中麻黃中2 個新天然產(chǎn)物

范錫玲，曹彥剛，焦新棉，馬新毅，鄭曉珂，馮衛(wèi)生*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

2.河南省中藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046

麻黃為麻黃科（Ephedraceae）麻黃屬EphedraTourn ex Linn.植物草麻黃E.sinicaStapf.、中麻黃E.intermediaSchrenk ex C.A.Mey.以及木賊麻黃E.equisetinaBunge.的干燥草質(zhì)莖[1]，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其藥用歷史悠久。麻黃味辛，微苦，歸肺、膀胱經(jīng)[2]，具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘[3]、利水消腫的功效[4]。同時現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，麻黃具有利尿、鎮(zhèn)咳平喘、興奮神經(jīng)中樞系統(tǒng)、抗腫瘤等豐富的藥理活性[5-9]。目前，經(jīng)過文獻查閱發(fā)現(xiàn)，已從三種麻黃中分離得到了300 余種化合物，主要包括生物堿類、多糖類、揮發(fā)油、簡單苯丙素類、有機酸類、鞣質(zhì)類以及木脂素類化合物等[10-15]，且表現(xiàn)出較好的藥理活性，如Zhu 等[7]從木賊麻黃中分離得到的木脂素類化合物具有抗哮喘活性；He 等[16]從草麻黃中分離得到的單萜類化合物具有抗炎活性；Jia 等[17]從木賊麻黃中發(fā)現(xiàn)了一種具有減輕卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的過敏性哮喘的酰胺類生物等。為了進一步豐富中麻黃的化學(xué)成分和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組對中麻黃50%丙酮提取物進行化學(xué)成分研究，從中分離得到21 個化合物，包括2 個首次確定絕對構(gòu)型的新天然產(chǎn)物：3-羥基-5-(4'-羥基苯基)戊酸乙酯[3-hydroxy-5-(4'-hydroxyphenyl) ethyl valerate，1]、3- 羥 基 -5-(4'- 羥 基 苯 基 ) 戊 酸 甲 酯[3-hydroxy-5-(4'-hydroxyphenyl) methyl valerate，2]；19 個酚酸類化合物：兒茶酚（catechol，3）、苯甲酸（benzoic acid，4）、5-(4-羥基苯基)-2-戊烯酸[5-(4-hydroxyphenyl)-2-pentenoic acid，5]、(＋)-rhododendrol（6）、frambinone（7）、香草乙酮（acetovanillone，8）、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸甲酯（methyl-4-hydroxy-3-methoxybenzoate，9）、3,4-二羥基苯乙醇（3,4-dihydroxyphenylethanol，10）、姜酮（zingerone，11）、原兒茶酸（protocatechuate，12）、3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲酸（3,5-dihydroxy-4-methoxy-benzoic acid，13）、丁香酸（syringic acid，14）、3-hydroxy-4-methoxy-benzene carboxylic acid（15）、香草酸（vanillic acid，16）、丁香酸甲酯（methyl syringate，17）、4-羥基-3-甲氧基苯丙酮（4-hydroxy-3-methoxypropiophenone，18）、去甲丁香色原酮（noreugenin，19）、(S)-5-(3,4-dihydroxyphenyl)-γvalerolactone（20）、2-guaiacylpropane-1,3-diol（21），并且初步評價了所得化合物的體外抗哮喘活性。

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III 500 型核磁共振儀（德國布魯克公司）；Bruker maxis HD 型飛行時間質(zhì)譜（德國布魯克公司）；賽譜銳思LC52 型高壓制備液相色譜儀（所選波長為254、210 nm，賽譜銳思北京科技有限公司)；Thermo EVO300 紫外分光光度計（Thermo Scientific，USA）型紫外檢測器、Thermo Nicolet IS10 紅外光譜儀（美國Thermo Scientific）；Autopol IV 全自動旋光儀（美國魯?shù)婪蚬荆籒-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、A-1000S 型水流抽氣機、N-1111 型冷凍水循環(huán)裝置（上海埃朗儀器有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YMC-Pack ODS-A 色譜柱（250 mm×20 mm，5 μm，日本YMC 有限公司）；柱色譜填料Sephadex LH-20（瑞典Amersham Pharmacia Biotech 公司）；Toyopearl HW-40C（日本TOSOH 公司）；ODS（40～60 μm，日本YMC 有限公司）；MCI gel CHP-20、大孔樹脂Diaion HP-20（日本三菱化學(xué)公司）；薄層色譜硅膠GF254、柱色譜硅膠（100～200、200～300目，青島海洋化工廠）；甲醇（色譜純，天津四友精細化學(xué)品有限公司）；乙腈（色譜純，美國天地有限公司）；所用其他分析純試劑均為天津恒興化學(xué)試劑有限公司；Operetta CLS 高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美珀金埃爾默公司）；Multiskan MK3 酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；大鼠嗜堿性細胞白血病細胞株（RBL-2H3）購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；氨芐青霉素、鏈霉素、C48/80、4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖均購自Sigma 公司。

