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    LC-MS/MS法測定人血漿中格列吡嗪濃度及其控釋制劑的生物等效性研究

    2020-04-01 10:33:54劉圓圓徐魯源賀美蓮
    藥學(xué)研究 2020年2期
    關(guān)鍵詞:格列吡嗪空腹

    劉圓圓,徐魯源,賀美蓮

    (1.北京大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科,北京 100034;2.國藥控股山東有限公司,山東 濟南 250001;3.山東省食品藥品檢驗研究院,山東 濟南 250101)

    格列吡嗪是常用的第二代磺酰脲類降糖藥,主要用于飲食控制效果不良的輕、中度2型糖尿病患者。其作用機制是刺激胰島的β細胞分泌胰島素,從而降低血糖水平。格列吡嗪與第一代磺酰脲類降糖藥相比,與劑量相關(guān)的副作用如頭痛,惡心,疲勞等有所減少[1-2]。格列吡嗪作為2型糖尿病治療的一線藥物,其控釋制劑的作用時間延長,具有良好的降低空腹與餐后血糖的效果[3-4]?,F(xiàn)有的測定生物基質(zhì)中格列吡嗪濃度的方法有高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[6-8]。其中LC-MS/MS法具有靈敏度高、快速、前處理簡便的優(yōu)勢,成為生物等效性研究的常用方法。故本研究在此基礎(chǔ)上,建立了測定人血漿中格列吡嗪濃度的LC-MS/MS方法,并采用單劑量、兩周期、兩序列、交叉的試驗設(shè)計,對24名健康受試者分別進行空腹及高脂餐后的生物等效性預(yù)試驗,考察其藥代動力學(xué)過程,以期為正式的生物等效性試驗提供數(shù)據(jù)參考。

    1 儀器與試藥

    高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB SCIEX Triple Quad 5500);格列吡嗪標準品(99.7%,批號:100281-201604,中檢院);格列吡嗪-d11(化學(xué)純度:98%,同位素內(nèi)標純度:97.6%,批號:7-SDJ-115-1,TRC)。甲醇、乙腈、甲酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(色譜純);超純水。受試制劑:格列吡嗪控釋片(5 mg/片),參比制劑:格列吡嗪控釋片(5 mg/片,Pfizer Pharmaceuticals LLC)。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件 Phenomenex Kinetex C18色譜柱 (2.1 mm×50 mm,2.6 μm),柱溫45 ℃,流動相A為0.1%甲酸水,流動相B為純乙腈,流速0.6 mL·min-1,梯度洗脫程序見表1。

    2.2 質(zhì)譜條件 電離方式:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子源溫度:550 ℃ ;檢測模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子化電壓:5 500 V ;入口電壓(EP):10 V;碰撞室出口電壓(CXP):29 V。監(jiān)測離子對:格列吡嗪:446.1/321.1,噴撞能量(CE):19 V,去簇電壓(DP):136 V ;格列吡嗪-d11:457.1/321.1,CE:21 V,DP:136 V。

    表1 梯度洗脫程序

    2.3 標準溶液的配制 準確稱取格列吡嗪標準品適量,用DMF溶解成質(zhì)量濃度為 1.0 mg·mL-1的對照品儲備液。準確移取適量對照品儲備液,用50%乙腈水溶液稀釋,配制成質(zhì)量濃度分別為40、80、400、1 000、2 000、3 000、5 000、6 000 ng·mL-1的標準曲線工作溶液和質(zhì)量濃度分別為40、120、800、4 000 ng·mL-1的質(zhì)控樣品工作溶液。準確稱取格列吡嗪-d11標準品適量,用DMF溶解成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的內(nèi)標儲備液,用乙腈將內(nèi)標儲備液稀釋至20 ng·mL-1,作為內(nèi)標工作溶液。

