基于均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的小漿果多酚體外協(xié)同抗氧化活性研究

關(guān)鍵詞：小漿果； 多酚； 均勻試驗(yàn)； 協(xié)同效應(yīng)分析； 抗氧化

中圖分類號(hào)：S184 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10. 7525/j. issn. 1006-8023. 2024. 06. 010

0引言

人體內(nèi)氧化失衡可引起多種疾病，抗氧化化合物可以防止或減少細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷。植物中的多酚類物質(zhì)，是食源抗氧化劑的主要來(lái)源，尤其是水果和蔬菜中的多酚類物質(zhì)占食源抗氧化物質(zhì)的很大比重［1］。小漿果（如篤斯越橘、紅豆越橘、藍(lán)靛果、蔓越莓和樹莓等）果實(shí)中富含多酚類物質(zhì)，包括花青素、原花青素、黃酮醇和酚酸等。這些化合物具有多個(gè)酚羥基，能夠提供電子或氫原子與自由基反應(yīng)，中斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化作用。有研究表明多種抗氧化劑配伍后的抗氧化效果大多顯著高于使用同等劑量的單一抗氧化劑的效果［2-4］。小漿果中多種抗氧化成分之間可能存在協(xié)同作用，食用6種漿果提取物（野生藍(lán)莓、野生越桔、蔓越莓、接骨木、樹莓籽和草莓）的組合比食用單個(gè)漿果表現(xiàn)出更高的抗氧化能力［5］?；钚晕镔|(zhì)在協(xié)同（協(xié)同/加和/拮抗）抗氧化方面與其結(jié)構(gòu)和質(zhì)量濃度比例具有相關(guān)性［6-7］，只有通過(guò)科學(xué)的配比，才能發(fā)揮更好的功效。多種抗氧化劑聯(lián)合使用，進(jìn)行科學(xué)的配伍研究時(shí)，選取科學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，不但可以減少試驗(yàn)工作量，同時(shí)也可得出科學(xué)、可靠的配方比例。均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Uniform Design，UD）是一種統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，試驗(yàn)點(diǎn)均勻分散且較正交試驗(yàn)次數(shù)少的特點(diǎn)而被廣泛用于中藥方劑配伍研究［8-9］。

基于此，本研究采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)科學(xué)配伍，研究篤斯越橘、紅豆越橘、藍(lán)靛果和蔓越莓多酚不同組合對(duì)DPPH自由基清除能力的影響，優(yōu)選出抗氧化能力較強(qiáng)的多種小漿果多酚協(xié)同抗氧化組合，提高小漿果多酚的抗氧化能力，提升多種小漿果果實(shí)的加工利用率，為小漿果在產(chǎn)品開發(fā)和食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1. 1材料與儀器

篤斯越橘、紅豆越橘、藍(lán)靛果購(gòu)于大興安嶺超越野生漿果開發(fā)有限責(zé)任公司，蔓越莓購(gòu)于撫遠(yuǎn)紅海植業(yè)有限公司。XDA-6樹脂購(gòu)于南開大學(xué)樹脂廠；抗壞血酸（vitamin C，VC）和1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）購(gòu)于Sigma公司。

ALC-110電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；S-3L pH計(jì)：上海精密儀器有限公司；UVVisEVO300分光光度計(jì)：Thermo公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FRQ-1035ST超聲波提取儀：杭州法蘭特超聲波科技有限公司。

1. 2試驗(yàn)方法

1. 2. 1樣品提取方法

4種漿果果實(shí)鮮果直接破碎后，采用超聲波輔助提取工藝提取，提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)70% 的乙醇，料液比為1∶10（g∶mL），提取溫度設(shè)定40 ℃，提取功率150 W，提取時(shí)間30 min，提取2次，合并提取液。將提取液在48 ℃條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后凍干得到4種漿果多酚的粗提物，分別標(biāo)記為D-0（篤斯越橘多酚粗提物）、H-0（紅豆越橘多酚粗提物）、L-0（藍(lán)靛果多酚粗提物）、M-0（蔓越莓多酚粗提物）。

