經(jīng)典名方二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)高效液相色譜指紋圖譜建立*

吳建明，華 杰，丁京偉，朱 婷，葉志學(xué)

（浙江維康藥業(yè)股份有限公司，浙江 麗水 323000）

二冬湯由天冬、麥冬、天花粉、黃芩、知母、甘草、人參、荷葉組方，具有潤(rùn)肺、清胃功效，主治肺燥所致消渴，癥見(jiàn)煩渴不止、小便頻數(shù)、脈數(shù)無(wú)力等。臨床常用于治療糖尿病、百日咳、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、陰虛咳嗽、甲狀腺功能亢進(jìn)癥（簡(jiǎn)稱(chēng)甲亢）、糖尿病合并甲亢、糖尿病前期、尿崩癥、慢性胃炎、慢性咽炎、支氣管擴(kuò)張等，療效確切［1-11］?，F(xiàn)收錄于國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，可按國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥注冊(cè)分類(lèi)及申報(bào)資料要求》分類(lèi)中的3.1 類(lèi)古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑要求，通過(guò)簡(jiǎn)化注冊(cè)程序研發(fā)古代經(jīng)典名方二冬湯復(fù)方制劑。為保證復(fù)方制劑與傳統(tǒng)湯劑安全性和臨床療效的一致性，需制訂經(jīng)典名方基準(zhǔn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，作為參照標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化制劑的生產(chǎn)工藝和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。指標(biāo)成分定性鑒別和定量分析難以反映物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量。標(biāo)準(zhǔn)參照物的質(zhì)量是專(zhuān)屬性鑒別和多成分、整體質(zhì)量控制的重復(fù)保證。指紋圖譜具有整體和特征定性鑒別作用，可全面、定性地評(píng)價(jià)中藥復(fù)方的質(zhì)量，反映中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并從藥材、飲片、對(duì)應(yīng)實(shí)物進(jìn)行特征成分追蹤，反映其真?zhèn)巍Ｒ虼?，本研究中建立了二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀［連接G6530C 型四極桿- 飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q - TOF -MS），配有獨(dú)立四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）和電噴霧離子源（ESI）］，1260Ⅱ型高效液相色譜儀，均購(gòu)于Agilent 科技有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，Inertsil ODS - 4 色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），Inertsil ODS-3色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），均購(gòu)于日本Shimadzu 公司；Tnature C18色譜柱［（250 mm×4.6 mm，5 μm），華譜科技有限公司］；BK-900B 型超聲儀（濟(jì)南巴克超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；MS205DU 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 集團(tuán)，精度為十萬(wàn)分之一）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；LD610-2 型電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子科技有限公司，精度為百分之一）；SQP 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；DK-98-Ⅱ型萬(wàn)用電爐（天津泰斯特儀器有限公司）；HWS - 26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

天冬飲片粉末（批號(hào)為T(mén)D-200313），麥冬飲片粉末（批號(hào)為MD-201127），黃芩飲片粉末（批號(hào)為HQ-200202），知母飲片粉末（批號(hào)為ZM-201205），天花粉飲片粉末（批號(hào)為T(mén)HF-201228），荷葉飲片粉末（批號(hào)為HY-201112），人參飲片粉末（批號(hào)為RS-201127），甘草飲片粉末（批號(hào)為GC-201017），二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)（批號(hào)分別為D - 21082601，D - 21082602，D -21082603，D - 21082604，D - 21082605，D - 21082606，D - 21082607，D - 21082608，D - 21082609，D -21082610，D - 21082611，D - 21082612，D - 21082613，D-21082614，D-21082615，編號(hào)為S1-S15），均購(gòu)于浙江維康藥業(yè)股份有限公司；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715 - 201821，純度為95.4%），漢黃芩苷（批號(hào)為112002-201702，純度為98.5%），甘草酸對(duì)照品（批號(hào)為110731-201720，純度為97.7%），芒果苷對(duì)照品（批號(hào)為111607 - 201704，純度為98.1%），黃芩素對(duì)照品（批號(hào)為111595-201607，純度為98.5%），金絲桃苷對(duì)照品（批號(hào)為110521-201809，純度為94.9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為170803，純度不低于98%）；乙腈（色譜純，瑞典Oceanpak公司，批號(hào)為22100410G404）；乙酸銨（色譜純，批號(hào)為20210410），冰醋酸（色譜純，批號(hào)為20190110），均購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)為2020070110）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Inertsil ODS - 4 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.05 mol/L 乙酸銨溶液-冰醋酸（取3.85 g乙酸銨溶于1 000 mL水中，加入30 mL冰醋酸），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)應(yīng)不低于2 500。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program（%）

