韋伯潘力氏小體及其內(nèi)容物對血栓形成的影響

王芳磊，龔國清

(中國藥科大學(xué)藥理學(xué)研究室，江蘇 南京 211198)

韋伯潘力氏小體(Weibel-Palade bodies,WPBs) 是一種內(nèi)皮細胞特有的雪茄型分泌細胞器，主要存在于動脈、毛細血管、靜脈和心內(nèi)膜中。WPBs儲存了血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)、P選擇素、組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator,tPA)、白介素-8、嗜伊紅素-3、血管生成素-2、內(nèi)皮素-1等多種內(nèi)容物[1]。這些內(nèi)容物通過胞吐作用分泌到內(nèi)皮細胞外，參與止血、炎癥和血管生成等多種生理病理過程。血栓是機體凝血-抗凝功能失衡時，血液中有形成分在血管內(nèi)黏附聚集形成的血塊，會造成血管部分或全部堵塞。血栓形成頻繁發(fā)生在如動脈粥樣硬化等心腦血管疾病患者和部分惡性腫瘤患者中，這一定程度上會加劇這些疾病的發(fā)生發(fā)展，嚴(yán)重威脅著人類的健康[2-3]。本文主要綜述了WPBs及其主要內(nèi)容物對血栓形成的影響。

1 WPBs及其對血栓形成的影響

內(nèi)皮細胞是血管系統(tǒng)和組織的主要邊界，負(fù)責(zé)調(diào)控代謝產(chǎn)物、其他小分子以及能夠穿透內(nèi)皮屏障的細胞的轉(zhuǎn)運，涉及復(fù)雜的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和內(nèi)皮細胞與細胞間連接的動態(tài)調(diào)控。內(nèi)皮細胞胞吐作用是抵抗血管損傷的首要保護線之一，WPBs作為內(nèi)皮特異性分泌顆粒，能夠響應(yīng)各種激動劑，快速提供止血和炎癥介質(zhì)。WPBs特殊的可彎曲的雪茄形柔性結(jié)構(gòu)增強了其在內(nèi)皮細胞細胞質(zhì)有限空間內(nèi)的可操作性[1]，這有利于在內(nèi)皮細胞受到刺激時做出快速反應(yīng)釋放其內(nèi)容物。WPBs內(nèi)容物的含量并不是一成不變的，對于不同的血管狀況需要內(nèi)皮細胞產(chǎn)生不同分泌反應(yīng)，為此WPBs會選擇性地包含或排除某些內(nèi)容物，并隨著局部微環(huán)境的需要動態(tài)控制這些內(nèi)容物的量[4]。例如，模擬層流的條件可導(dǎo)致WPBs中血管生成素-2含量降低；而暴露于促炎細胞因子會造成白介素-8上調(diào)等[4]。

新生WPBs在高爾基體中由管狀VWF結(jié)合到網(wǎng)格蛋白包被的新生囊泡中形成，新生成的WPBs包含多個與高爾基體的連接，并通過這些連接將非管狀VWF簇從高爾基體運輸至WPBs腔，這些非管狀VWF簇在WPBs中逐漸聚集成為更大的長串聚集體以促進WPBs生長[1,5]。成熟的WPBs厚約0.1 μm，長度可達3 μm。在生物發(fā)生和成熟期間，WPBs募集了一組Rab GTP酶(Rab27A、Rab3B/D和Rab15)和Rab效應(yīng)分子(MyRIP、Slp4-a和Munc13-4)，兩者相互作用介導(dǎo)WPBs與細胞骨架和質(zhì)膜的相互作用，是WPBs快速胞吐作用的基礎(chǔ)[6]。其中Rab27A與MyRIP相互作用阻止WPBs的過早分泌；Rab3D抑制胞吐作用，并控制WPBs的形成和形狀。除此之外，成熟WPBs與質(zhì)膜的最終融合還需要N-乙基馬來酰亞胺敏感因子(N-ethylmaleimide sensitive factor,NSF)和可溶性NSF附著蛋白受體(soluble NSF attachment protein receptor,SNARE)家族的蛋白介導(dǎo)。Munc13-4是Munc13蛋白家族的成員，存在于靜息內(nèi)皮細胞中的WPBs上，并且能在組胺刺激后在WPBs胞吐作用的位點處聚集。Munc13-4被認(rèn)為在SNARE介導(dǎo)的胞吐融合事件中起束縛和引發(fā)因子的作用，是誘發(fā)WPB胞吐作用的正調(diào)節(jié)因子[7]。有研究發(fā)現(xiàn)了一種膜聯(lián)蛋白A2(AnxA2)-S100A10蛋白復(fù)合物，它的S100A10亞基是Munc13-4的相互作用物[7]。

