甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 的選育

付增娟 王 良 趙尚敏 鄂圓圓 張自強(qiáng) 李曉東 張必周白 晨 鄭文哲 索寧寧 周曉華 孫夢(mèng)媛 張惠忠 張 輝

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所/內(nèi)蒙古自治區(qū)甜菜品種遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.赤峰市巴林左旗農(nóng)牧技術(shù)推廣中心 內(nèi)蒙古赤峰 024000）

甜菜是世界上最重要的兩大糖料作物之一，選育性狀優(yōu)良、抗病、適宜機(jī)械化作業(yè)、單胚率高、雄性不育的種質(zhì)及單胚雄性不育雜交種是現(xiàn)代甜菜育種的主攻方向和主導(dǎo)趨勢(shì)。 利用核質(zhì)互作型雄性不育系與授粉系間進(jìn)行雜交獲得最大程度的雜種優(yōu)勢(shì)以提高甜菜的產(chǎn)量水平和品質(zhì)水平， 而單胚種的特性既能滿足種子丸?；募庸ば枨?， 利于機(jī)械化作業(yè)實(shí)施，又能減少勞動(dòng)用工，同時(shí)也是推廣甜菜紙筒育苗、精量播種、節(jié)水灌溉、機(jī)械化管理等配套綜合栽培設(shè)施的基礎(chǔ)， 因而單胚雄性不育雜交種可使甜菜綜合經(jīng)濟(jì)效益得以提升[1]。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）是植物普遍存在的一種現(xiàn)象，在生產(chǎn)應(yīng)用與基礎(chǔ)研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)，成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）選育是當(dāng)代甜菜育種的核心技術(shù)[2]，作為甜菜雜交種最主要的骨干親本材料， 其選育進(jìn)程直接決定了甜菜新品種的創(chuàng)制。 歐美國(guó)家早已不使用產(chǎn)量偏低的甜菜多胚品種， 利用單胚雄性不育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)型品種是當(dāng)今世界甜菜育種的主流， 也是我國(guó)甜菜育種的主攻目標(biāo)。 利用單胚雄性不育系配制雜交種的優(yōu)點(diǎn)是制種省力、雜交率高、原種可控、雜種高產(chǎn)、單胚種子便于機(jī)械化精量點(diǎn)播和紙筒育苗移栽[3]。 如何快速準(zhǔn)確選育出優(yōu)異親本材料配制出優(yōu)良雜交組合是新品種選育的關(guān)鍵。 甜菜屬于二年生異花授粉作物，種質(zhì)資源鑒選、親本材料選育、雜交組合配制等各環(huán)節(jié)選育進(jìn)程均較其他一年生作物繁復(fù)， 尤其對(duì)于核心親本甜菜單胚雄性不育系選育更為復(fù)雜， 一年生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的農(nóng)藝性狀、 二年生生殖生長(zhǎng)階段的農(nóng)藝性狀、 配合力高低等諸多性狀均需依據(jù)育種目標(biāo)審慎考慮。 本文作者對(duì)甜菜單胚雄性不育系NM3005A 選育過(guò)程中的主要育性、 胚數(shù)性、 配合力、 抗叢根病性、 細(xì)胞質(zhì)類型、 花藥和花粉表型等重要性狀進(jìn)行了闡述。

1 親本來(lái)源

甜菜單胚雄性不育系NM3005A 是內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)2013 年6 月以從多胚授粉系HBB-1 繁殖田中發(fā)現(xiàn)的雄性不育株為母本，以從美國(guó)引進(jìn)的單胚材料960767 和內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院自育的抗叢根病材料N98122 雜交改良出的單胚育種材料為授粉系進(jìn)行多代回交選育而成。

2 選育過(guò)程

2013 年采取人工授粉套紙袋雜交的方法， 對(duì)發(fā)現(xiàn)的雄性不育單株用改良創(chuàng)制出的單胚保持系進(jìn)行雜交，收獲F1種子；同年進(jìn)行南育加代。