中麻黃購自新疆西域漠草中藥材開發(fā)有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠明教授鑒定為麻黃科植物中麻黃E.intermediaSchrenk et C.A.Mey.的干燥草質(zhì)莖，植物標本（20201111）保存于河南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)提取分離實驗室。

2 方法

2.1 提取與分離

取45.0 kg 中麻黃的干燥草質(zhì)莖，切段，用50%含水丙酮浸泡1 周后，組織破碎提取2 次，減壓濃縮得到總浸膏11.1 kg，加水分散，依次用二氯甲烷（3.5 L×15）、醋酸乙酯（3.5 L×15）、正丁醇（3.5 L×15）萃取后得到二氯甲烷部位（185.0 g）、醋酸乙酯部位（1.37 kg）、正丁醇部位（1.5 kg）和水部位。

二氯甲烷部位（185.0 g）上硅膠柱（100～200目），用石油醚-醋酸乙酯（50∶1、20∶1、10∶1、4∶1、1∶1）以及醋酸乙酯-甲醇（20∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流分得到10個組分（D1～D10）；D5（20.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（150∶1～10∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流分得到9 個組分（D5-1～D5-9），D5-2（5.8 g）繼續(xù)經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），用石油醚-醋酸乙酯（170∶1～20∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到6 個組分（D5-2-1～D5-2-6），其中D5-2-5 上Sephadex LH-20 凝膠柱（甲醇-水70∶30）以及半制備高效液相色譜（乙腈-水30∶70）分離純化得到化合物18（tR＝40.1 min，2.65 mg）；D5-4（5.58 g）上Toyopearl HW-40C 凝膠柱，以甲醇-水（70∶30）等度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到5 個組分（D5-4-1～D5-4-5），其中D5-4-3 經(jīng)硅膠柱色譜（300～400 目）以及半制備高效液相色譜（乙腈-水30∶70）分離純化得到化合物4（tR＝22.4 min，4.8 mg）和9（tR＝26.5 min，1.6 mg）。D6（11.8 g）經(jīng)ODS 反相色譜柱分離，以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，得到5 個組分（D6-1～D6-5），D6-2（2.0 g）上Sephadex LH-20 凝膠柱，純甲醇等度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到 4 個組分（D6-2-1 ～D6-2-4），其中D6-2-2 經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（300∶1～20∶1）梯度洗脫后再經(jīng)半制備高效液相色譜分離純化得到化合物7（乙腈-水27∶73，tR＝25.0 min，5.4 mg）、8（甲醇-水38∶62，tR＝28.6 min，12.4 mg）和11（乙腈-水30∶70，tR＝24.5 min，6.7 mg）；D6-3（2.5 g）上Toyopearl HW-40C 凝膠柱，以甲醇-水（70∶30）等度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到5 個組分（D6-3-1～D6-3-5），其中D6-3-3 經(jīng)硅膠柱色譜（200-300 目）后再經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水55∶45）分離純化得到化合物19（tR＝30.1 min，5.0 mg）。D7（17.2 g）經(jīng)ODS 反相色譜柱分離，以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，薄層檢識后得到10 個組分（D7-1～D7-10），D7-2（2.6 g）經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（350∶1～20∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到5 個組分（D7-2-1～D7-2-5），其中D7-2-3 又經(jīng)過硅膠柱色譜（200～300 目）后再經(jīng)半制備高效液相色譜（乙腈-水30∶70）分離純化得到化合物17（tR＝22.7 min，11.4 mg）；D7-3（1.7 g）上MCI gel CHP-20 柱，以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到5 個組分（D7-3-1～D7-3-5），D7-3-2 經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（250∶1～10∶1）梯度洗脫，薄層檢識后得到4 個組分（D7-3-2-1～D7-3-2-4），其中D7-3-2-1 和D7-3-2-4 分別經(jīng)半制備高效液相色譜分離純化得到化合物14（乙腈-水15∶1，tR＝26.5 min，5.2 mg）、16（乙腈-水15∶1，tR＝20.4 min，6.0 mg）及6（甲醇-水43∶1，tR＝19.9 min，14.7 mg）；D7-4（1.6 g）上Toyopearl HW-40C 凝膠柱，以甲醇-水（70∶30）等度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到6 個組分（D7-4-1～D7-4-6），其中D7-4-6 分別經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目）后再經(jīng)半制備高效液相色譜（乙腈-水28∶72）得到化合物3（tR＝21.3 min，2.7 mg）；D7-4-4 反復(fù)經(jīng)半制備高效液相色譜（乙腈-水24∶76）分離純化得到化合物5（tR＝30.9，20.4 mg）和15（tR＝27.2 min，7.8 mg）。