WPBs的快速分泌是對血管損傷或感染的快速反應(yīng)的基礎(chǔ)，最大限度地減少了失血和病原體的傳播[5,8]。由此我們可設(shè)想通過人為干預(yù)上述蛋白分子調(diào)節(jié)WPBs的快速分泌來尋找預(yù)防或治療血栓的新靶點。鑒于AnxA2-S100A10介導(dǎo)成熟WPB的胞吐作用以及因此釋放超長VWF纖維中的重要作用，干擾AnxA2-S100A10復(fù)合物形成可以作為控制VWF分泌的高度特異性工具，具有激活/抑制內(nèi)皮細胞血栓形成的潛能。AnxA2中的S100A10結(jié)合位點限于N末端10至12個殘基，合成包含該序列的肽可競爭性結(jié)合S100A10以破壞復(fù)合物以抑制血栓形成[9]。但這些N-末端AnxA2肽不能穿透細胞膜，因此它們在活細胞系統(tǒng)甚至生物體中的適用性受到很大限制，于是開發(fā)了一些具有膜滲透性的小分子化學(xué)抑制劑如3-羥基-1H-吡咯(5 H)-2-酮類似物和1,2,4-三唑類似物作為AnxA2與S100A10結(jié)合的抑制劑[9]。這些化合物彌補了N-末端AnxA2肽不能穿透細胞膜的缺點，并且可以特異性干擾AnxA2-S100A10復(fù)合物介導(dǎo)的血栓形成前反應(yīng)過程中內(nèi)皮細胞WPBs的對接/融合，具有優(yōu)良的抑制血栓形成的作用。

2 VWF及其對血栓形成的影響

VWF是一種多聚體黏附糖蛋白，其前體由信號肽和一段D1-D2-D′-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK的保守結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中D1D2結(jié)構(gòu)域代表前肽，D′至CK結(jié)構(gòu)域代表成熟的VWF[1]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中VWF前體去除信號肽，CK結(jié)構(gòu)域以“尾-尾”方式形成二聚體，隨后被轉(zhuǎn)運至高爾基體[10-11]。在高爾基體中前肽被弗林蛋白酶切割下來，以指導(dǎo)D′D3結(jié)構(gòu)域以“頭-頭”方式形成多聚體和進一步聚縮成小管[1,10]。VWF的修飾主要包括弗林蛋白酶切割、糖基化、氧化和硫酸化，有研究表明FAM20c (family with sequence similarity 20,member C)磷酸化VWF A2結(jié)構(gòu)域中的S1517和S1613位點，這種修飾增強了VWF與血小板的相互作用[12-13]。目前FAM20c的抑制劑的研究大多關(guān)注于癌癥、骨骼缺陷和低磷血癥，尚未有關(guān)于抗血栓的FAM20c抑制劑研究，開發(fā)針對血栓的FAM20c的抑制劑是具有一定前景的新思路。VWF主要通過三種途徑分泌，分別為基礎(chǔ)分泌，調(diào)節(jié)型分泌和組成型分泌。WPBs中高度多聚化的VWF通過基礎(chǔ)分泌和調(diào)節(jié)型分泌兩種途徑，未進入WPBs的不經(jīng)歷高度多聚化的VWF則通過組成型分泌途徑[14]?；A(chǔ)分泌持續(xù)發(fā)生，而調(diào)節(jié)型分泌是通過激動劑介導(dǎo)的內(nèi)皮活化觸發(fā)的急性途徑，在分泌過程中，WPBs的pH值逐漸增加至血液的弱堿性，致使前導(dǎo)肽解離，小管展開將超長VWF釋放到血流中參與止血和血栓形成。

