鼻腔用冷敷凝膠的急性毒性及纖毛毒性實(shí)驗(yàn)研究

嚴(yán)國(guó)鴻，林亞娟，胡博志，徐偉，王曉穎

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；3.藍(lán)佳堂生物醫(yī)藥<福建>有限公司，福建 福州 350007)

鼻黏膜容易受到外來有害物質(zhì)或致敏性物質(zhì)的侵?jǐn)_，從而引發(fā)鼻充血、鼻炎，繼而可能會(huì)造成耳部不適、干擾聽覺、影響發(fā)音，甚至?xí)绊懰?。配合藥物治療，緩解局部癥狀的鼻腔用敷料成為臨床需求之一[1-3]。藍(lán)佳堂生物醫(yī)藥(福建)有限公司研發(fā)的由卡波姆、聚乙二醇、卵黃分離物、薄荷腦等組成的鼻腔用冷敷凝膠Ⅱ型(簡(jiǎn)稱鼻腔凝膠)，針對(duì)鼻黏膜局部癥狀使用，令使用部位的毛細(xì)血管收縮，減輕局部充血，黏膜神經(jīng)末梢的敏感性降低，可以達(dá)到冷敷的目的；并有助于緩解急慢性鼻炎、過敏性鼻炎、鼻竇炎及普通感冒等引起的不適癥狀(如：鼻塞、鼻痛、鼻干癢、流鼻涕、打噴嚏等)，也可用于鼻竇術(shù)后或放療后的冷敷護(hù)理，適合臨床需求。

鼻腔制劑或敷料使用后，由于其組成成分的影響，鼻纖毛運(yùn)動(dòng)常會(huì)受到不同程度的損害，甚至可使纖毛運(yùn)動(dòng)不可逆的停止，影響鼻纖毛的清除功能，故對(duì)鼻纖毛毒性的影響是鼻腔制劑或敷料的重要研究?jī)?nèi)容之一[4-5]。本實(shí)驗(yàn)采用牛蛙上顎離體法，對(duì)鼻腔凝膠的鼻纖毛毒性進(jìn)行了研究[6-7]，并以高于臨床給藥濃度100倍的鼻腔凝膠濃縮液，測(cè)定該鼻腔凝膠的急性毒性，為鼻腔冷敷凝膠的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠，清潔級(jí)，雌性，體重24～33 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2016-0002。

1.2 試劑 冷敷凝膠Ⅱ型(鼻腔)[藍(lán)佳堂生物醫(yī)藥(福建)有限公司,批號(hào)：L01332101]；脫氧膽酸鈉(美侖生物有限公司，批號(hào)：S0802A)。

1.3 儀器 Nikon YS100型生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 急性毒性評(píng)價(jià)

2.1.1 急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn) 取20只ICR小鼠，雌雄各半。給藥前禁食不禁水 12 h 后進(jìn)行稱重。體重相近的4只為一組，共5組。再隨機(jī)從各組中取2只作為給藥組，剩余10只作為生理鹽水對(duì)照組。按小鼠灌胃最大給藥劑量為0.3 mL/10 g，最多不超過1.0 mL/只，灌胃鼻腔凝膠，其濃度為臨床制劑濃度的100倍。給藥后記錄小鼠體重、外觀、行為、飲食、分泌物、排泄物的變化。

2.1.2 小鼠一日最大耐受量(MTD)的測(cè)定 因鼻腔凝膠用最大允許濃度和最大允許容量給予動(dòng)物時(shí)仍未能測(cè)出LD50，為進(jìn)一步研究該鼻腔凝膠的毒性情況，做一日最大耐受量(MTD)測(cè)定。取 ICR小鼠20只，按0.3 mL/10 g劑量進(jìn)行灌胃給藥，間隔6 h給藥1次。給藥3次后連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠給藥后外觀(體重、皮膚毛發(fā)、眼和黏膜的變化)、行為、飲食、分泌物、排泄物及其中毒和死亡情況，生理鹽水組按上述同法操作。

2.2 鼻纖毛毒性

2.2.1 鼻纖毛毒性考察方法[6-7]為考察鼻腔凝膠對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)的影響，選擇牛蛙上顎黏膜作為動(dòng)物模型。將牛蛙脊髓搗毀后，仰臥固定于自制蛙板上，使口腔張開，用止血鉗牽拉，用膠頭滴管往上顎黏膜滴加3滴鼻腔凝膠，使黏膜完全被藥物淹沒。接觸10 min后用手術(shù)剪小心分離上顎黏膜，分割成3 mm×3 mm的黏膜。用生理鹽水洗去血塊及雜物，纖毛面向上平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于40×10倍的光學(xué)顯微鏡下觀察纖毛擺動(dòng)及脫落情況。觀察后立即將載玻片擱置于含有飽和蒸餾水的層析缸中，密閉 (環(huán)境溫度20～25 ℃，水蒸氣近飽和狀態(tài))。黏膜表面間隔30 min給藥0.2 mL，每隔20 min從展開缸取出觀察，直至纖毛停止運(yùn)動(dòng)。將從給鼻腔凝膠開始到纖毛停止擺動(dòng)的時(shí)間(PVD)記錄下來。纖毛停止擺動(dòng)后，用生理鹽水沖洗黏膜上的鼻腔凝膠，繼續(xù)觀察纖毛擺動(dòng)可否恢復(fù)，并記錄下纖毛恢復(fù)運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間。另取陽性對(duì)照組(1%去氧膽酸鈉)、空白對(duì)照組(生理鹽水)處理方法同上，觀察其纖毛擺動(dòng)情況。