2014-2020 年采用成對(duì)套袋方法進(jìn)行回交選育，不育系NM3005A 在育性表型鑒定中， 完全不育型和半不育Ⅰ型不育株率由61.90%提升至98.00%（表1）；在胚數(shù)性表型鑒定中， 單胚率由最初的0 提升至98.00%（表2），期間根據(jù)育種目標(biāo)對(duì)其產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、抗病性等進(jìn)行選擇，收獲BC1F1～BC4F1代種子。

表1 單胚雄性不育系NM3005A 選育育性表現(xiàn)

表2 單胚雄性不育系NM3005A 選育胚數(shù)性表現(xiàn)

2021-2022 年進(jìn)行產(chǎn)量、品質(zhì)、抗叢根病性、配合力等試驗(yàn)鑒定。在2 年的產(chǎn)量、品質(zhì)水平鑒定中，甜菜單胚雄性不育系NM 3005A的平均產(chǎn)量62 460.00 kg/hm2，平均含糖率15.80%，平均產(chǎn)糖量9 868.68 kg/hm2，產(chǎn)糖量較對(duì)照雜交品種KWS1197 （CK） 降低19.74%；甜菜單胚雄性不育保持系NM3005B 平均產(chǎn)量55 920.00 kg/hm2，平均含糖率15.51%，平均產(chǎn)糖量8 673.19 kg/hm2， 產(chǎn)糖量較對(duì)照雜交品種KWS1197降低29.46%（表3）。

表3 NM3005A 及NM3005B 的產(chǎn)量、品質(zhì)鑒定結(jié)果

抗叢根病性鑒定試驗(yàn)在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院甜菜叢根病病圃中進(jìn)行，甜菜單胚雄性不育系NM3005A叢根病病情指數(shù)為25， 單胚雄性不育保持系NM3005B 叢根病病情指數(shù)為28，為中抗抗叢根病類型，叢根病病情指數(shù)較對(duì)照雜交品種（CK）分別降低4 和1，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性（表4）。

采用不完全雙列雜交法進(jìn)行配合力測(cè)定， 以自育多胚種品系NR-Z1、N98122、N98122×NR-Z1、HBI-1、NR-Z3-3 為測(cè)驗(yàn)種， 對(duì)NM3005A 等5 個(gè)單胚雄性不育系進(jìn)行根產(chǎn)量配合力測(cè)定。 結(jié)果表明，單胚雄性不育系NM3005A 根產(chǎn)量一般，配合力（GCA）為最高，一般配合力效應(yīng)值為1.47，表現(xiàn)出較高的一般配合力（表5）。

表5 單胚雄性不育系NM3005A 根產(chǎn)量一般配合力測(cè)定

3 成系鑒定

3.1 育性和單胚性表型鑒定

不育系NM3005A 及保持系NM3005B 二年生生殖生長(zhǎng)階段育性、胚數(shù)性鑒定試驗(yàn)于2023 年4 月在內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣單胚雄性不育系成系鑒定圃進(jìn)行，成系鑒定不育系及保持系按1∶1 比例分行栽植，每個(gè)材料栽植100 株，株行距40 cm×60 cm。在甜菜盛花期， 由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院組織， 聘請(qǐng)哈爾濱工業(yè)大學(xué)、 內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)研究院等國(guó)內(nèi)甜菜專家組成鑒定組， 對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物研究所選育出的甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B 進(jìn)行了田間育性和單胚性表型現(xiàn)場(chǎng)鑒定。

3.1.1 單胚雄性不育系 NM3005A 鑒定結(jié)果鑒定株數(shù)87 株，其中完全不育株86 株，半不育Ⅰ型1 株，完全雄性不育率為98.85%； 單胚株87 株， 單胚株率100%。

3.1.2 單胚雄性不育保持系 NM3005B 鑒定結(jié)果鑒定株數(shù)83 株， 其中不育株0 株， 可育株率為100%；單胚株83 株，單胚株率100%。

