年齡相關(guān)肝病中的肝臟細(xì)胞異質(zhì)性研究進(jìn)展

李清鈺，廖春雨，趙思羽，原玉柱，趙永睿，肖莉，孫麗新

1.中國藥科大學(xué)江蘇省藥效研究與評價(jià)服務(wù)中心，江蘇南京 211198；2.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313000

隨著機(jī)體的衰老，肝臟的生物結(jié)構(gòu)與功能不斷退化，年齡相關(guān)肝病發(fā)病率增加。研究發(fā)現(xiàn)年齡相關(guān)肝病患者體內(nèi)的多種肝臟細(xì)胞（肝細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞及庫普弗細(xì)胞）衰老表現(xiàn)形式不同，具體表現(xiàn)為蛋白質(zhì)和生物標(biāo)志物表達(dá)水平及細(xì)胞功能等方面的差異，即肝臟細(xì)胞異質(zhì)性，但其相關(guān)疾病的具體機(jī)制與聯(lián)系尚不清楚。本文就肝臟細(xì)胞衰老在相關(guān)疾病發(fā)生與發(fā)展中的作用進(jìn)行綜述，以期為延緩肝臟衰老及相關(guān)疾病治療提供新靶點(diǎn)和新思路。

1 年齡相關(guān)肝臟疾病

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為我國最常見的慢性肝病，年齡是NAFLD 進(jìn)展中密切相關(guān)的因素之一[1]。NAFLD包括單純性脂肪變性和非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及相關(guān)的肝纖維化和肝硬化[2]。一項(xiàng)研究對患有NAFLD/NASH的人群進(jìn)行肝臟活檢和廣泛的特征分析，結(jié)果表明NAFLD/NASH 患者體內(nèi)多種衰老肝臟細(xì)胞增加[3]。同樣的多項(xiàng)研究表明，在肝纖維化[4]、肝硬化[5]和肝細(xì)胞肝癌（hepatic cell carcinoma，HCC）[6]中，年齡均是高風(fēng)險(xiǎn)因素。此外，年齡也是酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）[7]、病毒性肝炎[8]等慢性肝病的影響因素之一。由此推測，肝臟細(xì)胞衰老可能在慢性肝病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2 相關(guān)疾病中的肝臟細(xì)胞異質(zhì)性

2.1 肝細(xì)胞

肝細(xì)胞是肝臟基本功能單位肝小葉中主要的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，也是肝臟功能的主要承擔(dān)者。衰老肝細(xì)胞發(fā)生形態(tài)、功能及表觀遺傳修飾等方面的變化。衰老肝臟中肝細(xì)胞數(shù)量減少，體積增加[9]。隨著年齡增長，NRF2 信號減退相關(guān)的氧化還原失衡會拮抗Wnt/β-catenin 信號通路，激活FoxO、p53 相關(guān)信號通路，從而削弱肝細(xì)胞增殖[10]。NASH 患者體內(nèi)可見球形肝細(xì)胞，說明肝細(xì)胞發(fā)生變性，即微管破裂和嚴(yán)重?fù)p傷，表明肝細(xì)胞損傷可能推動NASH 進(jìn)展[11]。

衰老肝細(xì)胞的衰老相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)增加，發(fā)生G1/S 期細(xì)胞周期阻滯。衰老肝細(xì)胞中細(xì)胞周期抑制因子p16Ink4a、p21 及p53 表達(dá)增加，衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶和異染色質(zhì)蛋白1β 表達(dá)增加，氧化應(yīng)激來源的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和脂滴積累，活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加[9]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可上調(diào)肝細(xì)胞中p16 和p21 水平，促進(jìn)Rb 蛋白活化[12]。NAFLD 小鼠的肝細(xì)胞中p16、p53、p21 及衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶的表達(dá)水平上調(diào)[13]。此外，NAFLD 患者的肝細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases 4，CDK4）水平升高，而CDK4 抗性C/EBPα-S193A 小鼠則不會隨著年齡的增長而發(fā)生肝脂肪變性，故抑制CDK4可能是慢性肝病治療新途徑[14]。因此，改善衰老肝細(xì)胞周期阻滯可能成為慢性肝病的潛在治療策略。