VWF參與血管眾多生理與病理反應(yīng)，是止血和血栓形成的核心。內(nèi)皮細胞損傷時，WPBs快速反應(yīng)，分泌VWF至基底膜，基底膜上暴露的膠原通過與VWF A1結(jié)構(gòu)域相互作用而結(jié)合VWF，然后血小板膜上糖蛋白GPIb/IX再通過與VWF-膠原結(jié)合成復(fù)合物促使血小板初步黏附并被激活，隨后VWF與整合素結(jié)合使血小板穩(wěn)固黏附形成血栓[11,15]。同時P選擇素、血管生成素-2和骨保護素進入WPBs也需要VWF的介導(dǎo)，其中P選擇素是通過與VWF的D′D3結(jié)構(gòu)域相互作用從而被包含入WPBs，而骨保護素和血管生成素-2則是通過與VWF的A1結(jié)構(gòu)域相互作用進入WPBs。VWF對于血栓發(fā)生與發(fā)展的重要性是毋庸置疑的，開發(fā)靶向VWF的抗血栓藥物在未來具有廣闊的發(fā)展前景。

獲得性血栓性血小板減少性紫癜(acquired thrombotic thrombocytopenic purpura，aTTP)是一種由血小板在超大VWF聚集體上聚集引起的微血管血栓性疾病，病因是缺乏血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13),導(dǎo)致形成過多超大的VWF多聚體，病理性地觸發(fā)血小板聚集形成血栓。這種微血管血栓的形成會導(dǎo)致多器官缺血，并可能導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥[16]。Cablivi(Caplacizumab)是首個特異性的aTTP治療藥物，也是首個上市的納米抗體藥物。通過靶向VWF A1結(jié)構(gòu)域抑制其與血小板GPIb/IX結(jié)合，Caplacizumab減少了由VWF介導(dǎo)的血小板黏附和消耗，防止微血管血栓的形成[17]。在Caplacizumab之前，aTTP沒有特異性療法，僅能采用免疫抑制劑或血漿置換緩解，但仍具有10%～20%死亡率且易發(fā)生耐受，Caplacizumab很好地解決了這一問題。納米抗體具有分子量小的優(yōu)勢，但同時也存在半衰期短的問題，為了解決這一問題，Caplacizumab通過一個3*丙氨酸的linker，連接2個抗VWF的納米抗體以此延長半衰期。

3 P選擇素及其對血栓形成的影響

P選擇素是一種糖蛋白，在血小板和內(nèi)皮細胞上表達，分別儲存于血小板的α顆粒和內(nèi)皮細胞的WPBs中。P選擇素具有一個大內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾區(qū)，內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域是P選擇素并入WPBs的定位結(jié)構(gòu)。在受到炎癥因素等刺激時，WPBs分泌P選擇素至細胞膜與中性粒細胞和單核細胞上的P選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)相互作用進而介導(dǎo)中性粒細胞和單核細胞在內(nèi)皮細胞表面的滾動與血小板的黏附，進一步誘導(dǎo)血小板活化，擴大血栓的發(fā)生[18]。例如組胺，有研究提出組胺會喚起質(zhì)膜上攜帶P選擇素的WPBs發(fā)生胞吐作用，釋放P選擇素之后Rab46依賴性地誘導(dǎo)WPBs逆運輸至微管組織中心[19]。同時有研究發(fā)現(xiàn)在激光損傷誘導(dǎo)的血栓形成模型中，給予P選擇素阻斷抗體的VWF-/-小鼠血栓生長速率顯著降低。這些研究均表明了P選擇素對促進內(nèi)皮細胞上血栓的增殖重要性[20]。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor -γ，PPARγ)是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、血壓和胰島素敏感性等作用，在血管內(nèi)皮細胞中廣泛表達。E-V290M小鼠是一種選擇性表達顯性失活PPARγ突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。與野生型小鼠相比，E-V290M小鼠更易產(chǎn)生由氯化鐵或光化學(xué)損傷誘導(dǎo)的頸動脈血栓，其 P選擇素表達和白細胞-內(nèi)皮細胞相互作用均顯著上調(diào)。由此可推測PPARγ通過下調(diào)內(nèi)皮細胞P選擇素表達和減少P選擇素介導(dǎo)的白細胞-內(nèi)皮細胞相互作用抑制血栓形成[21]。有數(shù)據(jù)表明，噻唑烷二酮類藥物作為PPARγ激動劑，可以通過加速血管內(nèi)皮再生，抑制血小板活性和減少血栓前因子的表達來減少動脈損傷后的血栓形成趨勢[22]。

