清腎顆粒對(duì)5/6腎切除大鼠腎組織線粒體自噬及腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響*

張葉青，金華，張磊，呼琴，王億平，代明揚(yáng)

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

腎纖維化（renal fibrosis，RF）是各種類型慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）發(fā)展過程中重要的病理生理改變，以正常腎單位丟失、大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)堆積而導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化為特征。腎小管上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal，EMT)已被確認(rèn)為是RF的主要因素[1]。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和上皮表面標(biāo)記物如E-鈣黏蛋白（Ecadherin），轉(zhuǎn)而獲得間充質(zhì)特征如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），最終轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，破壞腎臟結(jié)構(gòu)，逐漸發(fā)展成腎纖維化[2]。線粒體自噬是一種重要線粒體質(zhì)量控制機(jī)制，通過持續(xù)清理衰老和損傷的線粒體，確保線粒體能循環(huán)利用。線粒體自噬主要由PINK1/Parkin通路介導(dǎo)[3]。線粒體自噬與腎小管EMT之間的關(guān)系目前報(bào)道不多，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬活性來減輕腎小管EMT進(jìn)程可能成為中藥抗腎纖維化的重要靶點(diǎn)。本研究將采用5/6腎切除大鼠建立腎臟纖維化動(dòng)物模型，觀察清腎顆粒對(duì)模型大鼠的腎組織線粒體自噬及腎小管EMT的影響，為其抗腎纖維化提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，2月齡，體重（200±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，均購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2022-0005。本研究通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核（倫理批號(hào)AHUCM-rats-2022071）。

2 用藥

清腎顆粒：由安徽省中醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，皖藥制字BZ20080011，批號(hào)20210215，規(guī)格10g/袋（約含生藥34g），由茵陳、丹參、生大黃、白花蛇舌草、白術(shù)、薏苡仁、澤瀉、黃連、車前草組成。

3 試劑

Wes tern一抗二抗去除液（Beyotime，批號(hào)0514-18180626）；PVDF膜（Millipore，批號(hào)R7SA9081E）；ECL超敏發(fā)光試劑盒（Thermo，批號(hào)VC298015）；山羊抗小鼠IgG（Zsbio，批號(hào)140193）；山羊抗兔IgG（Zsbio，批號(hào)202700514）；GAPDH（Zsbio，批號(hào)210040421）；Pink1（Bioss）；Parkin（Santa Cruz， 批號(hào)K1120）；LC3B（CST，批號(hào)13）；α-SMA（bioss，批號(hào)AG03286338）。

4 儀器

離心機(jī)（上海和欣科教設(shè)備有限公司）；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）；自動(dòng)曝光儀（上海培清科技有限公司）；熒光顯微鏡（日本Motic BA410E）；激光共聚焦成像分析系統(tǒng)（美國(guó)PerkinElmer公司）；透射電子顯微鏡（日本電子JEM-1400 Flash）。

5 方法

5.1 大鼠模型建立及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，2月齡，體重（200±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、清腎顆粒組，每組各10只。除假手術(shù)組外，其余20只大鼠均制作5/6腎切除模型。采用腹腔注射以2%的戊巴比妥（0.2mL/100g）對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，從距左脊肋骨1.5cm處斜向外方切口，暴露左腎，分離腎周圍脂肪囊后，弧行切除腎上、下極各1/3，明膠海綿壓迫止血1min，復(fù)位腎臟，縫合。1周后切除整個(gè)右腎。共切除5/6腎臟。假手術(shù)組只進(jìn)行左右腎包膜剝離，保留腎臟及腎上腺。各組術(shù)后予青霉素預(yù)防感染。

5.2 大鼠給藥方法、標(biāo)本采集 各組均在造模后第1天開始灌胃，清腎顆粒組給予清腎顆粒水溶液按8.0g/kg·d灌胃，1次/d，每次3mL。假手術(shù)組、模型組大鼠用等量蒸餾水（3mL）灌胃。連續(xù)給藥8周。無菌采取腹主動(dòng)脈血，代謝籠留取24h尿液并記錄尿量，留取左側(cè)腎臟。將部分腎臟放入液氮罐速凍后置于-80℃冰箱中保存，用于提取蛋白；部分腎臟用生理鹽水沖洗干凈后置于冰上，OTC包埋后制作冰凍切片，用于免疫熒光檢測(cè)；部分腎臟置于10%福爾馬林液中固定，制作石蠟切片，用于光鏡觀察；部分腎臟制作超薄切片，用于透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)。

5.3 檢測(cè)指標(biāo)

5.3.1 ELISA法檢測(cè)血肌酐（Serum creatinine， Scr）、尿肌酐（Urine creatinine， Ucr）濃度 按ELISA試劑盒說明書操作，并根據(jù)Scr、Ucr濃度及24h尿量計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate， Ccr），按體重進(jìn)行校正。校正后Ccr= Ucr濃度（μmol/L）×24h尿量（mL）/（Scr濃度（μmol/L）×1440min）/體重（kg）。

