Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性及中醫(yī)藥干預(yù)研究

劉沛 蔣宜偉,* 周玉英 張夏陽 海云翔 曠武龍 江朔軒

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000

2 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)被稱為“21世紀的無聲流行病”,以骨量降低、骨組織微觀結(jié)構(gòu)惡化、骨折易感性增加為主要特點[1]。研究調(diào)查顯示,中國中老年男性O(shè)P患病率為20.73%,女性為38.05%[2],OP已經(jīng)成為日益嚴重的健康問題。OP的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜,與氧化應(yīng)激、自噬、炎癥以及代謝異常有關(guān)[3]。核因子E2 相關(guān)因子 2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是一種主要通過調(diào)節(jié)細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮細胞保護作用的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子。此外,Nrf2還參與許多其他細胞過程,包括調(diào)節(jié)炎癥、自噬、鐵死亡等多個方面[4]。OP的發(fā)生主要是由于骨穩(wěn)態(tài)的破壞,導(dǎo)致成骨細胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細胞的骨吸收之間平衡被打破,使骨吸收大于骨形成從而導(dǎo)致OP,而氧化應(yīng)激、自噬、炎癥等均會導(dǎo)致或者加劇這一過程。Nrf2通過復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)能夠有效調(diào)節(jié)上述因素改善OP,且中醫(yī)藥以Nrf2為靶點在治療OP上優(yōu)勢顯著、效果明顯,因此筆者將從中醫(yī)藥通過Nrf2相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)治療骨質(zhì)疏松癥的研究進展做一綜述。

1 Nrf2概述

Nrf2是直接與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)直接結(jié)合的主要核轉(zhuǎn)錄因子,其具有七個保守的Nrf2-ECH同源(NEH)結(jié)構(gòu)域,它們具有不同的功能來控制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性[5]。Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1 (Keap1)是Nrf2的主要胞內(nèi)調(diào)控因子,在正常穩(wěn)態(tài)條件下,Nrf2被Keap1隔離在細胞質(zhì)內(nèi),在氧化應(yīng)激的情況下,Keap1蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變,Nrf2/keap1之間相互作用被破壞,Nrf2游離入細胞核,結(jié)合s Maf蛋白后,Nrf2激活抗氧化反應(yīng)元件部位(ARE)增加其調(diào)節(jié)下游抗氧化基因的表達[6],血紅素加氧酶-1(HO-1)是血紅素分解代謝和應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞保護酶,主要通過Nrf2調(diào)節(jié),Nrf2的激活可以刺激HO-1的表達,HO-1則通過其代謝產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化的作用[7]。NADP (H):醌氧化還原酶-1 (NQO-1)作為一種黃素酶,同樣是維持細胞氧化還原狀態(tài)的重要抗氧化酶[8],在Nrf2被激活的同時刺激NQO-1的表達,NQO-1通過與蛋白質(zhì)的相互作用以及mRNA翻譯的結(jié)合和調(diào)節(jié)等通過多個方面抗氧化應(yīng)激[9]。

激酶磷酸化對Nrf2的活化以及下游靶點的調(diào)節(jié)是至關(guān)重要的,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)可直接磷酸化Nrf2,從而抑制Nrf2靶基因的表達,此外,GSK-3β磷酸化Src家族酪氨酸激酶Fyn以促進其核積累,通過增加Nrf2的核輸出和降解來負調(diào)控Nrf2活性[10]。作為Nrf2上游信號的磷脂酰肌醇3(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通過阻斷GSK-3β活性,增加Nrf2水平并激活下游抗氧化途徑[11]。