醋酸乙酯部位（1.4 kg）上硅膠柱（100～200目），用二氯甲烷-甲醇（25∶1、12∶1、8∶1）以及醋酸乙酯-甲醇（35∶1、15∶1、5∶1、2∶1、0∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流分得到11 個組分（E1～E11），E-4（24.3 g）上MCI gel CHP-20柱，以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到5 個組分（E4-1～E4-5），其中E4-2 經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（30∶1～5∶1）梯度洗脫，薄層檢識后合并相同流份得到9 個組分（E4-2-1～E4-2-9），E4-2-5和E4-2-6 分別上Sephadex LH-20 凝膠柱，以純甲醇等度洗脫后再經(jīng)半制備高效液相色譜得到化合物13（甲醇-水20∶80，tR＝29.4 min，2.4 mg）、10（乙腈-水7∶93，tR＝27.4 min，3.5 mg）和12（乙腈-水7∶93，tR＝26.2 min，2.2 mg）。E4-2-7 經(jīng)硅膠柱色譜（200～300 目）后采用制備薄層分離純化得到化合物1（二氯甲烷-甲醇10∶1，4.2 g）和化合物2（二氯甲烷-甲醇12∶1，3.6 g）；E4-3 經(jīng)硅膠柱色譜（200-300 目），以二氯甲烷-甲醇（25∶1～5∶1）梯度洗脫，薄層檢識合并相同流分得到4 個組分（E4-3-1～E4-3-4），其中E4-3-1 上Sephadex LH-20凝膠柱，以甲醇等度洗脫后經(jīng)半制備高效液相色譜（甲醇-水28∶72）分離純化得到化合物20（tR＝19.6 min，5.2 mg）和21（tR＝24.8 min，4.2 mg）。

2.2 體外抗哮喘活性篩選

2.2.1 主要試劑的配制

（1）C48/80 配制：將C48/80 從?20 ℃冰箱拿出室溫放置0.5 h，于超凈工作臺中用PBS 溶解，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的溶液，封口貼標簽保存于4 ℃冰箱中備用。

（2）1% Trinton X-100 配制：于超凈工作臺中，取100 μL Triton X-100，加入9.9 mL 臺式液溶解，配成1% Trinton X-100，現(xiàn)用現(xiàn)配。

（3）β-氨基己糖苷酶底物溶液：4-硝基苯基-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖用1 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH4.5）配制成1 mmol/L 的底物溶液。

（4）1 mol/L NaOH 溶液配制：稱取4.00 g NaOH顆粒，用100 mL 雙蒸水溶解，用于調(diào)溶液的pH 值。

（5）Na2CO3/NaHCO3終止液配制：稱取2.65 g Na2CO3和2.1 g NaHCO3，250 mL 雙蒸水溶解，用1 mol/L NaOH 將溶液調(diào)至pH 10.7。