5.3.2 Western blot法檢測(cè)腎組織中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達(dá) 腎臟50mg加入1ml組織裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制劑制備組織勻漿，提取總蛋白并測(cè)量蛋白濃度。分離總蛋白，電泳并轉(zhuǎn)膜。封閉2h，TBST洗膜，加入一抗孵育，4℃過夜。第2天洗膜后，將膜與適當(dāng)?shù)亩故覝剌p搖孵育1h后洗膜。使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測(cè)蛋白。使用Image J軟件以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值做統(tǒng)計(jì)分析。

5.3.3 免疫熒光法檢測(cè)腎組織中LC3-Ⅱ和線粒體膜蛋白VDAC1共定位表達(dá) 腎組織OTC包埋后制5μm冰凍切片，冰丙酮室溫固定5min后，先用PBS（0.01mol/L）清洗3次（每次10min），再用正常山羊血清封閉30min（37℃），傾去勿洗；然后滴加一抗（VDAC1）孵育（4℃，過夜），次日拿出濕盒，棄一抗，PBS清洗3次（每次3min），然后滴加熒光標(biāo)記的二抗，室溫下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴加一抗（LC3Ⅱ），37℃溫箱中孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴二抗，室溫下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后用DAPI染色大約2min，再用PBS充分淋洗1次，3min；激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

5.3.4 HE和Masson染色光鏡觀察大鼠腎臟病理改變 腎臟組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、包埋，制成厚度2μm的組織切片，行HE、Masson染色。

5.3.5 透射電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的超微結(jié)構(gòu) 腎臟組織用3%戊二醛固定、PBS漂洗、1%鋨酸后固定1h，再經(jīng)過酒精、丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂618包埋，甲苯胺藍(lán)染色后定位、切片，制成厚度約50～70nm的超薄切片，最后經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色后，利用透射電鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞線粒體的形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示。資料符合正態(tài)性且方差齊用t檢驗(yàn)及單因素分析法分析比較；若資料不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為差異有非常顯著意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠Scr、Ccr比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的Scr濃度顯著升高，而Ccr顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒組大鼠的Scr濃度顯著降低，而Ccr顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。假手術(shù)組1033.42±5.395.36±1.54模型組7124.96±14.971.42±0.60清腎顆粒組877.90±10.692.27±0.64

表1 各組大鼠Scr、Ccr比較（±s）

表1 各組大鼠Scr、Ccr比較（±s）

分組只數(shù)Scr/μmol·L-1Ccr/ml·min-1·kg-1

2 各組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表達(dá)量均顯著下降，腎小管EMT標(biāo)志蛋白α-SMA顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒組大鼠的Pink1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量顯著升高，α-SMA表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Parkin亦有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2，圖1。

圖1 各組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、α-SMA蛋白表達(dá)比較（Western blot）

表2 各組大鼠腎組織中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠腎組織中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表達(dá)比較（±s）

分組例數(shù)Pink1ParkinLC3-Ⅱα-SMA假手術(shù)組101.86±0.232.18±0.132.11±0.331.39±0.40模型組71.41±0.221.66±0.371.10±0.202.47±0.24清腎顆粒組81.66±0.101.85±0.501.48±0.161.91±0.30

3 各組大鼠測(cè)腎組織中LC3-Ⅱ和線粒體膜蛋白VDAC1共定位表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠（5/6腎切除）腎小管上皮細(xì)胞中線粒體標(biāo)記物VDAC1和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ的共定位表達(dá)顯著升高；與模型組比較，清腎顆粒組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中VDAC1和LC3-Ⅱ共定位表達(dá)進(jìn)一步顯著升高。見圖2。

圖2 免疫熒光法檢測(cè)腎小管LC3Ⅱ和VDAC1共定位表達(dá)情況（×200）

4 各組大鼠腎臟病理改變

HE和Masson染色后，光鏡觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組大鼠的腎小球未見萎縮，腎小管管腔大而規(guī)則，呈疊瓦狀分布，腎間質(zhì)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠可見腎間質(zhì)區(qū)域大量纖維化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化區(qū)域呈藍(lán)染膠原纖維分布；部分腎小球硬化，腎小管管腔擴(kuò)張及上皮細(xì)胞空泡變性，甚至萎縮、壞死及脫落。清腎顆粒組大鼠腎臟病理?yè)p害明顯減輕，纖維化程度逐漸減輕，藍(lán)染膠原纖維及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。見圖3。

圖3 各組大鼠腎臟組織光鏡觀察（HE和Masson染色）

5 各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡觀察顯示：假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體排列整齊、完整，線粒體脊清晰、連續(xù)。模型組大鼠（5/6腎切除）腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體損傷明顯，細(xì)胞核凋亡，組織壞死，大量成纖維細(xì)胞生成（紅色箭頭）；線粒體脊斷裂、腫脹、空泡樣變（紅色方框內(nèi)）。清腎顆粒組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體損傷較模型組減輕（紅色方框內(nèi)）；可見自噬線粒體（黃色箭頭）。見圖4。