3.2 分子細(xì)胞質(zhì)類型鑒定

利用F.V.Owen 型甜菜細(xì)胞質(zhì)類型快速鑒定技術(shù)， 采用已開(kāi)發(fā)的TR1 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)NM3005A 及NM3005B 細(xì)胞質(zhì)類型進(jìn)行鑒定。

3.2.1 TR1 引物系列 TR1：

5'-AGAACTTCGATAGGCGAGAGG-3'

5'-GCAATTTTCAGGGCATGAACC-3'

3.2.2 DNA 提取與檢測(cè) 在成系鑒定圃中分別隨機(jī)選取NM3005A 及NM3005B 植株各20 株，將甜菜生長(zhǎng)期新鮮幼嫩葉片單株取樣裝入PE 管中，置入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，利用植物基因組DNA 提取試劑盒提取甜菜葉片DNA 并進(jìn)行DNA 質(zhì)量檢測(cè)。

3.2.3 PCR 反應(yīng)體系及PCR 程序 甜菜細(xì)胞質(zhì)基因型鑒定PCR 反應(yīng)體系首先用ddH2O 將DNA 樣品稀釋到40～50 ng/μL，反應(yīng)體系25 μL，其中DNA 模板1 μL、 上下游TR1 引物各1 μL、MIX 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR 程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min， 共30 個(gè)循環(huán)；72℃進(jìn)一步延伸10 min，4℃+∞；4℃保存。 電泳檢測(cè)用PCR 產(chǎn)物5 μL， 使用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中電泳，電泳電壓120 V，電泳時(shí)長(zhǎng)30 min。用凝膠成像系統(tǒng)紫外光下檢測(cè)電泳結(jié)果。

3.2.4 結(jié)果分析 PCR 電泳結(jié)果顯示， 單胚雄性不育系NM3005A 的細(xì)胞質(zhì)類型為S 型， 單胚雄性不育保持系NM3005B 的細(xì)胞質(zhì)類型為N2 型。 由圖1可知， 泳道M 為DL 100 Marker， 泳道1 ～10 為NM3005A，條帶位置在450 bp，細(xì)胞質(zhì)類型為S 型；泳道11～20 為NM3005B，條帶位置在530 bp，細(xì)胞質(zhì)類型為N2 型。

圖1 部分NM 3005A、NM 3005B 材料PCR 電脈檢測(cè)結(jié)果

3.3 電子顯微鏡花藥及花粉粒檢測(cè)鑒定

利用掃描電子顯微鏡對(duì)NM3005A 及NM3005B進(jìn)行花藥及花粉粒檢測(cè)鑒定。

3.3.1 取樣和固定 選取NM3005A 及NM3005B 采種株開(kāi)花前未開(kāi)放的花蕾， 用生理鹽水清洗試樣表面， 將清洗后的試樣放入由0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液配制的2%～3%戊二醛固定液中進(jìn)行前固定，4℃下前固定2 h 以上。經(jīng)戊二醛固定的生物試樣用與前固定相同的緩沖液充分漂洗后， 加入相同緩沖液配制的1%四氧化鋨固定液，4℃下固定1～2 h。

3.3.2 脫水和置換 采用濃度分別為50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水， 每級(jí)濃度脫水5～15 min。 吸棄100%脫水劑，轉(zhuǎn)入醋酸異戊酯與脫水劑1∶1 的混合液中置換10～20 min， 并適當(dāng)搖動(dòng)，再轉(zhuǎn)入純醋酸異戊酯中充分置換。

3.3.3 干燥和粘樣 脫水后的生物試樣選用臨界點(diǎn)干燥法進(jìn)行干燥。 粘樣采用導(dǎo)電雙面膠帶將試樣粘接在掃描電鏡樣品臺(tái)上，使試樣觀察面朝上。