1. 2. 2樣品純化方法

采用柱層析法，以XDA-6為介質(zhì)，依次以蒸餾水、10%乙醇水溶液、40%乙醇水溶液、70%乙醇水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)漿果多酚粗提取物進(jìn)行分離純化，收集不同質(zhì)量濃度乙醇洗脫液，經(jīng)減壓濃縮、真空冷凍，得到漿果多酚凍干粉。分別標(biāo)記為D1（篤斯越橘10%乙醇洗脫物）、D2（篤斯越橘40% 乙醇洗脫物）D3（篤斯越橘70% 乙醇洗脫物）；H1（紅豆越橘10%乙醇洗脫物）、H2（紅豆越橘40%乙醇洗脫物）、H3（紅豆越橘70%乙醇洗脫物）；L1（藍(lán)靛果10%乙醇洗脫物）、L2（藍(lán)靛果40%乙醇洗脫物）、L3（藍(lán)靛果70%乙醇洗脫物）；M1（蔓越莓10% 乙醇洗脫物）、M2（蔓越莓40% 乙醇洗脫物）、M3（蔓越莓70%乙醇洗脫物）。

1. 2. 3總多酚含量、DPPH和羥自由基檢測(cè)方法

總多酚含量參照文獻(xiàn)［10］，采用福林酚法進(jìn)行檢測(cè)。分別稱取4種漿果多酚粗提物和多酚純化物的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL 蒸餾水中，備用。DPPH自由基清除率參照Blois［11］和徐宜彬等［12］的研究方法，分別稱取陽(yáng)性對(duì)照VC粉末、4種漿果多酚粗提物和多酚純化物的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL蒸餾水中，配成10 mg/mL 溶液，然后按照梯度0、0. 025、0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8 mg/mL進(jìn)行稀釋，配成不同質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行清除DPPH自由基能力檢測(cè)。羥自由基清除率參照王化等［13］的研究方法，分別稱取陽(yáng)性對(duì)照VC粉末及D2、H2、L2的凍干粉100 mg，溶于10. 0 mL 蒸餾水中，配成10 mg/mL 溶液，然后根據(jù)需要單一組分及組合配成不同質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)行清除羥自由基能力試驗(yàn)研究。

1. 2. 4協(xié)同效應(yīng)分析方法

協(xié)同效應(yīng)分析基于Chou-Talalay法［7，14］，衡量指標(biāo)是協(xié)同指數(shù)（Combination Index，CI，式中記為CI），計(jì)算公式為

1. 2. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26. 0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸和方差分析處理，多組間采用單因素方差分析（One Way ANOVA），數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（x?±Se，n=3）表示，利用GraphpadPrism 8. 2. 0軟件計(jì)算IC₅₀值和作圖。

2結(jié)果與分析

2. 1 4種小漿果多酚組分總多酚含量

4種小漿果多酚純化物（D1—D3、H1—H3、L1—L3、M1—M3）各組分的多酚含量均顯著高于各自的粗提物（D0、H0、L0、M0）組分的多酚含量（Plt;0. 05），如圖1 所示。各組分純化產(chǎn)物中均為第2 段（D2、H2、L2、M2）的多酚含量最高，均顯著高于其他組分（Plt;0. 05），純度均達(dá)到了40% 以上，并且D2 和L2的純度達(dá)到了50%以上。

2. 2 4種小漿果多酚清除DPPH 自由基能力組分優(yōu)選

由圖2可知，4種小漿果多酚粗提物及純化產(chǎn)物清除DPPH 自由基的能力，在試驗(yàn)選定的0. 025～0. 80 mg/mL均隨著質(zhì)量濃度的升高而升高；并且在每組中，均是第2段的多酚純化產(chǎn)物（D2、E2、L2、M2）活性最高，這可能與這段純化產(chǎn)物中的多酚含量高有關(guān)。后續(xù)試驗(yàn)中，每種小漿果均選取活性最高的這段組分進(jìn)行后續(xù)研究。

