注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)研究*

王 曄，劉 驊，王辰雯，馬 莉

（1. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051； 2. 海南衛(wèi)康制藥有限公司，海南 ?？?570100）

泮托拉唑鈉為質(zhì)子泵抑制劑，通過(guò)特異性作用于胃黏膜細(xì)胞而抑制胃酸分泌，主要用于治療消化性潰瘍、反流性食管炎等［1-2］。2020年版《中國(guó)藥典（四部）》9102 藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則中規(guī)定，雜質(zhì)檢查分析方法應(yīng)專屬、靈敏，主成分與雜質(zhì)和降解產(chǎn)物均應(yīng)能分開，檢測(cè)限應(yīng)滿足限度檢查的要求［3］。2020年版《中國(guó)藥典（二部）》中，采用高效液相色譜法測(cè)定，以主成分自身對(duì)照法計(jì)算注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)，且系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中僅規(guī)定了泮托拉唑鈉與氧化降解產(chǎn)物的分離度，不能有效區(qū)分、控制相關(guān)雜質(zhì)［4］?！睹绹?guó)藥典》《歐洲藥典（11.0 版）》中對(duì)有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F 均以混合物進(jìn)行雜質(zhì)控制，不利于產(chǎn)品質(zhì)量控制［5-6］。為此，本研究中采用加校正因子的自身對(duì)照法測(cè)定注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)，以提高雜質(zhì)的質(zhì)量控制水平?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司），配有二極管陣列檢測(cè)器（PDA）；XS105DR 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬(wàn)分之一）。

1.2 試藥

泮托拉唑鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100575 - 201505）；雜質(zhì)A 對(duì)照品（C16H15N3O5F2S，批號(hào)為CAS127780 - 16 - 9），雜質(zhì)B 對(duì)照品（C16H15F2N3O3S，批號(hào)為CAS102625-64-9），雜質(zhì)C對(duì)照品（C8H6F2N2OS，批號(hào)為CAS97963-62-7），雜質(zhì)D+F對(duì)照品（《美國(guó)藥典》商品化對(duì)映異構(gòu)體混合物對(duì)照品C17H17F2N3O4S，批號(hào)為CAS624742-53-6，雜質(zhì)D 含量為58.5%，雜質(zhì)F 含量為41.5%），雜質(zhì)E 對(duì)照品（C32H28F4N6O8S2，批號(hào)為CAS2115779-15-0），均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F色譜定位用對(duì)照品（自制，雜質(zhì)D，批號(hào)為HX - PTL2 - D -2018，含量為99.95%；雜質(zhì)F，批號(hào)為HX - PTL2 - F -2019，含量為98.31%）；磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，默克美國(guó)Sigma 化學(xué)公司）；水為二次蒸餾純凈水；注射用泮托拉唑鈉（安徽某企業(yè)，編號(hào)為1-6，規(guī)格為每瓶40 mg）。

2 泮托拉唑鈉有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱Thermo Hypersil ODS C18柱（125 mm×4.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 為0.01 mol/ L 磷酸二氫鉀緩沖液（用20%磷酸調(diào)pH 至7.0），B 為水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm（雜質(zhì)A，B，E，D + F）和305 nm（雜質(zhì)C）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。在此色譜條件下，各雜質(zhì)均能有效分離。色譜圖見圖1。

1. 雜質(zhì)C 2. 雜質(zhì)A 3. 泮托拉唑 4. 雜質(zhì)D + F 5. 雜質(zhì)E 6. 雜質(zhì)B圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Impurity C 2.Impurity A 3.Pantoprazole 4.Impurity D + F 5.Impurity E 6.Impurity BFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

分別取有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)A，B，C，D+F，E 對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋成每1 mL 含0.1 mg的溶液，搖勻，作為各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液。

取泮托拉唑鈉對(duì)照品適量，精密稱定，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀釋成每1 mL 含泮托拉唑2 mg 的溶液，搖勻，作為泮托拉唑鈉對(duì)照品貯備液。

精密量取各雜質(zhì)對(duì)照品貯備液0.1 mL、泮托拉唑鈉對(duì)照品貯備液2 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）稀釋并定容，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

取樣品，精密稱定，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg / L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀釋成每1 mL含泮托拉唑鈉0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

取輔料，按樣品工藝與處方制備空白輔料樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，作為空白輔料溶液。

參考國(guó)外藥典自身對(duì)照為0.1%的濃度，供試品溶液色譜圖任何小于對(duì)照品溶液主峰面積0.5 倍的峰忽略不計(jì)。精密量取供試品溶液0.1 mL，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）定容，搖勻，作為自身對(duì)照溶液。