2 Nrf2與OP

Nrf2是一種在許多細胞類型中表達的轉(zhuǎn)錄因子,包括成骨細胞、破骨細胞和骨細胞,Nrf2在骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),Nrf2的缺乏促進了OP的進展,并且與增齡性氧化應(yīng)激相關(guān)[12]。在成骨細胞到骨細胞的過渡過程中,由于線粒體含量增加導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平增加,而作為氧化應(yīng)激的主要傳感器,Nrf2在骨細胞生成過程中被激活,并直接反式激活許多骨細胞特異性基因,如Dmp1、Mepe和Sost。并且在動物實驗研究中發(fā)現(xiàn),Nrf2缺失的小鼠導(dǎo)致了骨質(zhì)的減少并損害骨細胞特異性基因的表達[13]。此外Nrf2的激活是抑制骨吸收的關(guān)鍵,一方面其可以通過減少ROS的產(chǎn)生直接抑制破骨細胞的分化,另一方面激活Nrf2/ARE信號通路可以通過控制細胞內(nèi)ROS信號傳導(dǎo)來調(diào)節(jié)破骨細胞的分化[14]。HO-1作為Nrf2下游的靶點,對于破骨細胞的分化同樣具有負向調(diào)節(jié)作用,Nrf2/HO-1途徑通過抑制NF-κB信號的傳導(dǎo)來抑制NF-κB受體激活配體(RANKL)誘導(dǎo)的破骨細胞分化[15]。Nrf2對成骨細胞的影響主要體現(xiàn)在保護其免受氧化損傷方面。研究發(fā)現(xiàn),增加 GSH/GSSG比率可以通過 PI3K/Akt-Nrf2信號通路減弱ROS對成骨細胞的氧化損傷[16],在MC3T3-E1細胞中miR-455-3p的過表達通過負向調(diào)控組蛋白去乙酰酶(histone deacetylases,HDACs),并激活Nrf2/ARE途徑促進成骨細胞增殖分化,并且減輕了OP小鼠氧化應(yīng)激損傷[17]。由此可見,Nrf2通過多種途徑促進骨形成,抑制骨吸收,在維持骨穩(wěn)態(tài)中扮演著重要角色。

3 Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與OP的相關(guān)性

3.1 Nrf2調(diào)控氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是引起OP的重要危險因素,其誘導(dǎo)的DNA損傷、細胞凋亡和細胞衰老是導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因[18]。氧化應(yīng)激可以增加破骨細胞的活性,減少成骨細胞活性和分化,并增加成骨細胞和骨細胞的凋亡。氧化應(yīng)激中NF-κB受體激活配體(RANKL)上調(diào)和骨保護素(OPG)下調(diào)引起破骨細胞的生成增加,成骨細胞活性降低導(dǎo)致OPG生成減少。這種降低進一步改變了總的RANKL/OPG比率,使成骨細胞和破骨細胞活性失衡而導(dǎo)致骨密度的降低[19],在OP當中,機體氧化應(yīng)激與衰老、雌激素降低密切相關(guān),雌激素的減少導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)紊亂,使骨骼更容易受到氧化損傷,最終引起氧化應(yīng)激,增加患OP的風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn),卵巢切除的大鼠超氧化物歧化物酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平明顯降低,同時也增加了大鼠血清骨鈣素、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和RANKL的表達[20]。Nrf2作為調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子,其控制一系列抗氧化反應(yīng)元件依賴性基因的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)表達,對于氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)涉及多個途徑[21]。并且多項研究表明,Nrf2通過調(diào)控氧化應(yīng)激在維持骨穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用。

3.2 Nrf2調(diào)控炎癥

炎癥微環(huán)境的改變是引起OP的另一重要危險因素。研究發(fā)現(xiàn),在女性O(shè)P患者當中,促炎標志物白細胞介素IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)血清水平明顯高于對照組[22]。炎癥與骨質(zhì)流失和破骨細胞的形成密切相關(guān),TNF-α可以直接作用于破骨細胞,與RANKL協(xié)同作用,促進破骨細胞生成。TNF-α還通過調(diào)節(jié)成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的表達抑制間充質(zhì)基質(zhì)細胞(mesenchymal stromal cell,MSC)向成骨細胞的分化[23],IL-1β則可以通過NF-κB的機制增強TNF-α誘導(dǎo)的破骨細胞的形成[24]。Nrf2通過調(diào)節(jié)抗炎基因的表達來抑制炎癥的進展,在NF-κB被氧化應(yīng)激激活時,相關(guān)促炎因子將會過量產(chǎn)生[25],NF-κB的活化也會抑制成骨細胞的分化[26]。Nrf2的激活可以阻止促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄上調(diào),HO-1及其代謝產(chǎn)物在Nrf2介導(dǎo)下具有顯著的抗炎作用,可以降低TNF-α和IL-6的水平[27]。研究發(fā)現(xiàn),激活Nrf2介導(dǎo)HO-1表達升高,抑制NF-κB信號通路,能夠有效減輕雄性SD大鼠肝移植模型腸黏膜損傷和緊密連接功能障礙[28]。在面對炎癥刺激時,Nrf2通過抑制促炎細胞因子的過度生成以及刺激下游抗炎基因的表達并抑制NF-κB的激活有效發(fā)揮抗炎作用,調(diào)控炎癥反應(yīng)。