2.2.2 纖毛毒性評(píng)價(jià)方法[8]纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間的百分率(PPV)=鼻腔凝膠組(或陽性對(duì)照組)的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間/生理鹽水對(duì)照組的纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間。PPV 越高，表示鼻腔凝膠組(或陽性對(duì)照組)對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)影響越小，即對(duì)纖毛毒性越小。

3 結(jié)果

3.1 急毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

3.1.1 急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 小鼠給予鼻腔凝膠或生理鹽水后，均出現(xiàn)短暫靜臥，大約 1 h 后恢復(fù)正常，均無小鼠死亡情況。鼻腔凝膠組與生理鹽水組小鼠，大、小便顏色正常，毛色光澤。連續(xù)觀察7 d，分別于給予鼻腔凝膠或生理鹽水后每天同一時(shí)間稱量各組小鼠的體重。結(jié)果(見表 1)數(shù)據(jù)表明各劑量組小鼠體重與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。給藥后 14 d 各組小鼠無死亡、無異常反應(yīng)。處死小鼠，解剖后，檢測(cè)各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、胰腺、大腸、小腸等主要臟器體積、顏色、質(zhì)地均無明顯改變，故無法測(cè)得 LD50。

3.1.2 小鼠MTD測(cè)定結(jié)果 給予鼻腔凝膠或生理鹽水后動(dòng)物表現(xiàn)均無異常,除第 1 天小鼠灌胃后出現(xiàn)短暫不適，活動(dòng)減少以外，均未見小鼠中毒與死亡。結(jié)果(見表2)表明鼻腔凝膠組小鼠體重與生理鹽水組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。給予鼻腔凝膠或生理鹽水后7 d 各組小鼠均無死亡及任何異常反應(yīng)。處死小鼠后觀察其心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、胰腺、大腸及小腸等主要臟器體積、顏色、質(zhì)地均無明顯改變。本實(shí)驗(yàn)給予小鼠的鼻腔凝膠濃度為成品濃度的100倍，日累積劑量為臨床成人擬推薦日用劑量的160倍。表明鼻腔凝膠型臨床應(yīng)用的安全性較高。

表1 一日最大給藥量各組小鼠體重變化(n=20)

表2 一日最大耐受量各組小鼠體重變化(n=20)

3.2 鼻纖毛毒性試驗(yàn)結(jié)果 顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，生理鹽水組和鼻腔凝膠組纖毛清晰完整(如圖1A)，排列整齊，有規(guī)律地向同一方向擺動(dòng)，纖毛運(yùn)動(dòng)活躍，呈“風(fēng)吹麥浪”式擺動(dòng)[8]，且擺動(dòng)頻率極快；鼻腔凝膠組纖毛較清晰，纖毛運(yùn)動(dòng)較活躍(見圖1B)。給予脫氧膽酸鈉后，纖毛停止擺動(dòng)、纖毛邊緣基本脫離，黏膜受損較嚴(yán)重，部分基部裸露(見圖1C)，表明脫氧膽酸鈉對(duì)黏膜組織有嚴(yán)重的破壞作用，對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)有嚴(yán)重的不可逆的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)采用多次給藥牛蛙上顎黏膜，每隔30 min對(duì)牛蛙上顎黏膜滴加2 mL鼻腔凝膠，纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(187.6±66.4)min，相對(duì)運(yùn)動(dòng)百分率為69.4%，結(jié)果見表3。當(dāng)纖毛停止運(yùn)動(dòng)后，用生理鹽水沖洗黏膜上的鼻腔凝膠，纖毛恢復(fù)擺動(dòng)記錄其恢復(fù)擺動(dòng)時(shí)間為(23.6±6)min。說明該鼻腔凝膠對(duì)鼻纖毛的毒性較小，纖毛毒性可逆，可以應(yīng)用于鼻腔局部。

表3 各組纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和持續(xù)運(yùn)動(dòng)百分率

4 討論

通過急性毒性實(shí)驗(yàn)證明該鼻腔凝膠安全性良好，并且牛蛙黏膜纖毛實(shí)驗(yàn)顯示單次使用后其對(duì)纖毛運(yùn)動(dòng)無影響。本實(shí)驗(yàn)考慮鼻腔凝膠連續(xù)使用的問題，采用多次給藥方式，測(cè)得纖毛持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間的百分率為69%，纖毛停止運(yùn)動(dòng)后，用生理鹽水沖洗后纖毛可以恢復(fù)擺動(dòng)，說明對(duì)黏膜纖毛的損傷并不嚴(yán)重，但仍要注意合理的給藥間隔和給藥次數(shù)。

鼻腔凝膠為鼻腔用敷料，主要用于緩解鼻腔黏膜由于炎癥及感冒等引起的充血等不適，配合臨床藥物治療使用，減少患者的痛苦[9-10]。經(jīng)測(cè)試，鼻腔凝膠安全性良好，對(duì)鼻纖毛的毒性小，對(duì)纖毛的影響具有可逆性，可以用于鼻腔局部，在臨床應(yīng)用上有較好的應(yīng)用前景。