2. 3 4種小漿果多酚清除DPPH自由基能力的IC₅₀值比較研究

圖3是以VC為對(duì)照，4種小漿果抗氧化最強(qiáng)活性多酚組分隨著質(zhì)量濃度的升高清除DPPH自由基能力的趨勢(shì)圖及IC₅₀值比較，由圖4可知，4種小漿果第2段多酚純化產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力均顯著低于VC對(duì)照組（Plt;0. 01），說(shuō)明這4種小漿果多酚純化產(chǎn)物的清除DPPH自由基能力低于VC。并且在幾個(gè)小漿果多酚組分中D2和H2的IC₅₀值顯著低于L2和M2，說(shuō)明這2種小漿果多酚的清除DPPH自由基能力要優(yōu)于另外2種。幾種小漿果多酚清除DPPH自由基能力由高到低的順序?yàn)镈2、H2、L2、M2。

2. 4 4種小漿果多酚組分協(xié)同抗氧化能力組合優(yōu)選

2. 4. 1 4種小漿果多酚組分均勻試驗(yàn)結(jié)果及分析

以4種小漿果第2段多酚純化產(chǎn)物的IC50值為基礎(chǔ)，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)方開泰［15］的四因素15水平設(shè)計(jì)，采用均勻設(shè)計(jì)表U15*（157）的使用表（S=4，D=0. 155 1，S 表示選擇的列數(shù)，D 表示均勻度的偏差，使用原表的1、2、4、6列），每個(gè)因素以0為起點(diǎn)，每個(gè)質(zhì)量濃度間隔0. 0055 mg/mL，設(shè)置15 個(gè)梯度，以清除DPPH自由基能力為響應(yīng)指標(biāo)，研究不同組合對(duì)抗氧化能力的影響，以優(yōu)選出最佳組合。15個(gè)組合的編碼變量、過(guò)程變量及清除DPPH自由基的結(jié)果見(jiàn)表1。

利用SPSS26. 0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel軟件對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行方差和回歸分析，由表2方差分析結(jié)果可見(jiàn)，模型回歸顯著性Plt;0.01，表明模型具有顯著性，模型R²為0. 947，表明模型可用。

在4個(gè)因素中篤斯越橘多酚化合物（D2）對(duì)DPPH自由基的清除率具有顯著影響（Plt;0. 05），見(jiàn)表3。紅豆越橘多酚化合物（H2）、藍(lán)靛果多酚化合物（L2）和蔓越莓多酚化合物（M2）3個(gè)因素對(duì)DPPH自由基的清除率均具有極顯著影響（Plt;0. 01）。

通過(guò)回歸擬合，可得到各因素和清除率的回歸方程為：Y = 39. 546 + 48. 949 × D₂ + 164. 034 × H₂+208. 018×L₂+162. 763 × M₂，式中， D₂、H₂、L₂、M₂代表D2、H2、L2、M2清除率。根據(jù)試驗(yàn)需求，約束目標(biāo)函數(shù)最大清除率為100%，得到4個(gè)因素清除DPPH自由基的最佳組合為篤斯越橘41. 50 μg/mL、紅豆越橘137. 79μg/mL、藍(lán)靛果172. 20μg/mL、蔓越莓為0μg/mL，比例約為（14∶46∶57∶0）（表1），即不加蔓越莓多酚時(shí)，其他3種小漿果多酚進(jìn)行組合的抗氧化能力最好。有研究表明活性物質(zhì)在協(xié)同（協(xié)同/加和/拮抗）抗氧化方面與其結(jié)構(gòu)具有相關(guān)性。3，7-二羥基黃酮與5-羥基黃酮、6-羥基黃酮和5，6，7-三羥基黃酮聯(lián)合作用時(shí)，表現(xiàn)為協(xié)同作用；而6-羥基黃酮與5-羥基黃酮和7-羥基黃酮表現(xiàn)為拮抗作用［16］。這可能是蔓越莓多酚中的某種結(jié)構(gòu)與其他3種漿果中的多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生了拮抗作用，具體是哪個(gè)結(jié)構(gòu)影響了組合的抗氧化活性，有待進(jìn)一步研究。

2. 4. 2優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證方程得到的質(zhì)量濃度配比是否具有可行性，采用確定的優(yōu)化條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，調(diào)整最佳組合質(zhì)量濃度為：篤斯越橘多酚（D2）42 μg/mL、紅豆越橘（H2）138 μg/mL；藍(lán)靛果（L2）172μg/mL，進(jìn)行復(fù)配驗(yàn)證試驗(yàn)，此組合實(shí)際驗(yàn)證結(jié)果清除率為98. 07%±0. 31%。

