高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價訶子藥材質(zhì)量

張煒文，袁 靜

（江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226000）

訶子來源于使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz. 或絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt. 的干燥成熟果實，性平，味苦、酸、澀，歸肺、大腸經(jīng)，臨床用于治療久瀉久痢、便血脫肛、肺虛喘咳、久嗽不止、咽痛音啞等癥?，F(xiàn)代研究表明，訶子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、降糖、護(hù)肝等藥理學(xué)作用［1-3］。訶子藥材含多種化學(xué)成分，其中主要含鞣質(zhì)類和酚酸類［4-6］。2020年版《中國藥典（一部）》僅收載了訶子藥材的鑒別、檢查和浸出物含量［7］，為完善訶子的質(zhì)量控制方法，本研究中建立了不同產(chǎn)地訶子藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，結(jié)合指紋圖譜的相似度計算及化學(xué)計量學(xué)分析方法［8-9］，對收集的18 批訶子藥材進(jìn)行綜合評價。并采用一測多評法［10］對莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸8 個成分進(jìn)行測定，利用外標(biāo)法驗證其科學(xué)性和可行性，為訶子的質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 Waters 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ABS-135S 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KH-250SPV型臺式雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

沒食子酸對照品（批號為110831-201906，純度為91.5%），鞣花酸對照品（批號為111959-201903，純度為88.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；莽草酸對照品（批號為138 - 59 - 0），訶子酸對照品（批號為18942-26-2），柯里拉京對照品（批號為23094-69-1），沒食子酸甲酯對照品（批號為99-24-1），沒食子酸乙酯對照品（批號為831-61-8），訶黎勒酸對照品（批號為18942 - 26 - 2），純度均不低于98.0%，均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；訶子藥材（編號為S1-S18，樣品信息見表1），經(jīng)江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校張志義副教授鑒定為正品；甲醇（分析純，西隴科技股份有限公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；水為超純水。

表1 18批訶子藥材樣品信息Tab.1 Information of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬Diamonsil Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時10%A，10～20 min 時10%A →25%A，20～25 min 時25%A →30%A，25～33 min 時30%A →45%A，33～40 min 時45%A →50%A，40～46 min 時50%A →60%A，46～50 min 時60%A →10%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸對照品各適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）使溶解，制成莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸質(zhì)量濃度分別為992.8，1 502.0，365.7，1 604.0，205.4，2 988.0，980.4，1 473.0 μg/mL 的混合對照品貯備液；精密量取3 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸質(zhì)量濃度分別為119.1，180.2，43.9，192.5，24.6，358.6，117.6，176.8 μg/ mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取藥材粉末（過3 號篩）0.50 g，精密稱定，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別精密吸取2.2項下供試品溶液和混合對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果8 個成分與相鄰色譜峰間的分離度均大于2.0，理論板數(shù)按莽草酸峰、沒食子酸峰、沒食子酸甲酯峰、柯里拉京峰、沒食子酸乙酯峰、訶黎勒酸峰、鞣花酸峰、訶子酸峰計均大于8 900，且8 個成分的對稱因子在0.95～1.11之間。色譜圖見圖1。

2. 莽草酸 7. 沒食子酸 11. 沒食子酸甲酯 14. 柯里拉京15. 沒食子酸乙酯 16. 訶黎勒酸 20. 鞣花酸 22. 訶子酸A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 系統(tǒng)適用性試驗高效液相色譜圖2.Shikimic acid 7.Gallic acid 11.Methyl gallate 14.Corilagin 15.Ethyl gallate 16.Chebulagic acid 20.Ellagic acid 22.Chebulinic acidA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

精密度試驗：取2.2項下供試品溶液（編號為S1）適量，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次。結(jié)果共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為S1），按2.2 項下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1），按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，6，12，18，24 h 時按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立與分析

2.4.1 指紋圖譜建立與相似度評價

取18批訶子藥材粉末（過3號篩），按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，將18批樣品的色譜圖CDF格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版），以編號為S1的藥材樣品的色譜圖為參照圖譜，按中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正自動匹配生成指紋圖譜［11］，結(jié)果見圖2。對18 批訶子藥材進(jìn)行相似度評價，結(jié)果相似度均大于0.95。詳見表2。

圖2 18批訶子藥材的高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC overlay fingerprints of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

表2 18批訶子藥材的相似度Tab.2 Similarity of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2.4.2 共有峰指認(rèn)