    2.4 樣品預(yù)處理 精密移取100 μL血漿樣品,加入400 μL內(nèi)標工作溶液(20 ng·mL-1格列吡嗪-d11)沉淀蛋白,然后渦旋混勻5 min,在4 ℃的臺式高速冷凍離心機中,4 750 rpm離心10 min ,取上清液100 μL,并加入10%乙腈水100 μL稀釋,渦旋混勻5 min,進樣測定。

    2.5 方法學(xué)驗證

    2.5.1 標準曲線與殘留 準確移取空白血漿285 μL, 加入 15 μL格列吡嗪標準曲線工作溶液,使樣品中格列吡嗪的質(zhì)量濃度分別為2、4、20、50、100、150、250、300 ng·mL-1。按“2.4”項下所述進行樣品處理,采用LC-MS/MS 方法測定,記錄色譜圖。以分析物的濃度為橫坐標(X),以分析物與內(nèi)標的色譜峰面積比值為縱坐標(Y),用加權(quán)(W=1/X2)最小二乘法進行線性回歸,得到的標準曲線為:Y=0.010 25X-0.001 72(r2=0.999 0,n=8),結(jié)果顯示格列吡嗪血藥濃度在2~300 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,定量下限為2 ng·mL-1。

    圖1中a為格列吡嗪在定量下限處的選擇離子色譜圖,保留時間為 0.36 min,峰形與分離度良好。在同樣的保留時間處,空白血漿樣品色譜圖(見圖1b)中沒有干擾峰出現(xiàn),顯示該方法的殘留很小,不會對分析物及內(nèi)標的定量造成干擾。

    2.5.2 準確度與精密度 質(zhì)控樣品的制備、處理及測定與標準曲線樣品相同,質(zhì)量濃度分別為2、6、40、200 ng·mL-1,表示為LLOQ、LQC、MQC和HQC。共測定3個分析批,每一濃度取6份樣品分析。結(jié)果顯示批內(nèi)準確度為 95.0%~106.5%,批間準確度為99.5%~102.2%,批內(nèi)精密度均小于7.0%,批間精密度均小于5.0% (見表 2)。試驗結(jié)果顯示該方法精密度,準確度良好。

    表2 準確度與精密度

    2.5.3 選擇性、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 選擇性需要考察6批不同來源的空白血漿,分別配制成空白樣品以及定量下限濃度的樣品進行比較。結(jié)果顯示6批空白血漿中干擾組分的響應(yīng)均為0,血漿的內(nèi)源性組分未造成干擾。由這6批空白血漿預(yù)處理后得到上清液加入適當(dāng)濃度的工作溶液配制成基質(zhì)效應(yīng)樣品,與相同濃度的純?nèi)芤簶悠愤M行比較,由二者的峰面積比值來計算,分析物的基質(zhì)因子為98.5%,內(nèi)標的基質(zhì)因子為96.5%。提取回收率考察LQC,MQC和HQC 3 個濃度的質(zhì)控樣品,然后再取空白血漿預(yù)處理后加入適當(dāng)濃度工作溶液配得同濃度的樣品,二者峰面積的比值即為提取回收率。結(jié)果表明,分析物的回收率為107.4%,內(nèi)標的回收率為113.4%。

    2.5.4 穩(wěn)定性 首先考察了對照品和內(nèi)標的儲備液和工作溶液在室溫放置12 h的穩(wěn)定性。然后,配制LQC和HQC樣品各 3 份,分別考察其在自動進樣器中的穩(wěn)定性、血漿樣品5次凍融循環(huán)的穩(wěn)定性以及室溫放置27 h的穩(wěn)定性。根據(jù)新鮮制備的標準曲線分析上述條件下的樣品,將測得濃度與理論濃度相比較,結(jié)果顯示準確度偏差均在15%范圍內(nèi),說明格列吡嗪在上述條件下均能保持良好的穩(wěn)定性。

