經(jīng)典名方達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞研究

張榮華，靳梓微，張騰月，邱智東，李銀清

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130117

達(dá)原飲出自明代吳又可所著《溫疫論》，是國(guó)家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》第72 方[1]，由檳榔、厚樸、草果、黃芩、知母、芍藥、甘草7 味中藥組成，是治療溫疫初起邪伏膜原的經(jīng)典方劑，具有開達(dá)膜原、辟穢化濁之功效。現(xiàn)代臨床上常用來治療各種類型發(fā)熱，急性突發(fā)傳染病、呼吸系統(tǒng)疾病等問題[2-3]。經(jīng)典名方都是經(jīng)過了長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐，療效確切，在應(yīng)對(duì)突發(fā)重大疫情中優(yōu)勢(shì)明顯，極具開發(fā)價(jià)值[4]。

目前達(dá)原飲主要在藥理作用和臨床應(yīng)用研究較多[5-7]，關(guān)于質(zhì)量控制研究報(bào)道較少，肖康寧等[8]利用超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法識(shí)別達(dá)原飲中化學(xué)成分，明確其化學(xué)組成，有研究者對(duì)達(dá)原飲中部分藥進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[9-10]，缺乏達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品整體的特征圖譜及關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞研究，為了推進(jìn)達(dá)原飲復(fù)方制劑的進(jìn)一步研究應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)遵循《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求》[11]，在文獻(xiàn)考證和遵古制備工藝的基礎(chǔ)上，制備了15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品，通過構(gòu)建其特征圖譜研究，結(jié)合出膏率范圍和指標(biāo)性成分含量轉(zhuǎn)移率范圍對(duì)飲片-基準(zhǔn)樣品量值傳遞過程進(jìn)行分析，以期為達(dá)原飲質(zhì)量控制和制劑開發(fā)提供借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC2030 型高效液相色譜儀，UV 檢測(cè)器，日本島津公司；AB135-S 型十萬分之一電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；XS105DU 型電子分析天平，德國(guó)梅特勒-托利多公司；GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；UPT-II-10T 型優(yōu)普超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；2-4 LS-CpLus 型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)EpsiLon 公司；KQ-250B 型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；TGL16E 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司；陶瓷煎藥壺，潮州壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試劑與藥材

1.2.1 試藥 對(duì)照品氫溴酸檳榔堿（批號(hào)111684-202003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、和厚樸酚（批號(hào)110730-201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%）、甘草酸銨（批號(hào)110731-201720，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）、黃芩苷（批號(hào)110715-202122，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.2%）、漢黃芩素（批號(hào)111514-201706）、黃芩素（批號(hào)111595-201808，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.9%）、芒果苷（111607-201704，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%）、芍藥苷（批號(hào)110736-202044，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品兒茶素（批號(hào)B21722，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)B21149，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.4%）均購于源葉生物技術(shù)有限公司；磷酸、乙腈、甲醇，色譜純，美國(guó)Fisher 公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；分析純甲醇，北京化工廠。

1.2.2 藥材信息 15 批檳榔、厚樸、草果、黃芩、知母、白芍、甘草飲片均購于吉林省北藥藥材加工有限公司和吉林省宏檢大藥房，飲片詳細(xì)信息見表1，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定，檳榔為棕櫚科檳榔屬植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子；厚樸為木蘭科厚樸屬植物厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮；草果為姜科豆蔻屬植物草果Amomumtsao-koCrevost et Lemaire.的干燥成熟果實(shí)；知母為百合科知母屬植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖；黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根；白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根；甘草為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根和根莖。以上藥材均符合《中國(guó)藥典》2020 年版飲片要求。

表1 達(dá)原飲中各飲片及基準(zhǔn)樣品組合信息Table 1 Combination information of each decoction piece and benchmark sample in Dayuan Decoction

2 方法與結(jié)果

2.1 達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的制備

通過本課題組前期考證及度量衡換算，還原出達(dá)原飲的基準(zhǔn)樣品制備方法為稱取檳榔7.5 g、厚樸3.73 g、草果1.87 g、知母3.73 g、黃芩3.73 g、白芍3.73 g、甘草1.87 g，加水400 mL，武火2 200 W煮沸后轉(zhuǎn)文火800 W 煎煮30 min，雙層200 目紗布趁熱濾過，得藥液160 mL，冷凍干燥（凍干溫度為?80 ℃，真空度為10 Pa）凍干72 h，得15 批達(dá)原飲（S1～S15）基準(zhǔn)樣品凍干粉，通過隨機(jī)數(shù)表法對(duì)各批次飲片進(jìn)行隨機(jī)組合信息見表1，同法制備各單味藥飲片及缺檳榔、缺厚樸、缺草果、缺知母、缺白芍、缺黃芩、缺甘草處方藥材飲片的各陰性溶液凍干粉。