由圖3 可知，18 批藥材樣品有23 個共有峰，通過與混合對照品溶液HPLC 圖（圖1 A）比對，指認(rèn)出2 號峰為莽草酸，7號峰為沒食子酸，11號峰為沒食子酸甲酯，14號峰為柯里拉京，15號峰為沒食子酸乙酯，16號峰為訶黎勒酸，20 號峰為鞣花酸，22 號峰為訶子酸。選擇峰形較好，與相鄰色譜峰分離完全，峰面積響應(yīng)值及保留時間適中的14號峰柯里拉京為參照峰（S）。

2. 莽草酸 7. 沒食子酸 11. 沒食子酸甲酯 14. 柯里拉京15. 沒食子酸乙酯 16. 訶黎勒酸 20. 鞣花酸 22. 訶子酸圖3 訶子藥材共有峰高效液相色譜對照圖譜2.Shikimic acid 7.Gallic acid 11.Methyl gallate 14.Corilagin 15.Ethyl gallate 16.Chebulagic acid 20.Ellagic acid 22.Chebulinic acidFig.3 HPLC reference chromatogram of the common peak of Terminaliae Chebulae Fructus

2.4.3 化學(xué)計量學(xué)分析

聚類分析：采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，以18批訶子藥材的23 個共有峰峰面積為變量，采用組間聯(lián)接法對其進(jìn)行聚類分析［12］。當(dāng)判別條件距離為15 時，18 批訶子藥材被聚為2 類，其中編號為S17 和S18 的樣品聚為一類，其余樣品聚為一類。詳見圖4。

圖4 18批訶子藥材的系統(tǒng)聚類樹狀圖Fig.4 Dendrogram for the systematic clustering of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

主成分分析：以18 批訶子藥材的23 個共有峰峰面積為變量進(jìn)行主成分分析［13-14］，以主成分特征值大于1為依據(jù)，提取得到5 個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為84.088%，表明這5個主成分能代表23個共有峰在18 批樣品中84.088%的信息。詳見表3。根據(jù)初始因子載荷矩陣及特征值計算特征向量，由此計算5個主成分的得分（F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4，F(xiàn)5），以5 個主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重系數(shù)，計算綜合得分（F）。F=（47.231% ×F1+13.963% ×F2+ 10.784% ×F3+ 6.906% ×F4+5.204%×F5）/84.088%。結(jié)果青海產(chǎn)訶子藥材（編號為S17，S18）的綜合得分最高，質(zhì)量較好，不同產(chǎn)地及同一產(chǎn)地不同批次訶子藥材質(zhì)量存在一定差異，表明產(chǎn)地與訶子藥材的質(zhì)量差異有關(guān)。詳見表4。

表3 主成分特征值與方差分析結(jié)果Tab.3 Characteristic values and analysis of variance results of principal components

表4 18批訶子藥材樣品主成分得分與排名Tab.4 Score and ranking of principal components of 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus

2.5 一測多評法測定訶子藥材中8 個成分的含量

2.5.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項下混合對照品貯備液適量，加甲醇依次稀釋為不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品溶液的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、各成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表5。

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.5 Results of the linear relation test

精密度試驗：精密量取2.2 項下混合對照品溶液10 μL，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.85%，0.96%，1.02%，0.54%，0.71%，0.39%，0.87%，1.22%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為S1）粉末（過3號篩）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，6，10，16，24 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.91%，1.05%，1.24%，0.86%，1.63%，1.47%，0.82%，1.31%（n= 6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取穩(wěn)定性試驗項下供試品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算訶子藥材中上述8 個成分含量及RSD值。結(jié)果莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的平均含量分別為12.33，18.76，4.52，20.15，2.53，37.44，12.25，15.47 mg/ g，RSD分別為0.96%，1.26%，1.38%，1.04%，1.62%，1.81%，0.99%，1.54%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號為S1）粉末（過3號篩）0.25 g，精密稱定，共6 份，置具塞錐形瓶中，分別加入2.2 項下混合對照品貯備液3.0 mL，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，計算8個成分的加樣回收率。結(jié)果莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、柯里拉京、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的平均加樣回收率分別為98.75%，96.98%，97.52%，98.65%，98.22%，97.96%，99.02%，98.36%，RSD分別為1.42%，1.63%，1.02 %，0.89%，1.36%，1.24%，1.66%，1.18%（n=6），表明方法回收率良好。