2.2.2 活性篩選方法 結(jié)合參考文獻方法[18]，RBL-2H3 細胞置于含有15% FBS 的EMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞布皿80%時傳代，每2 天傳代1 次培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照細胞密度為3×104個/mL 接種于96 孔板中，24 h 后分為對照組（空白培養(yǎng)基）、模型組（30 μg/mL C48/80）、各給藥組（10 μmol/L 待測化合物＋30 μg/mL C48/80）以及總酶組（1% Trinton X-100）。藥物及C48/80溶液均用臺式液配制，另外設(shè)3～5 個空白孔（不含細胞，單加臺式液）。刺激30 min 后，取50 μL 細胞上清，加入50 μL 1 mmol/L 的β-氨基己糖苷酶底物溶液，37 ℃孵育1 h，加入150 μL Na2CO3/NaHCO3終止液終止反應(yīng)，酶標儀405 nm 下檢測吸光度（A）值，計算β-氨基己糖苷酶（β-Hex）釋放率。

β-Hex 釋放率＝(A實驗－A空白)/(A總酶－A空白)

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色晶體（甲醇），易溶于甲醇。[α]20D?16.761 (c0.017，CH3OH)，經(jīng)HR-ESI-MS 測定得到準分子離子峰 [M＋H]+m/z: 239.128 3（C13H19O4計算值為 239.127 8），提示該化合物分子式為C13H18O4。、1 717（酯羰基）、1 516（芳環(huán)）、1 205（烷基）、1 034（烷基）等信號。

在1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 譜中，芳香區(qū)，δH7.00 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2', 6'), 6.68 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3', 5') 提示存在1 個典型的AA'BB'取代苯環(huán)系統(tǒng)，δH3.97 (1H, m, H-3), 4.12 (2H, m, H-6) 其位于較低場，推測可能連有吸電子基團，結(jié)合HSQC譜，可知H-3 與H-6 分別與δC68.7 (C-3)、61.5 (C-6)直接相連，分別為1 個連氧次甲基和連氧亞甲基。在13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 譜中，共有13 個碳信號，結(jié)合DEPT 135 譜以及HSQC 譜可知，δC173.6 (C-1) 為1 個酯基碳信號，芳香區(qū)，δC156.4(C-4'), 134.0 (C-1'), 130.3 (C-2', 6'), 116.1 (C-3', 5')為苯環(huán)上的碳信號，δC68.7 (C-3) 為1 個連氧次甲基碳信號，根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)可知，連氧基團為-OH，δC61.5 (C-6), 43.5 (C-2), 40.3 (C-4), 32.0 (C-5) 為4個亞甲基碳信號，δC: 14.5 (C-7) 為1 個甲基碳信號；結(jié)合1H-1H COSY 譜（圖1）可知，H-4 與H-3/5、H-3 與H-2/4 具有相關(guān)關(guān)系，H-6 與H-7 具有相關(guān)關(guān)系，即H-2/3/4/5 為1 個自旋偶合體系，H-6/7 為1個自旋偶合體系；在HMBC 譜中，H-5 與C-1'具有遠程相關(guān)關(guān)系，證明C-5 與苯環(huán)的C-1'相連，同時，H-6 與C-1 具有遠程相關(guān)關(guān)系，結(jié)合H-6 的化學(xué)位移可推測，H-6 通過氧原子與C-1 相連?；谝陨戏治?，可確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)，經(jīng)Scifinder 檢索為1 個新天然產(chǎn)物，同時該化合物C-3 位的絕對構(gòu)型通過對比實測ECD 和計算ECD 曲線可確定為3S（圖2），為首次確定該化合物的絕對構(gòu)型。該化合物的結(jié)構(gòu)見圖1，命名為 (3S)-3-羥基-5- (4'-羥基苯基) 戊酸乙酯。其碳氫數(shù)據(jù)歸屬見表1。

表1 化合物1 和2 的1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 和13C-NMR (125 MHz, CD3OD)Table 1 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) and 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) data of compounds 1 and 2

圖1 化合物1 和2 的結(jié)構(gòu)以及關(guān)鍵1H-1H COSY 和HMBC相關(guān)關(guān)系Fig.1 Structure and key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compounds 1 and 2

圖2 化合物1 和2 的實測和計算ECD 圖譜Fig.2 Experimental and calculated ECD spectra of compounds 1 and 2

化合物2：黃色油狀物，易溶于甲醇。[α]20D?15.549 (c0.167，CH3OH)，經(jīng)HR-ESI-MS 測定得到準分子離子峰 [M＋H]+m/z: 225.112 6 （C12H17O4計算值為225.112 1），提示該化合物分子式為C12H16O4。、1 450（芳環(huán)）、1 029（烷基）等信號。

