基于SIRT3/MnSOD信號(hào)通路探討健脾調(diào)脂方對(duì)心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響

王 新,付 蓉,覃 余,高代材

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025;2. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,貴州 貴陽(yáng) 550001;3. 鹽源縣中醫(yī)醫(yī)院,四川 鹽源 615000)

心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能障礙導(dǎo)致心室射血和充盈功能受損而出現(xiàn)心功能不全的臨床綜合征[1]。近年來(lái)隨著人口老齡化加劇,心力衰竭的發(fā)病率在逐漸增高,在≥25歲的中國(guó)人群中,心力衰竭患者達(dá)1 210萬(wàn);在≥35歲的中國(guó)人群中,心力衰竭患病率為1.3%;25～64歲、65～79歲和≥80歲人群心力衰竭患病率分別為0.57%,3.86%和7.55%[2]。心肌纖維化是高血壓心臟病、冠心病、心肌病等心臟疾病向心力衰竭進(jìn)展的必然過(guò)程,其發(fā)生在心臟損傷的早期,并貫穿心臟損傷的始終,是心力衰竭極為重要的病理生理過(guò)程。在心肌纖維化進(jìn)展過(guò)程中,沉默調(diào)節(jié)蛋白3(SIRT3)可通過(guò)抗氧化應(yīng)激,抑制肌成纖維細(xì)胞分化,從而抑制心肌纖維化,延緩心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[3-4]。錳超氧化物歧化酶 (MnSOD)具有抗氧化作用,SIRT3可以直接通過(guò)去乙?；疢nSOD從而增強(qiáng) MnSOD 的抗氧化能力[5]。中醫(yī)學(xué)根據(jù)心肌纖維化的臨床表現(xiàn)多將其歸于“心悸”“胸痹”等范疇,病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、久病入絡(luò),本虛為陽(yáng)氣虧虛,標(biāo)實(shí)為痰濁、瘀血,其中血瘀是心肌纖維化病變過(guò)程中的重要病機(jī)和病理產(chǎn)物[6]。貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科付蓉主任醫(yī)師擬定的驗(yàn)方——健脾調(diào)脂方具有健脾化濕、活血化瘀降濁之功[7],本研究探討了該方對(duì)心力衰竭心肌纖維化及SIRT3/MnSOD信號(hào)通路的影響,以明確其作用及機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體重200～220 g,由貴州中醫(yī)藥大學(xué)云巖校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(黔)2021-0003。大鼠在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中飼養(yǎng),食水充足,溫濕度適應(yīng)(溫度20～24 ℃,濕度40%～60%),自由取食,適應(yīng)飼養(yǎng)1周。動(dòng)物使用嚴(yán)格遵照貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理管理委員會(huì)要求。

1.2主要藥物與試劑 健脾調(diào)脂方(白術(shù)15 g、茯苓15 g、草決明12 g、澤瀉12 g、半夏12 g、山楂9 g、丹參9 g)制劑由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供(黔藥制字Z20100014);卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H31022986,規(guī)格:25 mg/片);阿霉素(上海展云化工有限公司,批號(hào):20150412)。Ⅰ型膠原蛋白(Collagen Ⅰ)抗體(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF7001),Ⅲ型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)抗體(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5457),SIRT3抗體(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5135),MnSOD抗體(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):AF5144),β-actin抗體(美國(guó)Affinity公司,批號(hào):#AF7018),蛋白提取液(北京MDL公司,批號(hào):MDL91201),蛋白酶抑制劑(北京MDL公司,批號(hào):MD912893),BCA蛋白濃度測(cè)定kit(北京MDL公司,批號(hào):MD913053),SDS-PAGE預(yù)制膠套裝kit(北京MDL公司,批號(hào):MD911919),中等蛋白分子量Marker(美國(guó)Thermo公司,批號(hào):26617)。