3.3.4 表面導(dǎo)電處理 采用離子濺射法對(duì)干燥后的生物試樣表面噴鍍一層導(dǎo)電鍍層。

3.3.5 電鏡掃描 開(kāi)啟掃描電鏡， 待真空度達(dá)到儀器規(guī)定的高真空指標(biāo)后進(jìn)行觀察前的儀器檢查，對(duì)中電子束，消除圖像的像散。 關(guān)閉電子槍發(fā)射后對(duì)樣品室放氣，按要求將試樣裝入樣品室，重新抽真空。根據(jù)生物試樣的觀察要求，設(shè)置掃描電鏡觀察條件。打開(kāi)電子槍束流，選擇需要的信號(hào)檢測(cè)器，獲得二次電子掃描圖像或背散射電子掃描圖像。 根據(jù)觀察需要選擇合適的放大倍率，進(jìn)行圖像聚焦、消像散、亮度和反差調(diào)節(jié)等操作。 對(duì)目標(biāo)區(qū)域生物試樣形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行圖像記錄。

3.3.6 電鏡掃描圖像結(jié)果 對(duì)不育系及其保持系的花藥、花粉的生物學(xué)特性進(jìn)行比較觀察。 結(jié)果表明，甜菜單胚雄性不育系NM3005A 及保持系NM3005B的花藥和花粉在形態(tài)與細(xì)胞上存在明顯差異。 不育系NM3005A 花藥發(fā)育不正常， 形狀不規(guī)則且干癟；花粉粒為不規(guī)則類球形，表面粘稠且不光滑，花粉敗育。 保持系NM3005B 花藥發(fā)育正常，形狀規(guī)則且藥室飽滿；花粉粒為圓球形，表面光滑，萌發(fā)孔清晰可見(jiàn)（圖2～圖5）。

圖2 不育系花藥

圖3 不育系花粉

圖4 保持系花藥

圖5 保持系花粉

4 結(jié)語(yǔ)

雄性不育在植物中較為常見(jiàn)。 植物雄性不育表現(xiàn)特征為雌蕊發(fā)育正常而雄蕊敗育， 但雌蕊能夠接受外來(lái)花粉授粉從而達(dá)到授精目的[4]。 有研究表明，已經(jīng)在140 多種植物中觀察到了植物雄性不育特征， 并且細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生與線粒體基因組突變有著密切的關(guān)系[5-6]，如農(nóng)作物水稻[7]、煙草[8]、玉米[9]等中都有雄性不育現(xiàn)象。 也正是因?yàn)樾坌圆挥档拇嬖冢?在很大程度上促進(jìn)了雜種優(yōu)勢(shì)在農(nóng)作物中的應(yīng)用，從而使得作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[10-11]。

甜菜的雄性不育系分為核不育型和質(zhì)核互作型2 種。 核不育型是受一對(duì)隱性基因（aa）控制，而質(zhì)核互作型其育性由細(xì)胞質(zhì)基因S、N 和細(xì)胞核基因X、Z基因的相互作用決定的[12]，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)為S 型，細(xì)胞核基因型為xxzz 時(shí)， 則為不育系； 細(xì)胞質(zhì)為N 型細(xì)胞核為xxzz 時(shí)，則為保持系[13]。通過(guò)對(duì)Owen 型不育系（S 型）和正?？捎担∟ 型）線粒體的測(cè)序結(jié)果分析， 發(fā)現(xiàn)N 型具有S 型所沒(méi)有的4 個(gè)開(kāi)放讀碼框（ORF）。 顯然，這4 個(gè)ORF 相關(guān)基因很可能與細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)， 所以推測(cè)CMS 是一種功能獲取而不是功能缺失的突變[14]。

甜菜質(zhì)核互作基因型不育系是目前唯一用于世界范圍生產(chǎn)甜菜雜交種的雄性不育系[15]，作為生產(chǎn)一代雜種的理想親本品系， 其選育及應(yīng)用研究一直是育種工作者研究的熱點(diǎn)。 甜菜雜種優(yōu)勢(shì)利用關(guān)鍵在于選育甜菜不育系技術(shù)， 而選育不育系的關(guān)鍵在于選育甜菜保持系[16]。 雜交種具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，因此甜菜雄性不育系及保持系的選育在現(xiàn)代甜菜育種中至關(guān)重要，能為解決甜菜種子“卡脖子”問(wèn)題、打好種業(yè)翻身仗奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。