3.3 Nrf2調(diào)控自噬

自噬是細胞自我更新的方式之一,其將自身的細胞質(zhì)蛋白質(zhì)或細胞器吞噬成囊泡,與溶酶體融合形成自噬溶酶體,并降解溶酶體內(nèi)容物,實現(xiàn)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細胞更新[29]。自噬與骨髓間充質(zhì)干細胞、成骨細胞以及破骨細胞的增殖分化、功能發(fā)揮密切相關(guān),自噬活性水平的失調(diào)會擾亂骨穩(wěn)態(tài)的平衡,從而介導(dǎo)OP的發(fā)生發(fā)展[30]。研究發(fā)現(xiàn),通過對小鼠刪除自噬相關(guān)負調(diào)節(jié)基因RUBCN后,提高了小鼠成骨細胞的分化和礦化能力,以及參與成骨細胞功能的相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達也得到增高[31]。Nrf2對自噬的調(diào)控是與自噬銜接蛋白p62相互作用實現(xiàn)的,p62的磷酸化增加了其與keap1的親和力,并且誘導(dǎo)Nrf2靶點的表達[32]。Tang等[33]研究發(fā)現(xiàn)敲除Nrf2后,降低了椎間盤變性小鼠自噬相關(guān)基因的表達,而且在氧化應(yīng)激條件下,自噬作為Nrf2/keap1/p62途徑激活的一種抗氧化反應(yīng),以保護椎間盤免受變性。由此可見,Nrf2可能通過Nrf2/keap1/p62途徑誘導(dǎo)自噬,調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)。

3.4 Nrf2調(diào)控鐵死亡

鐵死亡(ferroptosis)是一種新型程序性細胞死亡方式,其特點是鐵代謝異常和脂質(zhì)過氧化的紊亂。鐵死亡的發(fā)生與過量的Fe2+以“芬頓反應(yīng)”的方式氧化脂質(zhì)、產(chǎn)生大量的ROS有關(guān)[34]。目前,國內(nèi)外已有大量研究表明鐵死亡與OP有著密切的關(guān)系。鐵過載在一定程度上抑制成骨細胞的活性、增殖及礦化能力,并導(dǎo)致ROS累積,降低了谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)蛋白的表達,最終誘導(dǎo)成骨細胞鐵死亡導(dǎo)致骨穩(wěn)態(tài)失衡而引起OP[35]。Nrf2在調(diào)控鐵死亡方面同樣起到了不可忽視的作用。多種抑制脂質(zhì)過氧化與鐵死亡的蛋白質(zhì)和酶都是Nrf2的靶基因,例如鐵蛋白的輕鏈(FTL)和重鏈(FTH1)、鐵轉(zhuǎn)運蛋白(SLC1A2)等受到Nrf2調(diào)控,此外抑制鐵死亡的兩個關(guān)鍵靶點GPX4和胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運蛋白(xCT)均是Nrf2下游轉(zhuǎn)錄靶標[36]。Nrf2可以直接或者間接調(diào)節(jié)GPX4的表達和功能,而Nrf2/Keap1信號通路的激活上調(diào)了xCT促進細胞增殖并抑制鐵死亡[37-38]。p62/Keap1/Nrf2途徑的激活也能夠有效抑制細胞鐵死亡,p62介導(dǎo)的Keap1的降解有助Nrf2的活化,之后Nrf2通過激活下游基因NQO-1、HO-1和以及FTH1的轉(zhuǎn)錄使細胞免受鐵死亡[39]。研究表明,褪黑素能夠通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的成骨細胞鐵死亡,提高成骨細胞的功能,并且改善了糖尿病骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis,DOP)大鼠的骨微觀結(jié)構(gòu)[40]。綜上,Nrf2對于鐵死亡的調(diào)控是以Nrf2為中心,通過多種途徑實現(xiàn),一方面是直接調(diào)控鐵死亡的關(guān)鍵標志物GPX4及關(guān)鍵靶點xCT,另一方面通過調(diào)控其下游靶基因防止脂質(zhì)過氧化及鐵過載從而抑制鐵死亡。

圖1 Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與骨質(zhì)疏松癥Fig.1 Nrf2 regulatory network and osteoporosis

4 中醫(yī)藥通過Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)治療OP

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將OP歸為“骨痿、骨痹”等范疇,并且認為OP的發(fā)生與腎密切相關(guān),腎虛是OP發(fā)病的根本原因[41],腎主骨生髓,腎虛則髓化生無源,無以充養(yǎng)骨骼從而引起OP。近年來研究證實多種補腎類中藥單體及其成分、復(fù)方以及中成藥通過Nrf2途徑調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥等方面在治療OP中效果顯著。見表1。

表1 中醫(yī)藥通過Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)治療骨質(zhì)疏松癥的作用機制Table 1 Mechanism of action of traditional Chinese medicine treating osteoporosis through Nrf2 regulatory network