1.3主要儀器和耗材 電子顯微鏡(德國(guó)Leica儀器有限公司,DM3000),電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設(shè)備廠,HWS-24),低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司,3-30K),0.22 μm NC膜(美國(guó)Millipore公司,ISEQ00010),3MM濾紙(英國(guó)Whatman公司,3030861),脫色搖床(海門(mén)其林貝爾儀器制造公司,TS-100),電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司,BG-subMIDI),SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國(guó)BIO-Rad公司,Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply),凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UPV公司,GelDoc-It310),ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-Rad公司,170-8280)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 取10只大鼠作為正常組,其余60只大鼠采用阿霉素尾靜脈注射方法建立心力衰竭心肌纖維化模型。造模方法:注射前24 h禁食水,每次注射阿霉素2.5 mg/kg,1次/周,連續(xù)注射6周后,由專門(mén)超聲技師通過(guò)彩色多普勒超聲心臟探頭檢測(cè)驗(yàn)證大鼠造模結(jié)果,以左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<50%提示心力衰竭造模成功,然后隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行心肌組織病理切片HE染色證實(shí)其具有心肌纖維化病理學(xué)特征提示心肌纖維化造模成功。造模成功后,將存活大鼠隨機(jī)分為模型組、卡托普利組、健脾調(diào)脂方低劑量組、健脾調(diào)脂方中劑量組、健脾調(diào)脂方高劑量組,每組10只。根據(jù)《中醫(yī)科研設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)》中人與動(dòng)物體表面積比率換算法,參照臨床70 kg體重成年患者每天服藥量,卡托普利組給予卡托普利2.6 mg/kg灌胃,健脾調(diào)脂方低、中、高劑量組分別給予健脾調(diào)脂方4.38 g/kg、8.75 g/kg、17.75 g/kg灌胃,正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)6周,期間每周末稱重?fù)Q算給藥劑量。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1心功能 末次灌胃40 min后,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,備皮,充分暴露胸部,將大鼠仰臥位固定。采用M型超聲心動(dòng)圖連續(xù)檢測(cè)3個(gè)心動(dòng)周期,觀察并記錄左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、LVEF、左心室短軸縮短率 (LVFS),評(píng)估大鼠心功能。

1.5.2心肌組織病理學(xué)形態(tài)及纖維化情況 剖取大鼠左心室的心肌組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,制作4～6 μm厚切片,分別進(jìn)行HE及Masson染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(膠原陽(yáng)性藍(lán)色面積/組織總面積×100%)。

1.5.3心肌組織中膠原蛋白及SIRT3、MnSOD蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取左室心肌組織,PBS勻漿,裂解液裂解,4 ℃下12 000 r/min離心30 min,取上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度。樣品加至凝膠孔,電壓80 V進(jìn)行電泳;電泳結(jié)束后,將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜,接通電源,恒壓狀態(tài)下,120 V轉(zhuǎn)膜1.5 h;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,室溫下TBST洗膜3次,后置于封閉液中封閉2 h;一抗4 ℃孵育過(guò)夜;二抗37 ℃孵育1 h;ECL顯色,將膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像;結(jié)果采用Image J軟件測(cè)定灰度值,進(jìn)行半定量分析,重復(fù)3次。

1.5.4心肌組織中膠原蛋白及SIRT3、MnSOD mRNA表達(dá)情況 采用RT-qPCR法檢測(cè):取左室心肌組織,加1 mL TRIzol研磨,轉(zhuǎn)移至1. 5 mL EP管。測(cè)定總RNA濃度,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。按2 μL cDNA、10 μL PCR mix、1 μL primer F、1 μL primerR、6 μL ddH2O建立RT-qPCR反應(yīng)體系,體系混勻后,瞬離一下,置于熒光定量PCR儀上按照相應(yīng)反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng),最后采用2-ΔΔCT法分析。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),符合正態(tài)分布方差齊的數(shù)據(jù)多組間比較采用

單因素方差分析,其多重比較采用LSD檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism7.0軟件繪制柱狀圖。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心功能比較 與正常組比較,模型組大鼠LVIDd、LVIDs均明顯增加(P均<0.05),LVEF、LVFS均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較, 卡托普利組和健脾調(diào)脂方各組LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS均明顯改善(P均<0.05), 健脾調(diào)脂方各劑量組上述4項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),但健脾調(diào)脂方高劑量組改善相對(duì)更明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和心力衰竭各組大鼠心功能指標(biāo)

2.2各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài) 正常組大鼠心肌組織正常;模型組大鼠心肌細(xì)胞間隙擴(kuò)大,大量炎癥細(xì)胞聚集,細(xì)胞壞死,心肌纖維斷裂、出血;與模型組比較,健脾調(diào)脂方低劑量組大鼠心肌組織病理改變減輕,但依舊可見(jiàn)炎癥細(xì)胞聚集;健脾調(diào)脂方中、高劑量組和卡托普利組大鼠細(xì)胞壞死較少,組織腫脹、心肌纖維斷裂等情況顯著減輕,但依舊可見(jiàn)少量出血。見(jiàn)圖2。

圖2 正常組和心力衰竭各組大鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色,×100)

2.3各組大鼠心肌組織纖維化情況 正常組心肌

纖維染成紅色,心肌膠原容積分?jǐn)?shù)為7.53%;模型組纖維膠原沉積,膠原纖維染成藍(lán)色,心肌膠原容積分?jǐn)?shù)為30.09%,明顯高于正常組(P<0.05);卡托普利組和健脾調(diào)脂方低、中、高劑量組纖維化程度較輕,心肌膠原容積分?jǐn)?shù)分別為16.45%,24.07%,13.82%,14.45%,均明顯低于模型組(P均<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 正常組和心力衰竭各組大鼠心肌組織纖維化情況(Masson染色,×100)