衰老肝細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）[15]。HBV 和丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）陽性肝硬化及HCC 患者的肝細(xì)胞中TNF-α 和IL-6 水平升高，且HBV 陽性HCC 患者的肝細(xì)胞過表達(dá)MMP-9 和低表達(dá)TIMP-1 和TIMP-3，從而獲得更高的侵襲潛力[12]。由此推測，衰老肝細(xì)胞的SASP 加重慢性肝病，而抑制SASP 成分分泌可能有助于緩解病情。

衰老肝細(xì)胞自噬功能下降，蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)喪失。氧化和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)及其聚集體的積累可引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)毒性，如脂褐素積累和ROS 產(chǎn)生增加，從而進(jìn)一步抑制自噬，形成惡性循環(huán)[16]。NAFLD 小鼠的肝細(xì)胞自噬水平下調(diào)，表現(xiàn)為LC3II/LC3I 比率降低、自噬底物p62 蛋白積累及線粒體自噬相關(guān)蛋白Fundc1 表達(dá)減少[13]。因此，維持肝細(xì)胞自噬水平可能有助于延緩NAFLD 進(jìn)展。

2.2 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（hepatic sinusoidal endothelial cell，LSEC）是肝臟中主要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，也是肝竇內(nèi)壁的組成單位。衰老LSEC 中細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）等介導(dǎo)偽毛細(xì)血管化的標(biāo)志物表達(dá)增加，小窩蛋白-1、參與調(diào)控肝細(xì)胞再生的無翅型MMTV 整合位點(diǎn)家族成員2（wingless-related MMTV integration site 2，Wnt2）及肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）表達(dá)減少[17]。衰老LSEC 發(fā)生偽毛細(xì)血管化，表現(xiàn)為窗孔變小、數(shù)量減少及內(nèi)皮增厚，這些變化與竇周基底層形成和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在竇周隙中的沉積增加有關(guān)。偽毛細(xì)血管化導(dǎo)致LSEC 內(nèi)吞減弱，大分子清除率降低，這可能與清道夫受體功能受損相關(guān)[17]。偽毛細(xì)血管化的LSEC可激活靜止的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[18]；說明衰老LSEC 偽毛細(xì)血管化是慢性肝病發(fā)展的關(guān)鍵步驟，維持LSEC 的正常表型和功能可抑制NASH向肝纖維化的發(fā)展。另外，在LSEC 中阻斷ICAM-1可抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的粘附與遷移，提示下調(diào)衰老LSEC 中ICAM-1 表達(dá)，抑制LSEC 偽毛細(xì)血管化，有助于延緩HCC 進(jìn)展[19]。

TNF-α、IL-1、IL-6 等SASP 成分在衰老LSEC中的表達(dá)相對增加[20]。與其他衰老肝臟細(xì)胞相比，p16INK4a主要在衰老LSEC 中表達(dá)[21]。年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激上調(diào)LSEC 中ROS 水平，且由于抗氧化酶血紅素加氧酶-1 的表達(dá)減少，衰老LSEC 更易受氧化應(yīng)激的損害[22]。

自噬對于LSEC 穩(wěn)態(tài)維持十分重要，而衰老相關(guān)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致LSEC 自噬失調(diào)，然而自噬失調(diào)也會削弱其處理氧化應(yīng)激的能力，從而加重肝纖維化，形成惡性循環(huán)[23]。NASH 患者體內(nèi)的LSEC 自噬失調(diào)上調(diào)趨化因子、細(xì)胞因子及黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝臟炎癥、內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及肝纖維化過程[24]。因此，維持LSEC 自噬水平可能有助于延緩肝纖維化進(jìn)展。