圖4 透射電鏡檢測(cè)各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中線粒體的超微結(jié)構(gòu)

討 論

CKD主要病理改變?yōu)槟I臟纖維化，而腎小管EMT是引起腎間質(zhì)纖維化（RIF）的關(guān)鍵事件，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物（如α-SMA）表達(dá)增多等[4]。線粒體自噬在纖維化疾病中起關(guān)鍵作用，其通過減少線粒體釋放活性氧、促凋亡物質(zhì)，緩解炎癥和氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗纖維化的作用[5]。腎小管上皮細(xì)胞富含線粒體，對(duì)缺血缺氧十分敏感，線粒體自噬介導(dǎo)的線粒體質(zhì)量控制對(duì)于調(diào)節(jié)腎臟中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是極其關(guān)鍵的[6]。線粒體自噬在急性腎損傷和慢性腎臟疾病的進(jìn)展中起著重要作用。研究表明，通過抑制PINK1/Parkin通路負(fù)性調(diào)節(jié)線粒體自噬，能夠加重腎缺血再灌注損傷[7]。通過抑制糖尿病腎病中PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬，能夠加重腎纖維化進(jìn)程[8]。而通過介導(dǎo)線粒體自噬活性增強(qiáng)，能夠抑制ROS和NLRP3炎癥小體激活，進(jìn)而發(fā)揮抗腎纖維化作用[9]。因此，恢復(fù)線粒體自噬平衡作為治療腎間質(zhì)纖維化的藥理學(xué)靶點(diǎn)的可能性，為更有效地抗腎臟纖維化、延緩慢性腎臟病的進(jìn)展提供新思路[10]。

PINK1/Parkin通路是介導(dǎo)線粒體自噬的主要信號(hào)通路，有研究發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬是清除受損線粒體的主要通路，上調(diào)該通路可激活線粒體自噬，對(duì)保護(hù)腎功能，對(duì)改善由缺血、缺氧引起的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡有重要作用[11-12]。PINK1和Parkin位于同一條信號(hào)通路上，且PINK1是使得parkin轉(zhuǎn)位至受損線粒體上募集的關(guān)鍵蛋白[13]。當(dāng)線粒體受到破壞時(shí)，PINK1會(huì)堆積在線粒體外膜上并完成自我激活，將胞漿里的Parkin蛋白分子募集到受損傷的線粒體中，此時(shí)，PINK1和Parkin通過泛素磷酸化激活了線粒體自噬機(jī)制，隨后蓄積P62蛋白，P62與LC3-Ⅱ結(jié)合并相互作用，促使線粒體自噬體的形成[14-15]。同時(shí)，在自噬起始時(shí)Beclin1通過PI3k和Atg14形成三聚體，并不斷招募自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)線粒體自噬[16-17]。最后，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)型LC3（即LC3-Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ蛋白能促使線粒體自噬體與溶酶體融合，形成成熟的線粒體自噬溶酶體，啟動(dòng)受損線粒體的降解程序[18]。因此LC3-Ⅱ在自噬體形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可反映自噬活動(dòng)，是研究自噬活動(dòng)的特異性指標(biāo)。5/6腎切除大鼠是經(jīng)典的腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除大鼠除表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化之外，還可見部分腎小球硬化、腎小管萎縮；模型組大鼠的Scr濃度顯著升高，而Ccr顯著降低，提示腎功能損害嚴(yán)重。研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，在模型組大鼠腎組織中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表達(dá)顯著降低，α-SMA表達(dá)顯著升高；模型組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞中線粒體標(biāo)記物VDAC1和自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ的共定位表達(dá)顯著升高；透射電鏡也顯示模型組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞中的線粒體損傷明顯，細(xì)胞核凋亡，組織壞死，大量成纖維細(xì)胞生成。上述研究結(jié)果提示在腎小管轉(zhuǎn)分化進(jìn)程中，腎小管上皮細(xì)胞中線粒體發(fā)生損傷，Pink1/Parkin通路活性及其介導(dǎo)的線粒體自噬活性是下降的。

針對(duì)慢性腎臟病“濕熱傷腎、濕熱與瘀交結(jié)”的病機(jī)，本研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出具有清熱化濕祛瘀功效的中藥清腎顆粒并成功應(yīng)用于臨床治療CKD，取得良好臨床療效。多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)清腎顆粒能夠有效改善CKD濕熱證患者的臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延緩腎衰竭進(jìn)展；有效改善腎性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良、鈣磷代謝紊亂、胃腸功能紊亂等CKD并發(fā)癥；且安全性良好[19]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，清腎顆粒治療慢性腎臟病患者和抗腎纖維化機(jī)制中具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑作用特點(diǎn)[20-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，清腎顆粒能夠改善5/6腎切除大鼠的Ccr，并能夠增強(qiáng)Pink1/Parkin介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中線粒體自噬活性，進(jìn)而起到減輕腎小管EMT進(jìn)程，發(fā)揮抗腎臟纖維化作用，這為中醫(yī)藥防治CKD提供新的思路和方向。