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，即得。

供試品溶液：取二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

單味藥材供試品溶液：取飲片粉末，天冬0.6 g，麥冬0.9 g，黃芩、知母、天花粉、荷葉各0.3 g，人參、甘草各0.2 g，精密稱(chēng)定，分別加水50 mL，煎煮30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，分別加70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加70%乙醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2 項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液和空白溶劑（70%乙醇），按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶劑（70%乙醇）對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液黃芩苷峰對(duì)應(yīng)位置有相同色譜峰，且主要成分均有體現(xiàn)，表明方法專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖1。

1. 黃芩苷A. 空白溶劑（70%乙醇） B. 對(duì)照品溶液 C. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.BaicalinA.Blank solvent（70% ethanol） B.Reference solution C Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗(yàn)：取二冬湯基準(zhǔn)（批號(hào)為D-21080501）1 g，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算相似度。結(jié)果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于2.0%（n= 6），相似度均大于0.90，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)（批號(hào)為D -21080501）1 g，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24，36，48 h 時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算相似度。結(jié)果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于2.0%（n=8），相似度均大于0.90，表明供試品溶液放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)為（批號(hào)為D -21080501）1 g，精密稱(chēng)定，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算相似度。結(jié)果指紋圖譜中色譜峰峰形良好，相對(duì)保留時(shí)間的RSD小于2.0%（n=6），相似度均大于0.90，表明方法重復(fù)性良好。

耐用性試驗(yàn)：分別考察不同流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果流速為1.2 mL/min 時(shí)9 號(hào)峰前移，綜合考慮效率，固定流速為1.0 mL/min。分別考察不同柱溫（25，30，35 ℃）對(duì)分離效果的影響，結(jié)果色譜圖中各共有峰的峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，分離度良好，相似度為1.00，表明不同柱溫條件下該方法的耐用性良好。分別考察不同色譜柱對(duì)分離效果的影響，結(jié)果色譜柱為Inertsil ODS-4 時(shí)分離效果最佳，其余色譜柱分離效果不佳且信息量減少，故采用Inertsil ODS-4柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）不同S/N號(hào)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果各共有峰峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，分離度良好，相似度為1.00，表明不同色譜柱間該方法的耐用性良好。分別考察不同色譜儀，結(jié)果色譜圖中各共有峰的峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)，分離度良好，相似度為1.00，表明不同儀器間該方法的耐用性良好。

2.4 二冬湯指紋圖譜建立

2.4.1 指紋圖譜共有峰標(biāo)定

取15 批（編號(hào)為S1-S15）二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以15 批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC 圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，形成共有模式圖，采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版），選擇15 批樣品指紋圖譜中穩(wěn)定性較好、響應(yīng)值適宜的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定9個(gè)共有峰。詳見(jiàn)圖2。

圖2 二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.2 HPLC overlay fingerprints of Erdong Decoction substance reference

2.4.2 對(duì)照?qǐng)D譜建立

以15 批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC 圖譜色譜峰進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成共有模式圖；采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）建立對(duì)照?qǐng)D譜，結(jié)果見(jiàn)圖3。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，確認(rèn)芒果苷（峰1）、金絲桃苷（峰3）、黃芩苷（峰4）、千層紙素A - 7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷（峰6）、漢黃芩苷（峰7）、甘草酸（峰8）、黃芩素（峰9）；經(jīng)質(zhì)譜指認(rèn)，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸（峰2）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（峰5）。

2.4.3 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）對(duì)15批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)與對(duì)照指紋圖譜的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果相似度最低為0.992，均大于0.90，故選擇指紋圖譜作為二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，詳見(jiàn)表2。暫訂本品與二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜比較的相似度不得低于0.90。

表2 15批二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2 Similarity evaluation results of fingerprints of 15 batches of Erdong Decoction substance reference

2.4.4 藥味峰歸屬

取2.2 項(xiàng)下單味藥材供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，確定物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜中各峰的藥味歸屬（圖4）。峰1（芒果苷）為知母色譜峰，峰2（槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸）、峰3（金絲桃苷）為荷葉色譜峰，峰8（甘草酸）為甘草色譜峰，峰4（黃芩苷）、峰5（芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷）、峰6（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、峰7（漢黃芩苷）、峰9（黃芩素）為黃芩色譜峰。