2.2 達(dá)原飲特征圖譜方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～5 min，4%乙腈；5～10 min，4%～11%乙腈；10～35 min，11%～18%乙腈；35～50 min，18%～25%乙腈；50～75 min，25%～33%乙腈；75～85 min，33%～55%乙腈；85～90 min，55%～70%乙腈；90～100 min，70%乙腈；100～110 min，70%～4%乙腈；110～120 min，4%乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)0～50 min 為225 nm，50～90 min 為250 nm，90～120 min 為294 nm；柱溫為30 ℃；體積流量0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL?；旌蠈?duì)照品及達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的HPLC 圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品 (A) 和達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and Dayuan Decoction benchmark sample (B)

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取凍干粉0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇60 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率50 Hz）45 min，放至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取兒茶素、芒果苷、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素、甘草酸銨、和厚樸酚與厚樸酚對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為12.030、43.684、34.230、52.430、145.712、42.734、46.362、54.135、36.523、32.132 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取S1 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，色譜圖中黃芩苷（12 號(hào)峰）保留時(shí)間適中且峰形較好、分離度高，因此以黃芩苷為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.12%～0.27%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.18%～2.14%，表明該方法精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷（12 號(hào)峰）為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD 為0.16%～1.46%，相對(duì)峰面積的RSD 為0.76%～1.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1 基準(zhǔn)樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，以黃芩苷（12 號(hào)峰）為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.23%～0.98%，相對(duì)峰面積的RSD 為1.26%～2.54%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 達(dá)原飲指紋圖譜評(píng)價(jià)及飲片-基準(zhǔn)樣品量值傳遞關(guān)系研究

按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將所得特征圖譜以cdf 格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）》軟件，以S1 作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.1，進(jìn)行全譜峰匹配，計(jì)算15 批達(dá)原飲（S1～S15）基準(zhǔn)樣品特征圖譜的相似度，結(jié)果分別為0.996、0.998、0.986、0.997、0.983、0.991、0.993、0.991、0.990、0.987、0.974、0.995、0.998、0.994、0.999，特征圖譜相似度均大于0.97，符合指紋圖譜要求。表明各批次間物質(zhì)群較為穩(wěn)定，特征圖譜疊加圖見圖2。

圖2 15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品 (S1～S15) 的HPLC 特征圖譜及其對(duì)照特征圖譜Fig.2 HPLC characteristic chromatograms and control characteristic chromatograms of 15 batches of Dayuan Decoction benchmark samples (S1—S15)

15 批達(dá)原飲物質(zhì)基準(zhǔn)樣品有20 個(gè)共有峰，與單味藥飲片及其陰性樣品比對(duì)結(jié)果見圖3、4，其中峰4（兒茶素）為檳榔專屬峰；峰3、11、19（和厚樸酚）、20（厚樸酚）為厚樸專屬峰；峰1、7（芍藥內(nèi)酯苷）、8（芍藥苷）、10 為白芍專屬峰；峰12（黃芩苷）、13、14、15（漢黃芩素）、16（黃芩素）、18為黃芩專屬峰；峰2、6（芒果苷）為知母專屬峰；峰5、17（甘草酸銨）為甘草專屬峰；而峰9 為厚樸和白芍共有峰。

圖3 各味藥材飲片與達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜比較Fig.3 Comparison of the reference chromatograms of decoction pieces of various medicinal materials and Dayuan Decoction benchmark samples

圖4 各缺單味藥陰性樣品與達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品對(duì)照?qǐng)D譜比較Fig.4 Comparison of the negative samples of each single drug and Dayuan Decoction benchmark samples

以每味藥中的1 個(gè)特征峰為參照峰（檳榔參照峰為4 號(hào)峰，厚樸參照峰為3 號(hào)峰，知母參照峰為2 號(hào)峰，黃芩參照峰為12 號(hào)峰，白芍參照峰為8 號(hào)峰，甘草參照峰為18 號(hào)峰），比較15 批基準(zhǔn)樣品與其各單味藥共有峰峰面積的均值，結(jié)果見表2，大部分色譜峰歸屬關(guān)系清晰且具有良好的傳遞性，飲片中的物質(zhì)群向基準(zhǔn)樣品中較為穩(wěn)定地傳遞，個(gè)別色譜峰的相對(duì)峰面積有明顯差異，如19 號(hào)峰（和厚樸酚）和20 號(hào)峰（厚樸酚）相對(duì)峰面積降低，分析可知和厚樸酚與厚樸酚屬于脂溶性成分，難溶于水，故它們?cè)谒逯蠓ㄖ苽涞幕鶞?zhǔn)樣品中含量較低，導(dǎo)致相對(duì)峰面積降低。

