā)揮療效，也使中醫(yī)藥走向國(guó)際化的發(fā)展受阻。板藍(lán)根作為常用的大宗藥材，是很多制劑的主要原料，但存在不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地不同批次板藍(lán)根質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象。本研究含量測(cè)定結(jié)果表明，板藍(lán)根藥材中的5 種成分含量在不同產(chǎn)地不同批次間差異較大，不同種植地區(qū)對(duì)板藍(lán)根的質(zhì)量影響較大。HPLC 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法已廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面。本研究運(yùn)用HPLC 指紋圖譜對(duì)不同產(chǎn)地不同批次的板藍(lán)根進(jìn)行相似度分析，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法，對(duì)不同來(lái)源的樣品進(jìn)行分類和鑒別，更為全面的表征板藍(lán)根的質(zhì)量。為了確保HPLC 指紋圖譜和含量測(cè)定的準(zhǔn)確可靠，本研究分別對(duì)提取方法（超聲、回流）、提取時(shí)間（30、45、60 min）、提取溶劑（水、甲醇、乙醇）、流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.3%甲酸）、檢測(cè)波長(zhǎng)（248、254、260、270 nm）、體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）及洗脫程序進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳的實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果顯示，超聲和回流2 種提取方法圖譜相似，但超聲提取方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，效率更高；提取時(shí)間60 min 所得圖譜的整體峰面積更大；以水作提取溶劑所得峰面積更大，更安全；以甲醇-0.3%甲酸為流動(dòng)相時(shí)色譜峰分布均勻，分離度最好；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm 處整體峰面積更大，色譜峰較豐富且分布均勻、峰形好；0.8 mL/min 的體積流量分離度更佳；柱溫30 ℃時(shí)色譜峰分離度更好且峰形完整。

生態(tài)環(huán)境對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)、繁育和有效成分的積累具有至關(guān)重要的影響[22-23]。研究表明，除了地域和氣候之外，土壤理化性質(zhì)、土壤污染程度等對(duì)藥用植物的生長(zhǎng)及藥效都有很大影響[24]。土壤質(zhì)地是決定藥用植物資源分布的主要影響因素[25]。陳貝貝等[26]采用不同土壤含水量梯度，分析沙棘的繁殖能力與種群特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)土壤含水量可以限制藥用植物的生態(tài)分布。Xu 等[27]研究連作下影響三七存活率的土壤因素，發(fā)現(xiàn)土壤磷酶、速效氮、pH等6 個(gè)土壤參數(shù)均與三七成活率相關(guān)，且三七生長(zhǎng)的最佳pH 約為6.5。我國(guó)幅員遼闊，全國(guó)各地區(qū)的土壤理化性質(zhì)差異巨大，本研究發(fā)現(xiàn)土壤理化性質(zhì)與板藍(lán)根主要活性成分含量有一定的相關(guān)性，胞苷含量與有效磷含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），尿苷含量與pH 呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），腺苷含量與含水量和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），土壤pH、含水量、有效磷、速效鉀含量是影響板藍(lán)根藥材質(zhì)量的主控因子。適當(dāng)施加磷肥、鉀肥，適當(dāng)增加土壤水分，適當(dāng)調(diào)節(jié)土壤pH 可能會(huì)增加板藍(lán)根藥材中有效成分的積累，后期將擴(kuò)大樣本量，篩選出更加適宜菘藍(lán)生長(zhǎng)的生態(tài)環(huán)境，尋找適合板藍(lán)根有效成分積累的土壤環(huán)境，從源頭上保障藥材質(zhì)量，為中醫(yī)臨床用藥的有效性提供基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突