1. 芒果苷 2. 槲皮素- 3 - O - 葡萄糖醛酸 3. 金絲桃苷4. 黃芩苷 5. 芹菜素- 7 - O - 葡萄糖醛酸苷 6. 千層紙素A - 7 - O - β - D - 葡萄糖醛酸苷 7. 漢黃芩苷 8. 甘草酸9. 黃芩素a. 二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn) b. 天冬 c. 麥冬 d. 黃芩 e. 知母f. 天花粉 g. 荷葉 h. 人參 i. 甘草圖4 藥味歸屬高效液相色譜對(duì)比圖1.Mangiferin 2.Quercetin - 3 - O - glucuronide 3.Hyperoside 4.Baicalin 5.Apigenin - 7 - O - glucuronide 6.Oroxylin A - 7 - O -β - D - glucuronide7.Wogonoside 8.Glycyrrhizic acid 9.Baicalein a.Erdong Decoction substance reference b.Asparagi Radix c.Ophiopogonis Radix d.Scutellariae Radix e.Anemarrhenae Rhizoma f.Trichosanthis Radix g.Nelumbinis Folium h.Ginseng Radix et Rhizoma i.Glycyrrhizae Radix et RhizomaFig.4 HPLC chromatogram of medicinal taste attribution

3 討論

3.1 流動(dòng)相選擇

查閱二冬湯中天冬、麥冬［12-14］、天花粉［15］、黃芩［16］、知母［17］、甘草［18］、人參［19］、荷葉［20］的HPLC 指紋圖譜方法，初步選擇乙腈為流動(dòng)相的有機(jī)相。曾以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相，色譜峰多集中于16～42 min，前后信息量較少；后調(diào)整為乙腈-0.2%醋酸，通過(guò)優(yōu)化，色譜峰集中于前60 min 內(nèi)，但15～25 min 的色譜峰分離度不佳；通過(guò)優(yōu)化，調(diào)整為乙腈-0.05 mol/L 乙酸銨-冰醋酸，分離效果優(yōu)于前者，圖譜信息量較大，色譜峰較多，且各色譜峰分離度較好。最終確定流動(dòng)相A 為乙腈，流動(dòng)相B 為0.05 mol/L 乙酸銨溶液-冰醋酸，進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 供試品溶液制備方法選擇

以色譜峰個(gè)數(shù)、整體分布呈現(xiàn)等為指標(biāo)，考察供試品溶液提取溶劑（70%乙醇、稀乙醇、70%甲醇）超聲處理30 min 后所得色譜峰的差異。結(jié)果在同一洗脫條件下，色譜峰信息量、響應(yīng)值均相差不大，且基線平穩(wěn)程度基本一致。并結(jié)合黃芩苷含量測(cè)定方法，最終選擇70%乙醇為提取溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，供試品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，通過(guò)等吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析，結(jié)果色譜峰在250～300 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的信息量較大。分別選取240，250，254，260，280，300，320 nm 波長(zhǎng)處的色譜峰響應(yīng)值進(jìn)行分析，結(jié)果于254 nm 波長(zhǎng)處較適中，色譜峰信息量較大，基線較平穩(wěn)。故最終檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm。

3.4 參照物選擇

黃芩苷色譜峰保留時(shí)間適中，響應(yīng)值較高，達(dá)到基線分離，且黃芩苷較穩(wěn)定，故選擇黃芩苷色譜峰作為對(duì)照品參照峰，標(biāo)記為峰S，同時(shí)將黃芩苷對(duì)照品作為參照物。本研究中建立了二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC 指紋圖譜檢測(cè)方法，通過(guò)15批樣品的測(cè)定，確定了對(duì)照指紋圖譜及9個(gè)共有峰，暫訂相似度不得低于0.90。

3.5 色譜峰指認(rèn)

本研究中通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)指紋圖譜中色譜峰指認(rèn)，獲得超高效液相色譜-紫外光譜圖和超高效液相色譜-質(zhì)譜總離子流圖。結(jié)合質(zhì)譜初步指認(rèn)出了其中9個(gè)成分，質(zhì)譜分析結(jié)果與共有峰指認(rèn)結(jié)果對(duì)應(yīng)關(guān)系如下，峰1（芒果苷）為知母色譜峰，峰2（槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸）、峰3（金絲桃苷）為荷葉色譜峰，峰4（黃芩苷）、峰5（芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷）、峰6（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷）、峰7（漢黃芩苷）、峰9（黃芩素）為黃芩色譜峰，峰8（甘草酸）為甘草色譜峰，該結(jié)果為下一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。

3.6 方法評(píng)價(jià)

該方法易操作、結(jié)果可靠，可用于二冬湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制。