在1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 譜中，芳香區(qū)，δH7.00 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2', 6'), 6.68 (2H, d,J=8.4 Hz, H-3', 5') 提示存在1 個典型的AA'BB'苯環(huán)取代系統(tǒng)，δH3.97 (1H, m, H-3) 位于較低場，推測其可能連有1 個吸電子基團，結(jié)合HSQC 以及DPT 135 譜可知，H-3 與δC68.7 (C-3) 直接相連，為1個連氧次甲基氫信號，在高場區(qū)，結(jié)合HSQC 以及DPT 135 譜可知，δH2.49 (1H, dd,J= 15.1, 4.5 Hz,H-2a), 2.41 (1H, dd,J= 15.1, 8.5 Hz, H-2b), 2.66(1H, m, H-5a), 2.55 (1H, m, H-5b) 以及1.70 (2H, m,H-4)分別與δC43.3 (C-2), 32.0 (C-5), 40.3 (C-4) 直接相連且為3 個亞甲基，由1H-1H COSY 圖譜可知，H-4 與H-3/5 具有相關(guān)關(guān)系，H-3 與H-2/4 具有相關(guān)關(guān)系，因此，H-2/3/4/5 為1 個自旋偶合體系，δH: 3.65(3H, s, 6-OCH3) 處于較低場，為1 個甲氧基氫信號。

在13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 譜中，共給出12 個碳信號，在低場區(qū)，存在1 個羰基碳信號δC174.0 (C-1)，芳香區(qū)δC156.4 (C-4'), 134.0 (C-1'),130.3 (C-2', 6'), 116.1 (C-3', 5') 為苯環(huán)上的碳信號，結(jié)合HSQC 譜可知，δH3.97 (H-3) 與δC68.7 (C-3)具有相關(guān)關(guān)系，且結(jié)合DPT 135 譜可知，δC68.7(C-3) 為1 個次甲基碳信號，δC43.3 (C-2), 40.3(C-4), 32.0 (C-5) 為3 個亞甲基碳信號，δC52.0(6-OCH3) 為1 個甲氧基碳信號；在HMBC 圖譜中，H-5 與C-1'具有遠程相關(guān)關(guān)系，可推測C-5 直接與連在苯環(huán)的C-1'位，δH3.65 (3H, s, 6-OCH3) 與C-1具有遠程相關(guān)關(guān)系，可推測甲氧基與C-1 相連，基于以上分析，可確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)，經(jīng)Scifinder 檢索為1 個新天然產(chǎn)物，其C-3 位的絕對構(gòu)型通過對比實測ECD 和化合物2 的計算ECD 曲線（圖2）可確定該化合物的絕對構(gòu)型為3S，為首次確定該化合物的絕對構(gòu)型。綜上，該化合物的結(jié)構(gòu)如圖1 所示，命名為 (3S)-3-羥基-5-(4'-羥基苯基)戊酸甲酯。其碳氫數(shù)據(jù)歸屬見表1。

化合物3：白色針狀結(jié)晶（甲醇），易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 111 [M＋H]+，提示分子式為C6H6O2。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.86 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-4,5), 6.80 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3, 6)；13C-NMR(125 MHz, CD3OD)δ: 163.1 (C-1, 2), 132.9 (C-4, 5),115.9 (C-3, 6)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[19]，確定化合物3 為兒茶酚。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z:123 [M＋H]+，提示分子式為C7H6O2。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 8.01 (2H, d,J= 7.7 Hz, H-2, 6),7.55 (1H, t,J= 7.1 Hz, H-4), 7.43 (2H, t,J= 7.7 Hz,H-3, 5)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 169.9 (C-7),134.0 (C-4), 131.8 (C-2, 6), 130.7 (C-3, 5), 129.4(C-1)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[20]，確定化合物4 為苯甲酸。

化合物5：淺黃色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 215 [M＋Na]+，提示分子式為C11H12O3。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.00 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-2', 6'), 6.69 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 6.95 (1H,dt,J= 15.5, 7.0 Hz, H-3), 6.95 (1H, d,J= 15.5 Hz,H-2), 2.66 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-5), 2.46 (2H, m,H-4)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 170.1 (C-1),156.6 (C-4'), 133.1 (C-1'), 130.3 (C-2', 6'), 116.2(C-3', 5'), 150.4 (C-3), 122.9 (C-2), 35.4 (C-4), 34.6(C-5)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[21]，確定化合物5 為5-(4-hydroxyphenyl) 2-pentenoic acid。