表2 15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品與各味藥材飲片中特征峰相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of characteristic peak in 15 batches of Dayuan Decoction benchmark samples and decoction pieces of various medicinal materials

2.4 達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的出膏率及其出膏轉(zhuǎn)移率規(guī)律研究

按“2.1”項(xiàng)下方法制備15 批達(dá)原飲各單味飲片樣品及基準(zhǔn)樣品，凍干后記錄質(zhì)量，計(jì)算公式為出膏率＝凍干粉質(zhì)量/飲片投料量。理論出膏率應(yīng)為單味藥折算，計(jì)算公式為理論出膏率＝∑單味藥出膏率×(單味藥劑量/全方藥劑量)[12]，結(jié)果見表3。15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的出膏率為12.88%～16.42%，平均出膏率為14.78%，各批次出膏率均在均值的70%～130%，出膏率傳遞率均值為72.41%。實(shí)際出膏率的數(shù)值小于理論值，分析原因可能為單味中藥進(jìn)行煎煮時(shí)其吸水量要大于全方進(jìn)行煎煮時(shí)的吸水量所導(dǎo)致[13]。

表3 達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的出膏率及轉(zhuǎn)移率Table 3 Extract yield and transfer rate of Dayuan Decoction benchmark samples

2.5 達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品中7 種指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

（1）檳榔堿含量測(cè)定：色譜柱為Agilent Zorbax 300-SCX（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.2%磷酸水溶液（用濃氨試液調(diào)節(jié)pH 3.8）-乙腈（45∶55）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液以及達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品供試品溶液的HPLC 圖見圖5。

圖5 氫溴酸檳榔堿對(duì)照品 (A) 和達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.5 HPLC of arecoline hydrobromide reference substance (A) and Dayuan Decoction benchmark sample(B)

（2）厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨含量測(cè)定：色譜條件同“2.2.1”項(xiàng)，混合對(duì)照品溶液以及達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品供試品溶液的HPLC 圖見圖6。

圖6 混合對(duì)照品 (A) 和達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.6 HPLC of mixed reference substance (A) and Dayuan Decoction benchmark sample (B)

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品適量，精密稱定，加0.2%磷酸水溶液（用濃氨試液調(diào)節(jié)pH 3.8）-乙腈（45∶55）制成質(zhì)量濃度為107.78 μg/mL 的溶液（檳榔堿質(zhì)量＝氫溴酸檳榔堿質(zhì)量/1.521 4）。取厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨對(duì)照品適量，精密稱定，甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為195.55、119.95、172.63、524.30、224.42、190.51 μg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 精密稱定樣品0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇60 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率50 Hz）45 min，放至室溫，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.5.4 線性關(guān)系考察 取不同質(zhì)量濃度的指標(biāo)性成分對(duì)照品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表4，結(jié)果表明，檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨在各自線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

表4 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法學(xué)考察Table 4 Investigation of determination method of index component content

2.5.5 精密度試驗(yàn) 取同一批（S1）達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨峰面積的RSD 見表4，結(jié)果表明儀器系統(tǒng)精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（S1）達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨峰面積的RSD 見表4，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（S1）達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，于制備后0、2、4、8、12、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨峰面積的RSD 見表4，結(jié)果表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定指標(biāo)成分含量的同一批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品（S1）共6 份，每份0.15 g，分別加入與供試品溶液中相應(yīng)成分含量約1∶1 的對(duì)照品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定供試品溶液中各指標(biāo)成分含量，計(jì)算加樣回收率及其RSD值，結(jié)果見表4，檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芒果苷、芍藥苷和甘草酸銨的平均加樣回收率均在95%～105%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.9 含量測(cè)定及量值傳遞關(guān)系研究 15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品和對(duì)應(yīng)飲片中指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果及轉(zhuǎn)移率見表5。15 批達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分檳榔堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%～0.19%，平均轉(zhuǎn)移率為18.97%；厚樸酚與和厚樸酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和為0.021 5%～0.052 2%，平均轉(zhuǎn)移率為15.85%；黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.12%～28.72%，平均轉(zhuǎn)移率為59.36%；芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.84%～1.32%，平均轉(zhuǎn)移率為38.88%；芒果苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%～0.13%，平均轉(zhuǎn)移率為21.58%；甘草酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%～0.25%，平均轉(zhuǎn)移率為10.39%。

