紅樹林植物內(nèi)生菌分離鑒定及其抑菌活性研究

謝星朋 戴悅 彭金菊 羅帥帥 李楊 馬浩天 劉志軍 張怡 馬驛

摘要? ［目的］從紅樹林植物組織中分離出對動物病原菌具有廣譜抑菌活性的植物內(nèi)生菌。［方法］以銅綠假單胞菌、多殺性巴氏桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、糞腸球菌4種常見的致病菌作為指示菌，采用M10和P3培養(yǎng)基從紅樹林植物根、莖、葉組織中分離內(nèi)生菌，以固體瓊脂打孔法篩選具有抑菌活性的菌株，提取菌株的基因組DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因并測序，通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。［結(jié)果］從紅樹林植物組織中共分離857株可培養(yǎng)的內(nèi)生菌，有145株菌有抑菌活性，占分離菌株的16.6%。其中通過M10培養(yǎng)基從紅樹林植物葉組織分離的菌株32-5對銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌都具有最強(qiáng)抑菌活性，其抑菌圈直徑分別為38和42 mm；通過P3培養(yǎng)基從紅樹林植物莖組織分離的菌株12-4對糞腸球菌具有最強(qiáng)抑菌活性，其抑菌圈直徑為56 mm；通過M10培養(yǎng)基從紅樹林植物莖組織分離的菌株13-2對多殺性巴氏桿菌具有最強(qiáng)抑菌活性，其抑菌圈直徑為64 mm。有抑菌活性菌株分為10個屬，其中芽孢桿菌屬是優(yōu)勢菌屬。［結(jié)論］該試驗初步揭示紅樹植物根、莖、葉組織中植物內(nèi)生菌的抑菌活性和多樣性，為開發(fā)新型抗菌藥物及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 紅樹林；植物內(nèi)生菌；分離；鑒定；抑菌活性；海洋細(xì)菌

中圖分類號? Q939.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

文章編號? 0517-6611（2024）04-0001-10

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation，Identification and Antibacterial Activity of Endophytic Bacteria from Mangrove Plants

XIE Xing.peng，DAI Yue，PENG Jin.ju et al

（Depariment of Veterinary Medicine，College of Coastal Agricultural Sciences，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524000）

Abstract? ［Objective］To isolate plant endophytes with broad.spectrum antibacterial activity from mangrove plant tissues.［Method］Pseudomonas aeruginosa，Pasteurella multocida，Enterobacter aerogenes and Enterococcus faecalis were selected as indicator bacteria.M10 and P3 solid medias and agar.well diffusion were used to isolate and screen endophytes with antibacterial activity from root，stem and leaf tissues of mangrove plants.Extracted DNA were used as template for PCR amplification of the 16S rDNA gene and sequenced to construct a phylogenetic tree by neighbor.joining method.［Result］A total of 857 culturable bacteria were isolated from mangrove plant tissues and 145 strains had inhibitory activity，accounting for 16.6% of the isolates.The strain 32.5，isolated from mangrove plant leaf tissue using M10 solid medium，had the strongest inhibitory activity against Pseudomonas aeruginosa and Enterobacter aerogenes，with an inhibition circle diameter of 38 mm and 42 mm，respectively.Strain 12.4 isolated from mangrove plant stem tissue using P3 solid medium showed the strongest inhibitory activity against Enterococcus faecalis with an inhibition circle diameter of 56 mm.Strains 13.2 isolated from mangrove plant stem tissues using M10 medium showed the strongest inhibitory activity against Pasteurella multocida with an inhibition circle diameter of 64 mm.Bacteria with antibacterial activity were classified into 10 genus，of which Bacillus was the dominant genus.［Conclusion］This experiment initially revealed the antibacterial activity and diversity of endophytic bacteria in mangrove plant roots，stems and leaf tissues，providing a theoretical basis for the development and application of new antibacterial drugs.