2.5.2 相對校正因子（RCF）計算

采用多點(diǎn)校正法，以柯里拉京為內(nèi)參物，計算莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的RCF。取2.5.1項下線性關(guān)系考察中的系列濃度對照品溶液的峰面積，按公式計算平均RCF值，作為定量用RCF。fsi=fs/fi=（As×Ci）/（Cs×Ai）。式中，Ai為待測成分峰面積；Ci為待測成分濃度；As為內(nèi)參物峰面積；Cs為內(nèi)參物濃度；fsi為RCF［15-16］。結(jié)果見表6。

表6 訶子藥材中7個成分的相對校正因子Tab.6 Relative correction factors of seven components in Terminaliae Chebulae Fructus

2.5.3 RCF 耐用性考察

精密量取2.2 項下混合對照品溶液10 μL，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別考察不同品牌高效液相色譜儀、不同色譜柱（規(guī)格均為250 mm × 4.6 mm，5 μm）和不同柱溫對沒食子酸、莽草酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的RCF 的影響。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=3），表明不同色譜儀、色譜柱和柱溫對沒食子酸、莽草酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的RCF 無顯著影響。詳見表7和表8。

表7 不同高效液相色譜儀及色譜柱對相對校正因子和相對保留時間的影響（n=3）Tab.7 Effects of different HPLC instruments and chromatographic columns on RCF and RRT（n = 3）

表8 不同柱溫對相對校正因子和相對保留時間的影響（n=3）Tab.8 Effect of different column temperatures on RCF and RRT（n = 3）

2.5.4 待測色譜峰定位

根據(jù)2.5.3項下耐用性考察結(jié)果，以柯里拉京峰為參照峰，計算莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸相對于柯里拉京的相對保留時間（RRT）。結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=3），表明不同儀器、色譜柱和柱溫對莽草酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸的RRT影響較小，故可以RRT作為色譜峰的定位。詳見表7和表8。

2.5.5 一測多評法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果比較

取18 批（編號為S1 - S18）訶子藥材粉末（過3 號篩）適量，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別采用一測多評法和外標(biāo)法計算18 批訶子藥材中8 個成分的含量。采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對2 種方法測定結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，考察一測多評法的準(zhǔn)確性。結(jié)果莽草酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸、沒食子酸乙酯、訶黎勒酸、鞣花酸、訶子酸一測多評法與外標(biāo)法含量測定結(jié)果無顯著差異（P=0.413，0.394，0.438，0.092，0.248，0.559，0.546），表明一測多評法可用于測定訶子藥材中8 個成分的含量。詳見表9。

表9 18批訶子藥材中8個成分含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.9 Results of the content determination of eight components in 18 batches of Terminaliae Chebulae Fructus（mg / g，n = 3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

分別考察4種流動相（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液）的梯度洗脫效果，結(jié)果以乙腈- 0.1%磷酸溶液為流動相時，色譜峰峰形較好、色譜峰較多。利用二極管陣列檢測器在190～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描混合對照品溶液，并參考文獻(xiàn)［17-19］，最終選擇270 nm作為檢測波長。

3.2 提取方法考察

分別考察了不同提取溶劑（不同濃度甲醇和乙醇）、不同提取方法（加熱回流和超聲）、不同提取時間（20，40，60 min）對提取效果的影響，綜合考慮測定結(jié)果和可操作性，確定以70%甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min為提取方法。

3.3 指紋圖譜分析

本研究中建立了18 批訶子藥材的HPLC 指紋圖譜，共確定了23 個共有峰，相似度均大于0.95，表明云南、廣東、廣西、海南、新疆、青海6個產(chǎn)地的訶子藥材質(zhì)量的一致性較好。其中，編號為S17 和S18 的訶子藥材的相似度較其他批次高。聚類分析結(jié)果顯示，訶子藥材可聚為2類，編號為S17和S18的樣品聚為一類，其余樣品聚為一類，與相似度評價結(jié)果一致。主成分分析結(jié)果顯示，降維生成的5個主成分能代表共有峰84.088%的信息。通過計算18 批訶子藥材的綜合得分，編號為S17和S18的樣品的綜合得分最高，分別為1.735，2.290，與相似度分析、聚類分析和主成分分析結(jié)果一致，表明產(chǎn)地為青海的訶子藥材的質(zhì)量較好。

3.4 方法評價

本研究中建立的HPLC指紋圖譜結(jié)合一測多評法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，能較好地對訶子藥材進(jìn)行綜合質(zhì)量評價，可為訶子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和臨床使用提供參考。