通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相對(duì)偏差，也可作為回歸方程擬合程度的判斷，公式為X_{相對(duì)偏差}=| （Y | _{實(shí)際值}- Y_{預(yù)測(cè)值}）/Y_{實(shí)際值}×100%。本研究實(shí)際值與目標(biāo)推測(cè)值100%比較偏差為1. 93%，結(jié)果小于5. 0%，相對(duì)偏差較小，說(shuō)明結(jié)果較為準(zhǔn)確，可以較好地反映實(shí)際情況，此模型具有可行性。因此，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最佳組合條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

2. 5協(xié)同效應(yīng)分析

以常用抗氧化劑VC為對(duì)照，以優(yōu)選出的組合處理組總質(zhì)量濃度0. 352mg/mL為實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度，通過(guò)對(duì)相同物質(zhì)含量的組合及單一組分進(jìn)行清除DPPH自由基和羥自由基對(duì)比研究，結(jié)果如圖4所示，研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)選出的組合清除DPPH自由基和羥自由基的能力極顯著高于D2、H2、L2單一組分（Plt;0. 01），其IC50值也極顯著低于D2、H2、L2單一組分（Plt;0. 01），說(shuō)明篤斯越橘多酚（D2）、紅豆越橘多酚（H2）、藍(lán)靛果多酚（L2）3種物質(zhì)組合抗氧化能力具有協(xié)同增效的作用，并且通過(guò)組合之后其清除DPPH自由基的抗氧化能力顯著高于VC對(duì)照組（Plt;0. 01），清除羥自由的能力與VC對(duì)照組無(wú)顯著差異（Pgt;0. 05）

協(xié)同效應(yīng)分為協(xié)同、拮抗、加和3種。有研究表明活性物質(zhì)在協(xié)同（協(xié)同、加和、拮抗）抗氧化方面與其質(zhì)量濃度比例具有相關(guān)性。綠原酸與蘆丁濃度比值為4. 5∶1時(shí)，對(duì)超氧陰離子清除能力表現(xiàn)為協(xié)同作用，而當(dāng)兩者濃度比值為1∶2時(shí)，則表現(xiàn)出拮抗作用［17］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證均勻試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳組合是否具有協(xié)同增效作用，利用協(xié)同效用方程對(duì)均勻試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳組合進(jìn)行協(xié)同效應(yīng)分析，當(dāng)CI值小于1，表明2種（或2種以上）物質(zhì)間具有協(xié)同增強(qiáng)作用，并且當(dāng)CI小于0. 7時(shí)，表示協(xié)同作用非常顯著［18］，經(jīng)協(xié)同效應(yīng)分析（表4），均勻試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳組合清除DPPH自由基的CI值為0. 57，清除羥自由基的CI值為0. 64，這表明3種小漿果多酚通過(guò)適宜配伍，在抗氧化方面具有顯著的協(xié)同增效作用。

3結(jié)論

本研究采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，優(yōu)化出了幾種小漿果多酚抗氧化能力的最佳配伍組合：篤斯越橘多酚（D2）∶紅豆越橘（H2）∶藍(lán)靛果（L2）為14∶46∶57，其最佳質(zhì)量濃度分別為42、138、172 μg/mL，其抗氧化能力達(dá)到了98. 07%±0. 31%，與預(yù)測(cè)值比較偏差為1. 93%，結(jié)果小于5. 0%，相對(duì)偏差較小，說(shuō)明結(jié)果較為準(zhǔn)確，通過(guò)均勻試驗(yàn)得到的模型具有可行性。通過(guò)協(xié)同效應(yīng)分析，優(yōu)選出的組合清除DPPH自由基和羥自由基的協(xié)同效應(yīng)指數(shù)CI 值分別為0. 57 和0. 64，表明優(yōu)選出的組合在體外抗氧化活性方面具有顯著的協(xié)同增效作用。隨著協(xié)同抗氧化劑的研究不斷深入，其在提高抗氧化能力和預(yù)防疾病方面具有很大的潛力，后續(xù)研究將進(jìn)一步探索其作用機(jī)制。