化合物6：白色無定型粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 189 [M＋H]+，提示分子式為C10H14O2。1H- NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.99 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-2', 6'), 6.77 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 3.70(1H, m, H-2), 2.56 (2H, m, H-4), 1.65 (2H, m, H-3),1.16 (3H, d,J= 7.2 Hz, H-1)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 156.3 (C-4'), 134.4 (C-1'), 130.2 (C-2', 6'),116.1 (C-3', 5'), 67.9 (C-2), 42.4 (C-3), 32.2 (C-4),23.5 (C-1)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[22]，確定化合物6 為 (＋)-rhododendrol。

化合物7：無色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 164 [M]+，提示分子式為C10H12O2。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 7.04 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2',6'), 6.75 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3', 5'), 2.83 (2H, t,J=7.4 Hz, H-3), 2.73 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-4), 2.14 (3H,s, H-1)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 208.7 (C-2),154.0 (C-4'), 132.9 (C-1'), 129.4 (C-2', 6'), 115.3 (C-3',5'), 45.4 (C-3), 28.9 (C-4), 30.1 (C-1)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[23]，確定化合物7 為覆盆子酮。

化合物8：淺黃色油狀物，易溶于甲醇，EI-MSm/z166 [M]+，提示分子式為C9H10O3。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.55 (1H, dd,J= 8.2, 2.0 Hz, H-6'),7.51 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2'), 6.84 (1H, d,J= 8.2 Hz,H-5'), 3.89 (3H, 3'-OCH3), 2.52 (3H, s, H-2)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 199.4 (C-1), 153.4(C-4'), 149.0 (C-3'), 130.6 (C-1'), 125.2 (C-6'), 115.8(C-5'), 111.9 (C-2'), 26.2 (C-2), 56.4 (5'-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[24]，確定化合物8 為香草乙酮。

化合物9：淺黃色油狀物，易溶于甲醇，EI-MSm/z183 [M＋H]+，提示分子式為C9H10O4。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 7.54 (1H, dd,J= 8.8, 2.0 Hz,H-8), 7.53 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-4), 6.83 (1H, d,J=8.8 Hz, H-7), 3.89 (3H, s, 1-OCH3), 3.88 (3H, s,5-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 168.7(C-2), 152.9 (C-6), 148.8 (C-5), 125.0 (C-3), 122.5(C-8), 115.9 (C-4), 113.6 (C-7), 56.4 (5-OCH3), 52.3(1-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[25]，確定化合物9 為methyl-4-hydroxy-3-methoxybenzoate。

化合物10：無定型粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z177 [M＋Na]+，提示分子式為C8H10O3。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 6.66 (2H, m, H-2, 6), 6.52 (1H,d,J= 8.0 Hz, H-5), 3.66 (1H, t,J= 7.2 Hz, H-8), 2.65(1H, t,J= 7.2 Hz, H-7)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD), 146.2 (C-3), 144.6 (C-4), 131.8 (C-1), 121.2(C-6), 117.1 (C-5), 116.3 (C-2), 64.6 (C-8), 39.7(C-7)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[26]，確定化合物10 為3,4-二羥基苯乙醇。

化合物11：棕色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 195 [M＋H]+，提示分子式為C11H14O3。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 6.76 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6),6.68 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-9), 6.60 (1H, dd,J= 8.0,2.0 Hz, H-10), 2.75 (4H, s, H-3, 4), 2.11 (3H, s, H-1),3.81 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 211.4 (C-2), 148.9 (C-7), 145.8 (C-8), 134.0 (C-5),121.7 (C-10), 116.1 (C-9), 113.1 (C-6), 46.2 (C-4),30.5 (C-3), 30.0 (C-1), 56.3 (7-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[27]，確定化合物11 為姜酮。

化合物12：無色針晶（甲醇），易溶于甲醇，ESI-MSm/z153 [M－H]?，提示分子式為C7H6O4。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.42 (1H, brs, H-6),7.40 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.78 (1H, d,J= 8.0 Hz,H-5)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 170.3 (C-7),151.5 (C-4), 146.1 (C-3), 123.9 (C-1), 123.2 (C-6),117.7 (C-2), 115.7 (C-5)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[28]，確定化合物12 為原兒茶酸。