Key words? Mangrove;Plant endophytic bacteria;Separation;Identification;Bacteriostatic activity;Marine bacteria

基金項目? 廣東省自然科學(xué)基金項目（2023A1515012181）；湛江市科技局科技專項資金競爭性分配項目（2021A05231）；茂名實驗室科研啟動項目（2021TDQD002）。

作者簡介? 謝星朋（1999—），男，江西吉安人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)。*通信作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。

收稿日期? 2023-04-14

紅樹林是一種處在熱帶和亞熱帶交界地帶的木本植物群落，是海洋與陸地兩大生態(tài)系統(tǒng)的過渡區(qū)域，其獨(dú)特的地理環(huán)境導(dǎo)致其中的微生物及其產(chǎn)物具有特殊性，紅樹植物內(nèi)生菌復(fù)雜多樣的代謝產(chǎn)物可成為重要的抗菌活性物質(zhì)來源。目前，從紅樹林植物如木欖、秋茄、紅海欖和海桑等宿主植物中均發(fā)現(xiàn)抗菌化合物［1-2］。隨著陸地來源的藥物研發(fā)難度不斷加大，以“藍(lán)色海洋藥庫”為資源庫研制新藥物已成為當(dāng)今醫(yī)藥研究的重要方向。海洋微生物天然產(chǎn)物的研究最早是從海洋真菌開始的，海洋細(xì)菌天然產(chǎn)物的研究相對較晚。植物內(nèi)生菌主要是指定殖于植物組織器官以及細(xì)胞間隙中的內(nèi)生細(xì)菌［3］。研究顯示，植物內(nèi)生菌其特殊的代謝途徑使其次級代謝產(chǎn)物可以產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎、抑菌效果較好的生物活性物質(zhì)，成為開發(fā)新型抗微生物藥物的良好資源［4-5］。該試驗從廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)采取紅樹植物根、莖、葉樣品，分離對動物病原菌有抑菌活性的內(nèi)生菌，對其進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，為開發(fā)新型抗菌藥物及其在動物疫病防治領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 培養(yǎng)基。M10培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.0 g，水解酪素0.5 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂14.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，復(fù)合鹽母液溶解。P3培養(yǎng)基： 燕麥粉20.0 g，復(fù)合鹽母液10 mL，瓊脂14.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4，復(fù)合鹽母液溶解。

復(fù)合鹽母液：KNO3 1.000 g，K2HPO4 0.500 g，NH4NO3? 0.100 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，NaCl 0.500 g，F(xiàn)eSO4 0.010 g，MnCl2·H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，去離子水10 mL。LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基購自北京酷來博科技有限公司。

1.1.2? 指示菌。

多殺性巴氏桿菌（批號CVCC393）、產(chǎn)氣腸桿菌（批號ATCC13048）、糞腸球菌（批號ATCC29212）、銅綠假單胞菌（批號ATCC9027），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 樣本采集。

從廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)采集紅樹植物根、莖、葉各50份，裝于密封袋，室溫保存。

1.2.2? 樣本的分組和處理。

將采集的紅樹植物組織根、莖、葉樣品各50份隨機(jī)排序標(biāo)記。將樣本植物清洗干凈，依次用5%次氯酸鈉、75%乙醇浸泡3 min，在消毒液浸泡后用無菌水沖洗多次。消毒完成后晾干，采用電動勻漿器將植物組織充分研磨，加入無菌水制成組織原液。

1.2.3? 菌株培養(yǎng)與分離。

吸取植物組織原液0.1 mL均勻涂布到M10、P3培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～21 d，挑選單菌落，進(jìn)一步純化分離后的菌株-80 ℃保存。

1.2.4? 有抑菌活性菌株的篩選。

采用固體瓊脂打孔法篩選紅樹植物根、莖、葉組織中有抑菌活性的菌株，將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、鏈球菌4種指示菌分別加入LB固體培養(yǎng)基，用無菌打孔器打孔，將分離菌株培養(yǎng)過夜并用LB液體培養(yǎng)基稀釋至105 CFU/mL，接種至孔中，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5? 16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