2.3 各雜質(zhì)校正因子計(jì)算

雜質(zhì)A，B，D + F，E 的校正因子均在0.9～1.1 之間，于290 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)含量時(shí)校正因子按1.0 計(jì)算；雜質(zhì)C 的校正因子約為0.3，于305 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)含量時(shí)校正因子按0.3計(jì)算。結(jié)果見表2。

表2 各雜質(zhì)相對(duì)于泮托拉唑鈉主峰的校正因子Tab.2 Correction factors of various impurities relative to the main peak of pantoprazole sodium

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：空白輔料溶液及配伍溶劑（0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液）均不干擾注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，且于290 nm 和305 nm 波長(zhǎng)處雜質(zhì)A - F 間，以及與泮托拉唑鈉間的分離度均理想，表明方法的專屬性良好。色譜圖見圖2。

a. 雜質(zhì)A b. 雜質(zhì)B c. 雜質(zhì)C d. 雜質(zhì)D + F e. 雜質(zhì)E f. 泮托拉唑1. 系統(tǒng)適用性溶液 2. 空白溶劑 3. 空白輔料溶液 4. 葡萄糖注射液 5. 氯化鈉注射液A.290 nm B.305 nm圖2 專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖a.Impurity A b.Impurity B c.Impurity C d.Impurity D + F e.Impurity E f.Pantoprazole1.System suitability solution 2.Blank solvent 3.Blank excipient solution 4.Glucose Injection 5.Sodium Chloride InjectionA.290 nm B.305 nmFig.2 HPLC chromatograms of the specificity test

干擾試驗(yàn)：1）酸破壞。取樣品1 瓶，加0.1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 破壞1 h 后，加0.1 mol / L 氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg / L）mL 中和，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。2）堿破壞。取樣品1 瓶，加1 mol/ L 氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/ L）mL破壞16 h后，加1 mol/L 鹽酸溶液1 mL中和，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。3）氧化破壞。取樣品1 瓶，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，加0.3%過(guò)氧化氫1 mL，破壞20 min 后，加溶劑稀釋并定容，搖勻，立即進(jìn)樣。4）光照破壞。取樣品1瓶，光照5 000 lx破壞30 d，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。5）高溫破壞。取樣品1瓶，60 ℃高溫破壞30 d，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。對(duì)樣品及空白輔料進(jìn)行酸、堿、高溫、光照、氧化強(qiáng)制降解試驗(yàn)［7-8］。結(jié)果經(jīng)酸、堿、高溫、光照、氧化破壞后檢測(cè)，主峰處均未檢出有關(guān)物質(zhì)，主峰純度符合規(guī)定。各降解雜質(zhì)均不干擾目標(biāo)雜質(zhì)的檢測(cè)，分離度良好。雜質(zhì)C 在光照破壞條件下增加明顯；雜質(zhì)D + F 在高溫破壞條件下增加明顯，在光照條件下呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；雜質(zhì)A在氧化破壞條件下增加顯著。色譜圖見圖3。

1. 泮托拉唑 2. 雜質(zhì)A 3. 雜質(zhì)C 4. 雜質(zhì)D + FA. 酸破壞 B. 堿破壞 C. 氧化破壞 D. 光照破壞 E. 高溫破壞圖3 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Pantoprazole 2.Impurity A 3.Impurity C 4.Impurity D + FA.Acid damage B.Alkaline damage C.Oxidative damage D.Light damage E.High - temperature damageFig.3 HPLC chromatograms of the destructive test

檢測(cè)限確定：按色譜圖信噪比（S/N）為3∶1 計(jì)算各雜質(zhì)及泮托拉唑鈉的檢測(cè)限。結(jié)果雜質(zhì)A，B，C，D+F，E及泮托拉唑鈉的檢測(cè)限分別為0.24，0.29，0.80，0.71，0.30，0.30 ng，均遠(yuǎn)低于擬訂的雜質(zhì)限度，表明方法靈敏度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：24 h內(nèi)供試品溶液中雜質(zhì)C 含量及總雜含量明顯增長(zhǎng)，供試品溶液臨用新配，自身對(duì)照溶液24 h內(nèi)峰面積RSD變化較小，表明溶液穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：各雜質(zhì)按雜質(zhì)限度50%，100%，150%加標(biāo)至供試品溶液中，每個(gè)濃度平行3份，扣除樣品基底，計(jì)算加樣回收率及RSD。各雜質(zhì)的加樣回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5 雜質(zhì)D+F 檢測(cè)