化合物13：白色不定型粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 183 [M－H]?，提示分子式為C8H8O5。1H- NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.03 (2H, brs, H-2,6), 3.85 (3H, s, 4-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 169.9 (C-7), 151.6 (C-3, 5), 141.0 (C-4),127.2 (C-1), 110.4 (C-2, 6), 60.7 (4-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[29]，確定化合物13 為3,5-二羥基-4-甲氧基苯甲酸。

化合物14：無色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 199 [M＋H]+，提示分子式為C9H10O5。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 7.32 (2H, brs, H-2, 6), 3.87(6H, s, 3, 5-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ:170.0 (C-7), 148.8 (C-3, 5), 141.7 (C-4), 122.0 (C-1),108.3 (C-2, 6), 56.8 (3, 5-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[30]，確定化合物14 為丁香酸。

化合物15：無色針晶（甲醇），易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 169 [M＋H]+，提示分子式為C8H8O4。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.53 (1H, dd,J= 8.4,2.2 Hz, H-5), 7.43 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2), 6.97 (1H,d,J= 8.4 Hz, H-6), 3.90 (3H, s, 4-OCH3)；13C-NMR(125 MHz, CD3OD)δ: 170.0 (C-7), 153.3 (C-4), 147.3(C-3), 124.4 (C-1), 123.7 (C-6), 117.3 (C-2), 111.7 (C-5),56.4 (4-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[31]，確定化合物15為3-hydroxy-4-methoxy-benzene carboxylic acid。

化合物16：無色針晶（甲醇），易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 169 [M＋H]+，提示分子式為C8H8O4。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.55 (1H, d,J= 1.8 Hz, H-2), 7.54 (1H, dd,J= 8.6, 1.8 Hz, H-6), 6.83(1H, d,J= 8.6 Hz, H-5), 3.89 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 170.1 (C-7), 152.7(C-3), 148.7 (C-4), 125.3 (C-6), 123.1 (C-1), 115.8(C-5), 113.8 (C-2), 56.4 (3-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[32]，確定化合物16 為香草酸。

化合物17：白色無定形粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 235 [M ＋Na]+，提示分子式為C10H12O5。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.29 (2H,brs, H-2, 6), 3.87 (6H, s, 3, 5-OCH3), 3.86 (3H, s,8-OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 168.6(C-7), 148.9 (C-3, 5), 141.9 (C-4), 121.3 (C-1), 108.1(C-2, 6), 56.8 (3, 5-OCH3), 52.5 (8-OCH3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[33]，確定化合物17 為丁香酸甲酯。

化合物18：淡黃色粉末，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 181.0 [M＋H]+，提示分子式為C10H12O3。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 7.53 (1H, dd,J= 8.3, 2.0 Hz, H-6), 7.50 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.83 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5), 2.95 (2H, q,J= 7.3 Hz, H-8), 1.14(3H, t,J= 7.3 Hz, H-9), 3.88 (3H, s, 3-OCH3)；13CNMR (125 MHz, CD3OD)δ: 202.0 (C-7), 153.1 (C-4),149.0 (C-3), 130.2 (C-1), 124.4 (C-6), 115.8 (C-2),111.8 (C-5), 32.1 (C-8), 9.0 (C-9), 56.3 (C-3)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[34]，確定化合物18 為4-羥基-3-甲氧基苯丙酮。

化合物19：淡黃色固體，易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 191 [M－H]?，提示分子式為C10H8O4。1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 6.20 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-2),6.17 (1H, s, H-5), 6.04 (1H, s, H-7), 2.35 (3H, s,H-10)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 184.0 (C-1),169.3 (C-6), 165.9 (C-7), 163.3 (C-8), 159.9 (C-4),105.1 (C-9), 100.1 (C-8), 94.9 (C-5), 166.0 (C-3),108.9 (C-2), 20.2 (C-10)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[35]，確定化合物19 為去甲丁香色原酮。