炎癥與血栓的密切關(guān)系使得P選擇素這個在兩種生理病理過程中都有著重要作用的蛋白受到高度重視，已經(jīng)開發(fā)出抗P選擇素抗體用于血栓和(或)炎癥的治療，如重組可溶性P選擇素糖蛋白配體-1等。因此，抗P選擇素治療血栓將隨著P選擇素與血栓性疾病研究的深入和闡明，具有良好的臨床應(yīng)用價值和前景。

4 其他內(nèi)容物及其對血栓形成的影響

tPA具有高效的纖維蛋白溶解活性，當(dāng)血栓形成時，tPA激活纖溶酶活性，確保再通的及時性[23]。內(nèi)皮素-1是人類心血管系統(tǒng)中最有效的血管收縮劑，具有非常持久的作用[24]，其血漿水平可能有助于預(yù)測一般人群中充血性心力衰竭和死亡風(fēng)險[25]。WPBs分泌內(nèi)皮素-1導(dǎo)致的血管內(nèi)皮功能障礙促進了血栓的形成，高內(nèi)皮素-1水平的患者在接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后發(fā)生支架內(nèi)血栓形成的概率大大升高[25]。血管生成素-2是血管形成和維持的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可將血管炎癥從活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)化為靜止?fàn)顟B(tài)，從而恢復(fù)組織的穩(wěn)態(tài)[26]。研究發(fā)現(xiàn)血管生成素-2和P選擇素相互排斥，前者僅摻入缺乏P選擇素的WPBs中[1]。鑒于此種情況，我們不妨猜測通過干預(yù)包含血管生成素-2的WPBs的數(shù)量，以此減少含P選擇素的WPBs數(shù)量可抑制血栓形成，這也許能夠為廣大研究者們提供抗血栓藥物研究的新思路。

5 展望

隨著對WPBs的生物發(fā)生及其快速分泌機制研究的深入，WPBs快速分泌VWF和P選擇素等內(nèi)容物對血栓形成的影響越來越清晰。目前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞受激活化時，WPBs快速反應(yīng)釋放VWF和P選擇素等因子，這些因子通過與膠原、血小板糖蛋白GPIb/IX、中性粒細胞和白細胞等相互作用參與或促進血栓形成。在WPBs眾多內(nèi)容物中，對血栓影響最大的是VWF和P選擇素，兩者都直接參與血栓的形成，內(nèi)皮細胞P選擇素在一定程度上受VWF調(diào)控。以WPBs以及VWF等因子為靶點的抗血栓抗體或化合物如卡普塞珠單抗和3-羥基-1H-吡咯(5 H)-2-酮類似物等都具有良好的抗血栓效果。鑒于WPBs、VWF和P選擇素在血栓疾病中扮演著重要角色，深入研究WPBs快速分泌的調(diào)控機制，VWF和P選擇素參與血栓形成的作用機理，有望為血栓相關(guān)疾病的防治提供更多有效的新靶點，也將在今后的抗血栓藥物研發(fā)策略中帶來新的思考方式。