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

流動(dòng)相：A 為0.01 mol/L 磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 至7.0），B為水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脫（程序見表3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm；其余色譜條件同2.1 項(xiàng)下。取雜質(zhì)D + F 對(duì)照品和泮托拉唑鈉對(duì)照品各適量，精密稱定，加乙腈適量使溶解，并用氫氧化鈉溶液（質(zhì)量濃度為40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）稀釋成每1 mL含泮托拉唑0.4 mg、雜質(zhì)D+F 2.4 μg 的溶液，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。結(jié)果出峰順序依次為泮托拉唑、雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F。雜質(zhì)D 和F 的分離度為1.1，基本達(dá)到基線分離，空白溶劑、空白輔料及其他雜質(zhì)峰對(duì)雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F的檢測(cè)均無(wú)干擾。色譜圖見圖4。

1. 泮托拉唑 2. 雜質(zhì)D 3. 雜質(zhì)F圖4 雜質(zhì)D和雜質(zhì)F的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖1.Pantoprazole 2.Impurity D 3.Impurity FFig.4 HPLC chromatogram of the system suitability test of impurities D and F

表3 調(diào)整后的流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.3 Gradient elution program of the mobile phase after the adjustment（%）

2.5.2 方法學(xué)考察

檢測(cè)限確定：按色譜圖S/N為3∶1 計(jì)算雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F 的檢測(cè)限，結(jié)果雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F 的檢測(cè)限均為0.01 μg/mL，供試品溶液主峰質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL（相當(dāng)于主成分的0.002%），表明該色譜系統(tǒng)靈敏度適合檢測(cè)雜質(zhì)D和雜質(zhì)F。

加樣回收試驗(yàn)：分別配制相當(dāng)于雜質(zhì)限度50%，100%，150%的加標(biāo)供試品溶液，每個(gè)濃度平行3 份，扣除樣品基底，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F 的加樣回收率均在90%～110%范圍內(nèi)，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.6 注射用泮托拉唑鈉中有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制訂及樣品測(cè)定

由圖1 可知，泮托拉唑鈉主峰及雜質(zhì)D +F 分離度達(dá)到3.0 以上，采用自身對(duì)照法，供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)的峰面積（雜質(zhì)C 于305 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)）分別乘以相應(yīng)的校正因子后與自身對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算各雜質(zhì)含量。結(jié)果見表4。擬訂雜質(zhì)A - F 分別不得過(guò)0.2%，0.1%，0.2%，0.5%，0.1%，0.5%，其他單個(gè)雜質(zhì)含量不得過(guò)0.2%，總雜質(zhì)不得過(guò)1.0%。其中，雜質(zhì)含量均相當(dāng)于泮托拉唑標(biāo)示量。

表4 6批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果（%）Tab.4 Results of the content determination of related substance in six batches of samples（%）

3 討論

注射用泮托拉唑鈉在國(guó)內(nèi)臨床使用范圍很廣［9-10］，對(duì)有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格合理控制，可保證藥品使用的安全性和可靠性［11-12］。2020年版《中國(guó)藥典（二部）》中收載的注射用泮托拉唑鈉采用主成分自身對(duì)照法配制了1%自身對(duì)照溶液［13］，規(guī)定“最大單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.5 倍（0.5%），總雜質(zhì)峰不得大于對(duì)照溶液主峰面積（1%）”，但僅規(guī)定最大單個(gè)雜質(zhì)限度在0.5%不夠合理和客觀。前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，泮托拉唑鈉及雜質(zhì)A，B，D + F 均于290 nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收，雜質(zhì)C 和E 于305 nm 波長(zhǎng)附近有最大吸收，參考《美國(guó)藥典》選擇雜質(zhì)A，B，D+F，E及主峰泮托拉唑鈉均于290 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)；雜質(zhì)C 于290 nm 波長(zhǎng)處斜率大，受波長(zhǎng)影響較大，故選擇雜質(zhì)C 的檢測(cè)波長(zhǎng)為305 nm［14-16］。該品種使用常見的C18液相色譜柱及2.1 項(xiàng)下色譜條件的流動(dòng)相梯度系統(tǒng)，檢出多個(gè)雜質(zhì)，且系統(tǒng)適用性溶液中各雜質(zhì)分離度符合要求。建議完善注射用泮托拉唑鈉的有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，并納入新版藥典。所制訂的雜質(zhì)限度可滿足該品種的有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量控制，且雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F 得到有效分離，雜質(zhì)D 和雜質(zhì)F的含量計(jì)算較國(guó)外藥典用雜質(zhì)D+F 混合物含量計(jì)算更合理。