2.3 HSC

HSC 是位于Disse 間隙內(nèi)的周細(xì)胞。迄今為止，衰老對HSC 影響的相關(guān)研究較少，但HSC 激活與肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展的聯(lián)系一直是近年的研究熱點(diǎn)。正常情況下HSC 處于靜止?fàn)顟B(tài)，在肝損傷或衰老肝細(xì)胞誘導(dǎo)下被激活，活化的HSC 釋放富含纖維蛋白的納米級囊泡，這是肝纖維化與肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵啟動過程[13]?；罨腍SC 高表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白和結(jié)蛋白，并分泌過量的ECM 成分，如膠原蛋白和纖連蛋白，導(dǎo)致ECM 過度沉積，進(jìn)而驅(qū)動肝纖維化進(jìn)展[25]。衰老肝細(xì)胞中SIRT1 的年齡依賴性下降激活NLRP3 炎癥小體炎癥通路，進(jìn)而驅(qū)動HSC 活化，導(dǎo)致老年ALD 小鼠的嚴(yán)重肝纖維化[26]。而衰老的HSC 分泌MMP，消化基質(zhì)金屬蛋白和膠原蛋白，從而減少ECM 沉積，以限制與逆轉(zhuǎn)肝纖維化[25]。因此，誘導(dǎo)HSC 衰老可能是抑制肝纖維化發(fā)生與發(fā)展的有益機(jī)制。但是，衰老HSC 還表達(dá)SASP 相關(guān)成分，其似乎在NAFLD 進(jìn)展為HCC 的過程中起關(guān)鍵作用[27]。

衰老HSC 自噬水平下調(diào)。而自噬可抑制活化HSC 釋放纖維化細(xì)胞外囊泡，進(jìn)而減輕肝纖維化[25]，故上調(diào)HSC 自噬水平可能是肝纖維化治療策略。

2.4 庫普弗細(xì)胞

庫普弗細(xì)胞位于肝竇腔內(nèi)，是肝臟常駐巨噬細(xì)胞中最具代表性的免疫細(xì)胞，參與感染和大分子吞噬的先天免疫反應(yīng)。盡管庫普弗細(xì)胞激活常見于肝脂肪變性、NASH 及肝纖維化等大多數(shù)慢性肝病，但與HSC 類似，衰老對庫普弗細(xì)胞影響的研究并不多[28]。衰老對巨噬細(xì)胞的影響包括數(shù)量增加，在含有T、B 細(xì)胞的大淋巴結(jié)構(gòu)中分布增加，吞噬、自噬作用減弱，并呈現(xiàn)促炎狀態(tài)[29-30]；細(xì)胞因子分泌增加，如IL-6，但TNF-α、Mrc1、Arg1 及IL-10 的表達(dá)在衰老庫普弗細(xì)胞中未發(fā)生變化[20]。

3 衰老肝臟細(xì)胞作為疾病治療靶點(diǎn)

3.1 靶向消除衰老肝臟細(xì)胞

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）-T細(xì)胞通過靶向消除表面高表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活物受體的衰老肝臟細(xì)胞，可改善CCl4 誘導(dǎo)或NASH 模型小鼠的肝纖維化和肝功能，表明Senolytic CAR-T 細(xì)胞對不同病因的肝纖維化均具有治療作用[31]。BET 家族蛋白質(zhì)降解劑通過減少非同源末端連接加劇DNA 雙鏈斷裂，并上調(diào)自噬基因表達(dá)，消除肥胖小鼠肝臟中衰老HSC，從而抑制HCC的發(fā)展[27]。但在WT 小鼠經(jīng)達(dá)沙替尼+槲皮素給藥被清除衰老HSC 后，顯示出更多的纖維結(jié)締組織增生，表明衰老HSC 的清除將加重肝纖維化；與之相反，誘導(dǎo)活化HSC 衰老則有益于肝纖維化消退[25,32]。由此可知，活化HSC 在不同慢性肝病中所發(fā)揮的作用不同，對其進(jìn)行深入探究將有助于對不同慢性肝病患者進(jìn)行針對性治療。另外，衰老LSEC在體內(nèi)仍然執(zhí)行包括抗炎、內(nèi)吞、分泌促肝細(xì)胞再生因子及維持HSC 表型等重要功能。通過基因工程手段靶向清除高表達(dá)p16INK4a的衰老LSEC 后，由于沒有新的LSEC 來填補(bǔ)空缺，反而誘發(fā)了肝臟纖維化的發(fā)生[33]。因此，并非所有衰老肝臟細(xì)胞的清除均有利，衰老肝臟細(xì)胞清除治療的靶向性顯得尤為重要。