    2.6 生物等效性研究 招募24名健康成年受試者,身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在19~26 kg·m-2。受試者在試驗前均通過既往史、體格檢查和實驗室檢查(包括血生化、血常規(guī)、尿常規(guī)、傳染性疾病篩查、心電圖、胸片及試驗相關(guān)各項檢查)。所有受試者均為自愿參加本次試驗,理解研究程序與風(fēng)險且已簽署知情同意書。

    本研究采用單中心、開放、隨機、單劑量、兩周期、兩序列、交叉的試驗設(shè)計,考察空腹和餐后兩種條件下(各12名受試者)的生物等效性。采用SAS9.4軟件將受試者隨機分為兩組,每組6人。空腹試驗中,保證受試者給藥前禁食不禁水至少10 h。第1周期6例受試者在給藥當(dāng)天早晨空腹狀態(tài)下口服受試制劑格列吡嗪控釋片5 mg,另6例受試者則口服參比制劑格列吡嗪控釋片5 mg,7 d的清洗期后交叉給藥進行第2周期研究。餐后試驗中,保證受試者給藥前禁食不禁水至少10 h,于次日晨進食高脂餐,30 min內(nèi)進食完畢,然后口服受試制劑或參比制劑。試驗分別于給藥前0 h和給藥后1、2、3、4、6、8、9、10、12、14、16、24、28、32、36、48 h共17個采血點分別抽取靜脈血4 mL,用于血藥濃度測定。

    使用WinNonlin 6.4軟件以非房室模型處理血藥濃度數(shù)據(jù)并估算藥動學(xué)參數(shù),包括:Cmax、AUC0~t、AUC0~∞、Tmax、t1/2等。主要藥動學(xué)參數(shù)(Cmax,AUC)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以多因素方差分析(ANOVA)進行顯著性檢驗,然后用雙向單側(cè)t檢驗和計算90%置信區(qū)間的統(tǒng)計分析方法來評價和判斷受試制劑和參比制劑之間的生物等效性??崭购筒秃髼l件下兩制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)見表3,平均藥時曲線見圖2。

    表3 受試制劑與參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)比較(n=12)

    空腹給藥試驗結(jié)果顯示,受試制劑Cmax、AUC0-t、AUC0~∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的91.82%~111.81%、83.98%~122.10%、85.73%~124.83%,均在80.00%~125.00%以內(nèi),說明格列吡嗪控釋片受試制劑與參比制劑在空腹給藥時具有生物等效性。餐后給藥試驗結(jié)果顯示,受試制劑Cmax、AUC0~t、AUC0~∞的90%置信區(qū)間分別為參比制劑相應(yīng)參數(shù)的82.03%~106.76%、81.43%~117.32%、83.35%~119.07%,均在80.00%~125.00%以內(nèi),說明格列吡嗪控釋片受試制劑與參比制劑在餐后給藥時也具有生物等效性。綜上所述,格列吡嗪這兩種片劑在空腹和餐后條件下均具有生物等效性。

    3 結(jié)論

    本文建立了快速、靈敏的LC-MS/MS方法用于測定人血漿中的格列吡嗪濃度,并將其應(yīng)用于人體生物等效性預(yù)試驗。在試驗過程中,受試者均未有臨床意義的藥物不良反應(yīng)出現(xiàn)。在空腹和餐后給藥條件下,受試制劑與參比制劑在吸收程度和代謝速度上無顯著性差異,生物學(xué)等效。同時,由表3和圖2可見,餐后給藥與空腹給藥相比,Cmax更大,而Tmax更小,說明高脂餐后給藥對格列吡嗪的吸收、分布有一定影響。該結(jié)果可為格列吡嗪的臨床合理用藥提供參考依據(jù)。另外,依據(jù)此次生物等效性預(yù)試驗的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該試驗方案的采樣時間、采樣量、時間間隔等設(shè)計較為合理,具有較強的適用性。本試驗為格列吡嗪控釋劑的生物等效性研究提供了數(shù)據(jù)參考,為正式試驗奠定了基礎(chǔ)。

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