對篩選的有抑菌活性的菌株采用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，進(jìn)行16S rDNA序列PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的引物設(shè)計如下：上游引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），下游引物1492R（5′-CTACGGCTACCT TGTTACGA-3′）。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序分析。序列經(jīng)BioEdit Sequence Alignment Editor軟件整理后，利用EzBioCloud數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/）進(jìn)行在線比對；選取同源性最高菌株的序列作為參比對象，運(yùn)用MEGA10.0軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Boostrap 1 000次檢測各分支的置信值，對各菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 分離菌株的抑菌效果

從紅樹植物根、莖、葉組織中分離出內(nèi)生菌共857株，其中根227株，莖310株，葉320株。M10培養(yǎng)基共分離出具有抑菌活性菌株95株，從紅樹林植物根分離出具有抑菌活性菌株22株，如表1所示，菌株45-4對銅綠假單胞菌抑菌活性最強(qiáng)，菌株29-1對產(chǎn)氣腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)，菌株14-1對糞腸球菌和多殺性巴氏桿菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)抑菌活性且呈現(xiàn)廣譜抑菌效果；從紅樹林植物莖分離出具有抑菌活性菌株38株，如表2所示，菌株13-2對銅綠假單胞菌、糞腸球菌和多殺性巴氏桿菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)抑菌活性且呈現(xiàn)廣譜抑菌效果，菌株21-4對產(chǎn)氣腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)且具有廣譜抑菌效果；從紅樹林植物葉分離出具有抑菌活性菌株35株，如表3所示，菌株32-5對銅綠假單胞菌和產(chǎn)氣腸桿菌均表現(xiàn)出最強(qiáng)抑菌活性且具有廣譜抑菌效果；菌株3-3對糞腸球菌具有最強(qiáng)的抑菌活性；菌株31-5對多殺性巴氏桿菌具有最強(qiáng)抑菌活性和廣譜抑菌效果。

P3培養(yǎng)基分離有抑菌活性細(xì)菌共47株，從紅樹林植物根分離出具有抑菌活性菌株30株，如表4所示，其中菌株7-3對銅綠假單胞菌抑菌活性最強(qiáng)，菌株11-1對糞腸球菌抑菌活性最強(qiáng)且具有廣譜抑菌效果，菌株26-1對產(chǎn)氣腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)且具有廣譜抑菌效果，菌株7-2對多殺性巴氏桿菌抑菌活性最強(qiáng)；從紅樹林植物莖分離出具有抑菌活性菌株7株，如表5所示，其中菌株12-4對銅綠假單胞菌、糞腸球菌、多殺性巴氏桿菌抑菌活性均最強(qiáng)且具有廣譜抑菌效果，菌株14-4對產(chǎn)氣腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)；從紅樹林植物葉分離出具有抑菌性菌株10株，如表6所示，其中菌株14-1對銅綠假單胞菌抑菌活性最強(qiáng)，菌株31-4對糞腸球菌和產(chǎn)氣腸桿菌抑菌活性均最強(qiáng)，菌株42-4對多殺性巴氏桿菌抑菌活性最強(qiáng)。

2.2? 有抑菌活性菌株的基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

分別對2種培養(yǎng)基分離篩選出的有抑菌活性的菌株構(gòu)建Neighbor.Joining系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1～6所示。M10培養(yǎng)基從紅樹林植物根分離的菌株主要分為4個屬，分別為變形桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬；從紅樹林植物莖分離的菌株主要為8個屬，分別為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、草螺菌屬、黃單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、分散泛菌屬；從紅樹林植物葉分離的菌株主要為4個屬，分別為分散泛菌屬、黃單胞菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬。P3培養(yǎng)基從紅樹林植物根分離的菌株主要分為6個屬，分別為芽孢桿菌屬、黃單胞菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、分散泛菌屬；從紅樹林植物莖分離的菌株主要為4個屬，分別為芽孢桿菌屬、腸球菌屬、變形桿菌屬、黃單胞菌屬；從紅樹林植物葉分離的菌株主要為2個屬，分別為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬。其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，占分離菌株總數(shù)的48.6%。