2.4各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD蛋白表達(dá)情況 與正常組比較,模型組大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05),SIRT3、MnSOD蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較, 卡托普利組和健脾調(diào)脂方各組大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),SIRT3、MnSOD蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 正常組和心力衰竭各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD蛋白表達(dá)情況

2.5各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD mRNA表達(dá)情況 與正常組比較,模型組大鼠Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(P均<0.05),SIRT3、MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,卡托普利組和健脾調(diào)脂方中、高劑量組大鼠Collagen Ⅰ mRNA相對(duì)表達(dá)量及各藥物組大鼠Collagen Ⅲ mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),卡托普利組大鼠SIRT3、MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量和健脾調(diào)脂方中、高劑量組大鼠SIRT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量及健脾調(diào)脂方高劑量組大鼠MnSOD mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 正常組和心力衰竭各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、SIRT3、MnSOD mRNA表達(dá)情況

3 討 論

目前研究認(rèn)為,心肌纖維化是促進(jìn)病理性心臟重塑的關(guān)鍵因素,而心臟重塑在心力衰竭心臟功能逐漸惡化中起關(guān)鍵作用[8-9]。心肌纖維化是指細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解不平衡,大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致心肌組織順應(yīng)性下降,并影響心排血量,最終導(dǎo)致心功能不全的一種病理改變[10]。心肌纖維化是各種心臟疾病的病理基礎(chǔ),也是心功能障礙的重要誘因,心肌纖維化的程度與心臟疾病的預(yù)后密切相關(guān)[8]。因此,抑制心臟重塑、改善心肌纖維化有望改善心力衰竭預(yù)后。

中醫(yī)藥通過(guò)軟堅(jiān)散結(jié)法、祛痰化瘀法、通絡(luò)法等辨證論治心肌纖維化均有一定效果[11-13]。健脾調(diào)脂方既可消痰飲、化濕濁,又可活血化瘀,前期研究證實(shí)該方可改善急性冠脈綜合征患者血管內(nèi)皮功能[7],但其對(duì)心肌纖維化是否有影響尚不明確,為此課題組進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果顯示,大鼠尾靜脈注射阿霉素可成功復(fù)制心力衰竭心肌纖維化模型;給予不同劑量的健脾調(diào)脂方干預(yù)后,大鼠LVIDd、LVIDs均縮短,LVEF、LVFS均升高,心肌膠原容積分?jǐn)?shù)及心肌組織中Collagen Ⅰ、 Collagen Ⅲ蛋白及mRNA表達(dá)量降低,心肌細(xì)胞壞死較少,組織腫脹、心肌纖維斷裂等情況顯著減輕,其中高劑量健脾調(diào)脂方干預(yù)作用更明顯,說(shuō)明健脾調(diào)脂方可在一定程度上抑制心肌纖維化,改善心功能,且與劑量有一定關(guān)系。

Sirtuins 家族是一組依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；?可以去乙?；M蛋白和非組蛋白,能改變部分蛋白的功能,還能夠消除異?；瘜W(xué)反應(yīng)中的乙?；鶊F(tuán),去乙?；嚢彼釟埢?釋放尼克酰胺和乙?；孜?它們與心血管疾病的病理生理息息相關(guān)[14]。SIRT3是一種存在于線粒體基質(zhì)中的可溶性蛋白,是Sirtuins家族成員之一,在氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝中具有不可或缺的作用,且在機(jī)體內(nèi)SIRT3幾乎參與所有的細(xì)胞代謝信號(hào)通路調(diào)節(jié)[15]。MnSOD位于線粒體內(nèi),其主要通過(guò)清除自由基來(lái)保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷,SIRT3表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)MnSOD表達(dá),從而提高機(jī)體的抗氧化能力,減輕氧化應(yīng)激[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中、高劑量健脾調(diào)脂方可上調(diào)SIRT3、MnSOD的表達(dá),結(jié)合既往研究推測(cè)健脾調(diào)脂方可能通過(guò)上調(diào)SIRT3表達(dá)從而促進(jìn)MnSOD表達(dá),產(chǎn)生抗氧化作用,抑制心肌纖維化。

綜上所述,健脾調(diào)脂方能有效抑制心力衰竭進(jìn)程中心肌組織中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá),減輕心肌纖維化程度,其作用機(jī)制可能與激活SIRT3/MnSOD信號(hào)通路,減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。但健脾調(diào)脂方中具體是哪一種成分起作用,是否還有其他通路參與,有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。