3.2 延緩肝臟細(xì)胞衰老

可溶性環(huán)氧化物水解酶/環(huán)氧合酶-2 雙重抑制劑PTUPB 可通過SIRT1 抑制PI3K/AKT/mTOR 通路增強(qiáng)肝細(xì)胞自噬，進(jìn)而延緩肝細(xì)胞衰老，從而減輕NAFLD；且PTUPB 對肝細(xì)胞衰老的延緩作用可進(jìn)一步抑制HSC 活化，從而發(fā)揮肝纖維化治療作用[13]。白藜蘆醇激活SIRT1 或過表達(dá)SIRT1 和過表達(dá)胰島素樣生長因子1 可促進(jìn)p53 去乙?；?，抑制核p53與早老素相互作用；進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激引發(fā)的肝細(xì)胞過早衰老，維持LSEC 開窗，從而改善肝脂肪變性與纖維化[34]。然而，p53 作為DNA 損傷的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，其被抑制可能會增加細(xì)胞癌變與腫瘤發(fā)生的概率，故針對p53 進(jìn)行治療的強(qiáng)度和時(shí)間需要精準(zhǔn)把控[35]。另外，單細(xì)胞RNA 測序（scRNA-seq）和單細(xì)胞核RNA 測序（snRNA-seq）分析表明，熱量限制通過調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞的ATG基因表達(dá)可激活自噬以抑制肝臟細(xì)胞衰老，故熱量限制可能為未來年齡相關(guān)肝病治療新途徑[36]。

3.3 抑制衰老肝臟細(xì)胞SASP

甘露聚糖結(jié)合凝集素可直接與HSC 細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 相關(guān)的鈣網(wǎng)蛋白相互作用，通過上調(diào)哺乳動物的雷帕霉素/p53/p21 信號通路誘導(dǎo)活化HSC 衰老，使其增殖減弱、ECM 和SASP成分合成與分泌減少，從而促進(jìn)肝纖維化消退[32]。然而，盡管誘導(dǎo)HSC 衰老對于減輕肝纖維化有益，但誘導(dǎo)活化的HSC 永久衰老可能會阻礙對于維持肝臟結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要的傷口愈合反應(yīng)和ECM 維持，故誘導(dǎo)HSC 衰老進(jìn)行肝纖維化治療的強(qiáng)度和時(shí)間是需要考慮的重要問題[37]。CO 依賴性SIRT1 激活促進(jìn)三四脯氨酸包含在應(yīng)激顆粒中，進(jìn)而下調(diào)肝細(xì)胞中SASP 成分纖溶酶原激活物抑制劑-1 水平，從而減輕肝細(xì)胞衰老與NAFLD[38]。但SASP 種類繁多，且衰老肝臟細(xì)胞并未被清除仍可繼續(xù)分泌SASP 成分，故此治療策略僅可改善癥狀，需與前兩種治療策略相結(jié)合以期達(dá)到協(xié)同治療效果。

4 總結(jié)與展望

在與年齡相關(guān)肝臟疾病中，肝臟細(xì)胞表現(xiàn)出異質(zhì)性，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和LSEC 具有衰老特征，而HSC和庫普弗細(xì)胞雖然數(shù)量增加且被激活，但并未發(fā)生較多的衰老相關(guān)變化。肝臟細(xì)胞衰老是一把“雙刃劍”，適度的細(xì)胞衰老有益于肝臟結(jié)構(gòu)與功能的維持，并可抑制肝臟細(xì)胞癌變與腫瘤的發(fā)生，但衰老肝臟細(xì)胞的積累則可能是慢性肝病發(fā)生與發(fā)展的驅(qū)動力。此外，近年來scRNA-seq/snRNA-seq 成為高通量組學(xué)技術(shù)的熱點(diǎn)，其可從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)多角度更準(zhǔn)確地檢測衰老細(xì)胞中多種衰老標(biāo)志物的組合，這有益于衰老細(xì)胞異質(zhì)性的深入研究與疾病個(gè)性化治療。

綜上，肝臟細(xì)胞衰老與年齡相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系密切，靶向消除衰老肝細(xì)胞、延緩肝臟細(xì)胞的衰老及抑制衰老肝臟細(xì)胞SASP 等治療策略的使用可有效延緩年齡相關(guān)肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程；但其之間復(fù)雜的機(jī)制與關(guān)系仍亟待闡明，以肝臟細(xì)胞衰老為靶點(diǎn)進(jìn)行深入探究或成為慢性肝病治療的新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。