3? 討論與結(jié)論

海洋環(huán)境具有高壓、高鹽、無光照等特殊性，海洋微生物在海洋生態(tài)獨(dú)特環(huán)境下會產(chǎn)生獨(dú)特的代謝產(chǎn)物，而這些特殊代謝產(chǎn)物作為新型抑菌物質(zhì)在生物醫(yī)藥具有巨大的研究意義，目前已經(jīng)有針對海洋微生物及其次級代謝產(chǎn)物研究［6］。許多研究顯示海洋微生物中的優(yōu)勢菌屬——芽孢桿菌屬，可以產(chǎn)生具有抗菌作用的抑菌活性物質(zhì)［7］，如羅曼等［8］從南極海洋沉積物中分離純化出草芽孢桿菌斯氏亞種對層生鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性，Zhou等［9］從南大西洋的深海沉積物中分離篩選得到一株能抑制曲霉突變株菌絲生長的環(huán)狀芽孢桿菌。紅樹林是一種處在熱帶和亞熱帶交界地帶的木本植物群落，是海洋與陸地兩大生態(tài)系統(tǒng)的過渡區(qū)域，其獨(dú)特的地理環(huán)境導(dǎo)致其中的微生物及其產(chǎn)物具有特殊性，目前從紅

樹林植物如木欖、秋茄、紅海欖和海桑等宿主植物中均發(fā)現(xiàn)抗菌化合物［1-2］。根據(jù)戴悅等［10］對紅樹林植物根際土壤細(xì)菌分離鑒定及其抑菌活性研究顯示芽孢桿菌和腸桿菌為優(yōu)勢菌屬，從紅樹林植物根際提取的內(nèi)生菌具有產(chǎn)

生活性物質(zhì)的潛力。該試驗從廣東湛江紅樹林自然保護(hù)區(qū)采集的植物根、莖、葉中分離具有抑菌活性的菌株占分離菌株的16.6%，M10培養(yǎng)基分離提取的葉、莖組織具有抑菌活性的菌株（95株）比P3培養(yǎng)基（47株）更多。戴悅等［10］從紅樹林植物根際土壤中分離得到108株具有抑菌活性的菌株，占分離菌株的16.5%，且P3培養(yǎng)基比M10培養(yǎng)基在分離具有抑菌性菌株中更具有優(yōu)勢。李靜等［11］從海南東寨港紅樹林植物內(nèi)生菌中共分離得到146株放線菌，其中40株具有抗菌活性，占分離菌株的27.4%。以上都是從紅樹林中提取得到的具有抑菌活性的菌株，且抑菌率都在16.0%以上，因此從紅樹林中提取的內(nèi)生菌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)研究具有巨大的潛力。

通過分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，在屬水平上，有抑菌活性菌株共10個屬，分別是芽孢桿菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬、草螺菌屬、黃單胞菌屬、不動桿菌屬、腸桿菌屬、分散泛菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬，占分離菌株總數(shù)的48.6%，在M10和P3培養(yǎng)基中，M10培養(yǎng)基在葉部提取分離芽孢桿菌屬菌株數(shù)量最多，在根部提取芽孢桿菌屬菌株數(shù)量最少，P3培養(yǎng)基在根部提取分離出芽孢桿菌屬菌株數(shù)量最多，在莖部提取芽孢桿菌屬菌株數(shù)量最少。李蜜等［12］從紅樹植物組織器官中獲得33株內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌屬。張雅慧等［13］從山口紅樹林根際土壤中獲得117株細(xì)菌，其中芽孢桿菌為優(yōu)勢屬，占所有菌株的28.20%。Varghese等［14］研究表明海洋大型藻類相關(guān)異養(yǎng)細(xì)菌芽孢桿菌屬細(xì)菌萎縮芽孢桿菌具有較好的抗菌活性，其中萎縮芽孢桿菌SHB2097（MW821482）對臨床上重要的病原體表現(xiàn)出顯著的抗菌活性。這與該試驗結(jié)果一致，優(yōu)勢菌屬皆為芽孢桿菌屬。

以上數(shù)據(jù)表明湛江紅樹林植物各組織內(nèi)生菌具有產(chǎn)生微生物活性物質(zhì)的潛力，為開發(fā)新型抗菌物藥物及其在動物疫病防治領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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