表5 達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果Table 5 Results of index component content and transfer rate in benchmark samples of Dayuan Decoction

飲片-基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)轉(zhuǎn)移率＝基準(zhǔn)樣品中指標(biāo)成分的含量/飲片中指標(biāo)成分的含量[14]

根據(jù)《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑基準(zhǔn)樣品的申報(bào)資料要求（征求意見稿）》中相關(guān)規(guī)定，不同批次基準(zhǔn)樣品的轉(zhuǎn)移率也應(yīng)在其均值±30%的范圍之內(nèi)[15]，在本研究中檳榔堿、黃芩苷、芍藥苷、芒果苷和甘草酸銨5 個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率都在其均值的±30%，說明前期檳榔、黃芩、白芍、知母和甘草的飲片及基準(zhǔn)樣品的制備工藝相對(duì)穩(wěn)定可行。但是部分批次中厚樸酚與和厚樸酚的轉(zhuǎn)移率超出了其均值±30%的范圍內(nèi)，考慮到由于厚樸酚與和厚樸酚為木脂素類成分，難溶于水，而達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的制備工藝是加水煎煮，因此在基準(zhǔn)樣品中該類成分含量較小波動(dòng)較大，取其均值的±30%，存在的誤差相對(duì)較大，且厚樸各批次間含量差異也較大[16]。因此，在制備達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品時(shí)，要確定飲片中各成分的標(biāo)準(zhǔn)范圍，確保飲片質(zhì)量的均一和穩(wěn)定。

3 討論

3.1 處方組成及劑量考證

根據(jù)對(duì)《溫疫論》中記載的達(dá)原飲的處方原文和國(guó)家發(fā)布的關(guān)鍵信息進(jìn)行考證，對(duì)處方基原、組成及劑量考證，《溫疫論》[17]中記載達(dá)原飲煎煮方法為“檳榔二錢，厚樸一錢，草果仁五分，知母一錢，芍藥一錢，黃芩一錢，甘草五分，右用水一盅，煎八分”。根據(jù)《中國(guó)科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》記載，明清每斤單位量值為596.8 g。由此可得，明清1 斤約600 g；《中國(guó)度量衡史》載清初衡法：“1 斤＝16 兩，1 兩＝10 錢，1 錢＝10 分”，故明清時(shí)期的1 兩約37.3 g，1 錢約3.73 g，1 分約0.373 g，根據(jù)參考《經(jīng)典名方開發(fā)指引》[18]及文獻(xiàn)考證，原文中熱傷榮氣，加芍藥以和血，通過方解確定芍藥指的是白芍。制法中的一盅為200 mL，指以上藥物用200 mL 的水進(jìn)行煎煮?！凹灏朔帧睘榧迦≈潦Ｋ? 分為止，煎至剩水為160 mL。最終確定了達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的制備工藝。

3.2 供試品溶液制備方法考察

本實(shí)驗(yàn)對(duì)特征圖譜樣品提取方式、提取溶劑及提取時(shí)間分別進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以50%甲醇為溶劑時(shí)，特征圖譜色譜峰數(shù)目較多且分離度較好；不同提取方式對(duì)特征圖譜無明顯差異；提取時(shí)間在45 min 以上時(shí)，提取效率隨時(shí)間延長(zhǎng)無明顯變化。最后確定采用超聲提取45 min，50%甲醇為溶劑，提取效果最優(yōu)。

同時(shí)，因?yàn)椤吨袊?guó)藥典》2020 年版中檳榔的檳榔堿含量測(cè)定供試品制備方法復(fù)雜，且需要用到易致毒試劑乙醚及加熱回流的方法制備樣品溶液，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)其方法進(jìn)行改進(jìn)，分別考察不同提取溶劑和提取方式，結(jié)果顯示50%甲醇提取最優(yōu)，超聲和加熱回流提取對(duì)提取效果無明顯差異，最終采用以50%甲醇超聲提取效果最佳。