化合物20：白色晶體（甲醇），易溶于甲醇，ESI-MSm/z: 208 [M]+，提示分子式為C11H12O4。1HNMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.68 (2H, overlapped,H-11, 12), 6.55 (1H, dd,J= 8.0, 2.0 Hz, H-8), 4.71(1H, m, H-5), 2.86 (1H, dd,J= 14.0, 6.0 Hz, H-3a),2.78 (1H, dd,J= 14.0, 7.9 Hz, H-3b), 2.47 (1H, m,H-4a), 2.32 (1H, m, H-4b), 2.22 (1H, m, H-6a), 1.94(1H, m, H-6b)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ:180.3 (C-2), 146.3 (C-10), 145.2 (C-9), 129.1 (C-7),121.9 (C-8), 117.7 (C-11), 116.4 (C-12), 83.3 (C-5),41.5 (C-3), 29.3 (C-4), 27.9 (C-6)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[36]，確定化合物 20 為 5-(3,4-dihydroxyphenyl)-γ-valerolactone。

化合物21：無色油狀物，易溶于甲醇，ESI-MSm/z281 [M＋Na]+，提示分子式為 C10H14O4。1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 6.63 (2H, s, H-2, 6),4.07 (1H, d,J= 6.3 Hz, H-7), 3.72 (1H, td,J= 6.4, 3.9 Hz, H-8), 3.63 (1H, dd,J= 11.3, 3.9 Hz, H-9a), 3.55(1H, dd,J= 11.3, 6.5 Hz, H-9b), 3.84 (6H, s, 3,5-OCH3), 3.21 (3H, s, 7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 149.2 (C-3, 5), 136.4 (C-4), 130.6 (C-1),106.2 (C-2, 6), 85.9 (C-7), 76.2 (C-8), 64.3 (C-9)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)并參考文獻報道[37]，確定化合物21 為2-guaiacylpropane-1,3-diol。

3.2 體外抗哮喘活性篩選結(jié)果

采用底物顯色法檢測中麻黃中所得單體化合物對C48/80 誘導(dǎo)RBL-2H3 細胞釋放β-Hex 的影響。結(jié)果如表2 所示，與對照組相比，30 μg/mL C48/80溶液處理細胞30 min 后，β-Hex 釋放率明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，化合物5、18、19 可顯著抑制β-Hex 的釋放（P＜0.05、0.01），化合物4、6、8、11、20、21 可輕微抑制β-Hex 的釋放。

表2 化合物對C48/80 誘導(dǎo)RBL-2H3 細胞釋放β-Hex 的影響 (± s, n = 4)Table 2 Effects of compounds on release of β-Hex in RBL-2H3 induced by C48/80 (± s, n = 4)

表2 化合物對C48/80 誘導(dǎo)RBL-2H3 細胞釋放β-Hex 的影響 (± s, n = 4)Table 2 Effects of compounds on release of β-Hex in RBL-2H3 induced by C48/80 (± s, n = 4)

組別 劑量/(μmol·L?1) β-Hex 釋放率/%對照 0.60±0.22模型 1.00±0.06**1 10 0.93±0.12 3 10 1.15±0.06 4 10 0.89±0.10 5 10 0.74±0.05##6 10 0.80±0.06 7 10 0.96±0.16 8 10 0.86±0.08 11 10 0.85±0.06 12 10 0.89±0.07 13 10 0.91±0.09 14 10 1.07±0.09 15 10 1.06±0.18 16 10 1.07±0.10 17 10 0.92±0.02 18 10 0.69±0.06#19 10 0.70±0.12#20 10 0.84±0.09 21 10 0.80±0.27

與對照組比較，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05 ##P＜0.01。**P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group.

4 討論

本研究通過對中麻黃50%丙酮提取物進行化學(xué)成分研究，從中分離得到21 個化合物，包括2 個首次確定絕對構(gòu)型的新天然產(chǎn)物以及19 個酚酸類化合物；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，中麻黃具有抗哮喘作用，因此進行了所得單體化合物改善C48/80 誘導(dǎo)RBL-2H3 細胞脫顆?；钚猿煞值暮Y選，結(jié)果顯示，化合物5、19、20 可顯著改善RBL-2H3 脫顆?，F(xiàn)象；化合物4、6、8、11、12、21、22 有改善RBL-2H3脫顆?，F(xiàn)象，但未見顯著性，提示該成分可能通過抑制肥大細胞脫顆粒發(fā)揮抗哮喘作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突