4.1 中藥活性成分

多種具有補腎之功的中藥單體及其活性成分具有顯著的抗OP作用。槲皮素是杜仲中主要類黃酮提取物,研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠通過發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激以及調(diào)節(jié)細胞凋亡來協(xié)調(diào)骨代謝,調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)[42]。淫羊藿被廣泛應(yīng)用于抗炎、抗OP等多種疾病,淫羊藿苷是淫羊藿中主要的黃酮類化合物,Nrf2信號在淫羊藿苷發(fā)揮藥理作用中起到關(guān)鍵作用[45]。Nrf2是中藥活性成分在治療OP中的關(guān)鍵靶點。

4.2 中藥復(fù)方

4.2.1左歸丸:左歸丸具有壯水濟火、純補無瀉之功用。研究發(fā)現(xiàn),左歸丸提高了過氧化氫誘導(dǎo)的乳鼠顱骨成骨細胞中SOD的含量,降低了MDA含量,并且增加了HO-1和Nrf2蛋白的表達,表明左歸丸通過激活Nrf2/HO-1信號通路,降低成骨細胞氧化損傷程度,發(fā)揮保護作用[51]。

4.2.2二仙湯:二仙湯由具有溫腎陽、補腎精之功效。體內(nèi)外研究顯示,二仙湯增加了TNF-α誘導(dǎo)的成骨細胞中Akt的磷酸化,并且激活了Nrf2、HO-1的表達,減弱了OP大鼠模型中TNF-α的產(chǎn)生,并保護成骨細胞免受TNF-α誘導(dǎo)的細胞凋亡,結(jié)果表明二仙湯可能通過調(diào)控Akt /Nrf2/HO-1信號通路減輕OP[52]。

4.2.3二仙藥對:二仙藥對從二仙湯化裁而來,即淫羊藿-仙茅藥對,兩藥相須配伍,補腎強筋之功效增強。在高糖環(huán)境下成骨細胞中ROS含量增加,最終發(fā)展為DOP,二仙藥對通過激活高糖環(huán)境下成骨細胞中Nrf2的表達,下調(diào)ROS含量,改善高糖成骨細胞氧化應(yīng)激損傷,從而有效防治DOP[53]。

4.3 中成藥

4.3.1正清風(fēng)痛寧:正清風(fēng)痛寧的主要成分是青藤堿,青藤堿是中藥青藤根莖中的提取物。有研究發(fā)現(xiàn),青藤堿通過調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細胞中可溶性免疫抑制因子,具有抗炎、抗關(guān)節(jié)炎、免疫抑制、抑制破骨細胞分化等廣泛的藥理作用[54]。吳春根等[55]學(xué)者通過研究指出,正清風(fēng)痛寧可以激活Nrf2/SIRT3/SOD2信號通路、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而促進成骨分化以及抑制破骨分化,提高OP大鼠模型骨密度,改善醋酸潑尼松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松。

4.3.2復(fù)方鹿茸健骨膠囊:復(fù)方鹿茸健骨膠囊具有補腎壯骨、調(diào)和氣血功效的功效,有顯著的抗OP作用[56]。研究表明,復(fù)方鹿茸健骨膠囊通過激活Nrf2/HO-1信號通路,抑制過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡,維持氧化還原穩(wěn)態(tài),同時增加成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因RUNX2、Osterix(Osx)等表達,從而有效發(fā)揮抗OP作用[57]。

5 總結(jié)與展望

OP的發(fā)病與機體氧化應(yīng)激引起的炎癥水平升高以及脂質(zhì)過氧化和鐵過載誘導(dǎo)的成骨細胞鐵死亡等因素密切相關(guān)。Nrf2是一種內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子,主要作用是保護細胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)。Nrf2能夠通過一系列途徑,激活下游抗氧化基因的表達,在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵的作用。Nrf2及其下游靶基因通過調(diào)控細胞自噬、抗炎、抑制鐵死亡等,是治療OP中的一個重要的靶點。中醫(yī)藥無論是單體、復(fù)方還是中成藥通過Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在治療OP中效果顯著,優(yōu)勢明顯,但是中醫(yī)藥通過Nrf2調(diào)控鐵死亡以及以Nrf2為靶點調(diào)節(jié)細胞自噬水平在治療OP方面的研究較少。因此,在未來的研究中應(yīng)該更加深入中醫(yī)藥通過Nrf2調(diào)控網(wǎng)絡(luò)治療OP的研究,為中醫(yī)藥治療OP提供新的方向。