3.3 色譜條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 建立達(dá)原飲特征圖譜和指標(biāo)成分含量測(cè)定，由于達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品中化學(xué)成分較多，故采取梯度進(jìn)行洗脫。比較不同流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液體系，經(jīng)過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰數(shù)目較少，乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，芍藥苷拖尾，但乙腈洗脫分離效果較好，結(jié)果采用乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，基線平穩(wěn)，色譜峰分離效果較好。另外考察柱溫25、30、35 ℃和體積流量0.6、0.8、1.0 mL/min 對(duì)色譜峰分離度的影響，結(jié)果柱溫30 ℃，體積流量0.8 mL/min 時(shí)色譜條件最佳。

本研究使用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行200～800 nm 全波長(zhǎng)掃描，通過特征色譜峰數(shù)目和響應(yīng)值大小進(jìn)行篩選，波長(zhǎng)在225 nm 時(shí)，色譜峰數(shù)目較多。但由于達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品化學(xué)成分復(fù)雜，含量和紫外吸收差異較大，其中黃芩苷含量高峰面積過大，導(dǎo)致其余色譜峰峰面積發(fā)生變化時(shí)，難以被準(zhǔn)確通過相似度反映，并且達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品中所含大部分物質(zhì)處于末端吸收，而臣藥厚樸中厚樸酚和和厚樸酚在290 nm 附近有強(qiáng)吸收，且厚樸酚和和厚樸酚為脂溶性成分在水煎煮提取中含量較低，單一波長(zhǎng)不能更好地反映各類化學(xué)成分的全部信息。為解決上述問題，采用HPLC 三波長(zhǎng)切換法進(jìn)行測(cè)定。

3.4 基準(zhǔn)樣品關(guān)鍵質(zhì)量屬性量值傳遞分析

達(dá)原飲具有抗病毒、抗炎、解熱、減輕肺損傷及保肝方面等作用[2-3]，基于《中國(guó)藥典》2020 年版藥材項(xiàng)下規(guī)定的指標(biāo)成分與藥效關(guān)聯(lián)性分析，檳榔堿是君藥檳榔中生物堿類主要成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒作用[19]，是其關(guān)鍵藥效物質(zhì)；臣藥厚樸中厚樸酚、和厚樸酚等成分可以通過阻止磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin-ositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）/MAPK 的信號(hào)通路，抑制炎性因子的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抗炎的作用[20]；黃芩苷可減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷，具有保護(hù)和抗炎作用[21]；知母主要成分芒果苷具有抗炎、抗病毒作用[22-24]；芍藥苷為白芍中白芍總苷的代表成分，含量高且穩(wěn)定，具有抗炎作用[25]；甘草酸銨作為甘草酸衍生物通過影響環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和NO 的表達(dá)調(diào)節(jié)炎癥過程，有抗菌、抗炎多種作用[26-27]。故本研究選取檳榔堿、厚樸酚、和厚樸酚、黃芩苷、芍藥苷、芒果苷和甘草酸銨7 個(gè)指標(biāo)成分建立含量測(cè)定方法，并進(jìn)行飲片-基準(zhǔn)樣品中量值傳遞的研究。

15 批基準(zhǔn)樣品中黃芩苷、芍藥苷、甘草酸銨含量較高，檳榔堿、芒果苷、厚樸酚、和厚樸酚成分含量較低，各批樣品中成分含量有差異，與各批次單味藥成分含量相關(guān)。

厚樸酚和和厚樸酚在基準(zhǔn)樣品中含量較低，是因?yàn)楹駱惴雍秃秃駱惴邮菍儆谀局仡惓煞謽O性偏小，在煎煮過程中難溶于水。特征圖譜及多成分含量測(cè)定色譜峰來自于厚樸、黃芩、知母、白芍、甘草5 味藥，檳榔和草果的藥味信息未能很好的體現(xiàn)，檳榔的檳榔堿為小分子生物堿，在C18柱上幾乎無保留[28]，故本研究利用陽離子交換柱對(duì)檳榔堿進(jìn)行含量測(cè)定；在研究基準(zhǔn)樣品過程中未檢測(cè)到草果中成分，經(jīng)分析草果主要含有揮發(fā)油和多酚類成分[29]，在水煎煮中含量極低未達(dá)到高效液相色譜儀定量限，同時(shí)為符合遵古原則要求，本研究只采用水煎煮的制備方法，未進(jìn)行揮發(fā)油或醇提物的收集，后期將采用GC-MS 法對(duì)草果單獨(dú)進(jìn)行研究分析，以更為全面地體現(xiàn)藥味信息。

本研究從達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品特征圖譜、指標(biāo)性成分含量和出膏率3 方面的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，全面分析達(dá)原飲基準(zhǔn)樣品的量值傳遞規(guī)律，為經(jīng)典名方達(dá)原飲后續(xù)開發(fā)及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突